黃國梁 宗和坤 左昆明 韓興昊

（西藏農(nóng)牧學(xué)院公共教學(xué)部，西藏 林芝 860000）

高原蕁麻，為高寒地帶植物，耐寒、耐瘠，抗逆性強，一般生長在海拔4200～5000m，但也有部分分布在2000m左右，多產(chǎn)于西藏雅魯藏布江沿岸，四川、新疆、青海等地也有分布。其為一年生、多年生野本植物，自然生長在草叢和原始森林中。高原蕁麻生長條件較為苛刻，低海拔植株生長較為分散［1］?，F(xiàn)代藥理學(xué)表明該植物含有黃酮類、木質(zhì)素類、香豆素類等有效成分，具有很好的抗炎止痛、皮膚瘙癢、抗風(fēng)濕等藥理活性。蕁麻在世界上廣泛分布，與艾麻屬（Laportea Gandich）有相似親緣關(guān)系［2］，是我國常用的民間用藥［3，4］，其含有豐富的脂肪、蛋白質(zhì)、維生素C 等營養(yǎng)物質(zhì)，并且在多個少數(shù)民族中作為豬飼料廣泛使用［5］，裂葉蕁麻中的汞、鉛含量均未超過蔬菜的衛(wèi)生限量標準，屬于可食安全范圍［6］，可列入保健食品資源之一［7］。國內(nèi)外對蕁麻屬植物化學(xué)成分進行了大量的研究，結(jié)果表明該植物含有黃酮類、甾類、香豆素、木脂素、有機酸等成分［8-10］，具有抑制良性前列腺增生、抗風(fēng)濕、降血糖、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗菌、抗氧化等藥理活性［11-13］，臨床主要用于良性前列腺增生、風(fēng)濕、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等疾病的治療，療效顯著［14-16］。迄今為止有關(guān)高原蕁麻中總黃酮含量的提取報道較少［17，18］。文章以高原蕁麻為原料，蘆丁含量為指標通過單因素及正交實驗選擇高原蕁麻中總黃酮提取工藝，為研發(fā)藥物等提供參考。

1 材料和藥品

1.1 材料

高原蕁麻（由西藏林芝市特產(chǎn)店提供）、四川蕁麻，洗凈后擦干，置于105℃下殺青，之后置于70℃下干燥，粉碎備用。

1.2 儀器

島津LC-20A 高效液相儀、島津UV-2700 紫外分光光度計、水浴恒溫鍋、恒溫烘箱、優(yōu)普超純水機、分析天平。

1.3 試劑

蘆丁標準品、硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、乙醇、等均為AR分析純，甲醇（色譜純），實驗用水均為用去離子水。

2 實驗部分

2.1 蘆丁顯色劑的選用

結(jié)果表明當采用5%亞硝酸鈉、10%硝酸鋁、4%氫氧化鈉做顯色劑使用時顯色效果最佳，但由于顯色穩(wěn)定性較差，固應(yīng)現(xiàn)配現(xiàn)用［19］。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取105℃干燥至恒重的蘆丁試劑標準品10mg，加入70%乙醇溶解，定容至100mL容量瓶中，搖勻，稱作標樣0，備用。

2.3 最大吸收峰的測定

吸取2.2 中的對照溶液0.00mL、2.5mL 置于10mL具塞量筒，加入70%乙醇溶液至5mL，之后加入5%亞硝酸鈉0.3mL，放置6min 再加入10% 硝酸鋁溶液0.3mL，搖勻，放置6min，之后加入4%氫氧化鈉4mL，之后用水稀釋至10mL，放置15～20min 顯色。之后以0.00mL 為空白，利用紫外分光光度計測量400～800nm的吸收曲線，確定當波長為415nm 時有最大吸收峰，固選用415nm處測定蘆丁標準曲線。

2.4 蘆丁標準曲線的測定

用移液槍吸取2.2 中的待測液，各加70%乙醇至5mL，轉(zhuǎn)移至10mL 容量瓶并編號，之后加入5%亞硝酸鈉溶液0.3mL，搖勻，放置6min，再加入10%硝酸鋁溶液0.3mL，搖勻，放置6min，加4%氫氧化鈉4mL，再用水稀釋至10mL，放置15～20min。待顯色完畢后，吸取1.5mL 待測液過0.45μm 微孔濾膜后，進行液相分析，得到線性回歸方程y=584.27x+1742.8，R2=0.9990，如圖1。

圖1 蘆丁標準曲線

2.5 色譜條件

流動相為甲醇－0.4%磷酸水溶液（55∶45）；柱溫25℃；檢測波長415 nm；流速1.0mL/min；進樣量20 μL。

2.6 提取工藝優(yōu)化

2.6.1 料液比對提取的影響。稱取蕁麻粉末1.00g 五份，放置在圓底燒瓶中，分別加入70%的乙醇5mL、10mL、15mL、20mL、25mL，在65℃連續(xù)回流2h，之后放冷、抽濾之后，回收乙醇，得到不同料液比下的濃縮液，將濃縮液用石油醚脫脂3～5 次，回收石油醚并用多倍量的無水乙醇沉淀多糖及蛋白質(zhì)成分，過濾后將濃縮液蒸發(fā)到10mL 時，轉(zhuǎn)移進100mL 容量瓶中，再用70%乙醇定容，得到樣品吸取0.2mL 待測液轉(zhuǎn)移至10mL 容量瓶中，按2.4 中的方法和2.5 中的色譜條件進入液相測定，結(jié)果如表1。

表1 料液比對提取的影響

2.6.2 乙醇濃度對提取的影響。稱取蕁麻粉末1.00g五份，放置于圓底燒瓶中，分別加入60%、65%、70%、75%、80%的乙醇10mL 在65℃連續(xù)回流2h，之后放冷、抽濾之后，回收乙醇，得到不同料液比下的濃縮液，將濃縮液用石油醚脫脂3～5 次，回收石油醚并用多倍量的無水乙醇沉淀多糖及蛋白質(zhì)成分，過濾后將濃縮液蒸發(fā)到4～7mL 時，轉(zhuǎn)移進100mL 容量瓶中，再用70%乙醇定容，得到樣品吸取0.2mL 待測液轉(zhuǎn)移至10mL 容量瓶中，按2.4 中的方法和2.5 中的色譜條件進入液相測定,結(jié)果如表2。

2.6.3 提取溫度對提取的影響。稱取蕁麻粉末1.00g五份，放置在圓底燒瓶中，分別加入70%的乙醇15mL，在45℃、50℃、55℃、60℃、65℃連續(xù)回流2h，之后放冷、抽濾之后，回收乙醇，得到不同料液比下的濃縮液，將濃縮液用石油醚脫脂3～5次，回收石油醚并用多倍量的無水乙醇沉淀多糖及蛋白質(zhì)成分，過濾后將濃縮液蒸發(fā)到4～7mL時，轉(zhuǎn)移進100mL容量瓶中，再用70%乙醇定容，得到樣品吸取0.2mL待測液轉(zhuǎn)移至10mL容量瓶中，按2.4中的方法和2.5中的色譜條件進入液相測定，結(jié)果如表3。

表3 提取溫度對提取的影響

2.6.4 提取時間對提取的影響。稱取蕁麻粉末1.00g五份，放置于圓底燒瓶中，分別加入70%乙醇10mL，在65℃水浴中分別加熱回流1h、1.5h、2h、2.5h、3h 之后放冷、抽濾之后，回收乙醇，得到不同料液比下的濃縮液，將濃縮液用石油醚脫脂3～5 次，回收石油醚并用多倍量的無水乙醇沉淀多糖及蛋白質(zhì)成分，過濾后將濃縮液蒸發(fā)到4～7mL 時，轉(zhuǎn)移進100mL 容量瓶中，再用70%乙醇定容，得到樣品吸取0.2mL 待測液轉(zhuǎn)移至10mL 容量瓶中，按2.4 中的方法和2.5 中的色譜條件進入液相測定，結(jié)果如表4。

表4 提取時間對提取的影響

2.6.5 正交實驗的設(shè)計。在單因素實驗基礎(chǔ)上，設(shè)計因素水平表，見表5，選擇料液比、乙醇濃度、提取時間作為考察因素，每個因素選取3個水平，以蘆丁含量為指標選取最佳工藝。

表5 正交實驗設(shè)計

2.6.6 正交實驗結(jié)果。高原蕁麻中蘆丁含量提取工藝優(yōu)化3 因素4 水平正交實驗結(jié)果與分析，見表6，由此可知最佳提取工藝是A2B3C2D2即當液料比為1：50，乙醇濃度為70%，浸提時間為2h。

表6 正交實驗結(jié)果分析

3 高原蕁麻及四川蕁麻中黃酮含量的對比

3.1 UV法分析兩種蕁麻黃酮含量

3.1.1 紫外標準曲線的測定。準確吸取2.2 中的制備液0.00mL、1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL 分別置于10mL 量筒中，各加30%乙醇至5mL，轉(zhuǎn)移至10mL容量瓶并編號，之后加入5%亞硝酸鈉溶液0.3mL，搖勻，放置6min，再加入10%硝酸鋁溶液0.3mL，搖勻，放置6min，加4%氫氧化鈉4mL，再用水稀釋至10mL，放置15～20min。待顯色完畢后，以0.00mL 為空白，測定其吸光度，如圖2，得到線性回歸方程y=10.5x -0.487,R2＝0.9950。

圖2 吸光度的線性回歸方程

3.1.2 紫外儀器精密度測定。取對照液1 份，在儀器參數(shù)中設(shè)置測定次數(shù)為5次，每次測量間隔為2s（空白不更改），重復(fù)測試后吸光度RSD為0.1%.

3.1.3 兩種蕁麻黃酮含量的對比。分別取1 號、2 號、3 號樣品，平行稱取3 次，按照2.6 方法進行提取、定容后，取1mL 待測液按照2.4 中的方法定容之后進入儀器測定其吸光度，每份樣品平均測定3 次，取平均值，帶入3.1.1中線性回歸方程計算總黃酮量，結(jié)果為紫外分光光度計所測定的含量見表7。

表7 紫外分光光度法測定樣品總黃酮含量的測定結(jié)果

3.2 HPLC法分析兩種蕁麻黃酮含量

采用相同方法處理溶液100μL，用70%乙醇定容至10mL 容量瓶，過0.45μm濾膜，上機測定，測量峰值帶入2.4中線性回歸方程計算濃度，HPLC所測定含量見表8。

表8 HPLC法測定樣品總黃酮含量的測定結(jié)果

4 結(jié)果與討論

本研究通過單因素及正交試驗優(yōu)化高原蕁麻中總黃酮的提取工藝，當料液比1∶50，乙醇濃度為70%，浸提溫度為60℃，浸提時間為2h 時，為最優(yōu)提取工藝。通過對兩種蕁麻總黃酮含量的測定，結(jié)果顯示：紫外分光光度法測定高原蕁麻中總黃酮含量為3.39mg/g 相較于四川蕁麻2.89mg/g 要高出17.30%.高效液相法測定高原蕁麻中總黃酮含量為3.19mg/g相較于四川蕁麻2.84mg/g要高出12.32%.

HPLC 測定高原蕁麻結(jié)果相較紫外測定結(jié)果普遍偏低，這是由于顯色劑使用堿性鋁離子，其顯色能力隨時間推移得到減弱，顯色效果在30～90min 內(nèi)最為合適，由于液相測定所需一定時間分離后才能通過uv檢測器顯示色譜圖，故測定結(jié)果較紫外結(jié)果偏低且穩(wěn)定性較差，故若使用堿性硝酸鋁作為蘆丁顯色劑時，在條件允許下，應(yīng)選用紫外分光光度計測定其總黃酮含量，結(jié)果較為準確。若要使用液相色譜進行測定，應(yīng)波長改為360nm［7］處增強穩(wěn)定性。

蘆丁為黃酮類化合物，具有廣泛的藥理活性和較低的毒性，是天然藥物研究的熱點之一。若蘆丁不加顯色劑，吸收峰在360nm［7］左右，若蘆丁在弱堿性條件下與Al3+發(fā)生顯色反應(yīng)，則會紅移至415nm 處，這與其他文獻中510nm［19，20］波長不符，推測顯色終點可能與溫度有一定關(guān)系。

考慮到高原地區(qū)光照時間長，蕁麻植株受光照面積相較于低海拔地區(qū)更為充足，這也許是其黃酮含量相較于低海拔地區(qū)蕁麻中黃酮含量高的因素之一。