龔莉焰，李雙陽，白雪

1.西南醫(yī)科大學(xué) 中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院（瀘州646000）；2.西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科（瀘州 646000）

帕金森?。╬arkinson's disease，PD）是一種好發(fā)于50 歲以上的中老年人、以運動障礙為主要表現(xiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)退變性疾病。PD 的發(fā)病機制主要認(rèn)為與線粒體功能障礙、氧化應(yīng)激、毒性蛋白質(zhì)聚集等反應(yīng)引起黑質(zhì)、紋狀體等部位的多巴胺能神經(jīng)元變性死亡有關(guān)[1]。抗帕金森病首選藥物治療，作為金標(biāo)準(zhǔn)的左旋多巴是最有效的對癥治療藥物[2-3]，但長期用藥后大部分病人會出現(xiàn)癥狀波動及異動癥為主的運動并發(fā)癥[4]，未來我國PD 患病人數(shù)將占到全球PD 患病人數(shù)的一半[2]。因此，有效防治帕金森病，減少并發(fā)癥至關(guān)重要。

《本草求真》言：“桑寄生，號為補腎補血要劑”，其味苦、甘，平，歸肝、腎經(jīng)，有補肝腎，強筋骨等功用[5]，以桑寄生為主的方劑常用于改善帕金森病引起的睡眠障礙、肢體震顫、腰膝酸軟等癥狀。滋腎平顫湯（桑寄生、莪術(shù)、白芍等）聯(lián)合左旋多巴組較單純使用左旋多巴組不僅更有效地改善了帕金森病病人的動作遲緩、顫振等運動癥狀，提高病人日常生活能力與運動功能，而且在緩解睡眠障礙等非運動癥狀的同時并未增加不良反應(yīng)[6-7]。楊戈等[8]也通過對MPTP誘導(dǎo)的PD模型小鼠的行為學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)加味天麻鉤藤飲組可改善PD模型小鼠的運動遲緩、步態(tài)異常及少動癥狀。此外，桑寄生中主要成分也被證實在抗PD 方面發(fā)揮了重要作用。槲皮苷[9]可顯著改善神經(jīng)毒性物質(zhì)所致的神經(jīng)損傷，江苪等[10]發(fā)現(xiàn)槲皮苷可以通過抑制細(xì)胞凋亡線粒體途徑中相關(guān)蛋白Cytc和caspase-3的表達(dá)以保護H2O2誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞損傷，劉菡等[11]通過實驗證明槲皮苷可通過激活PI3K/Akt/FoxO3a 信號通路，顯著降低6-OHDA 處理后PC12 細(xì)胞中Caspase-3 和Bcl-2 的表達(dá)、升高Bax的表達(dá)，提高神經(jīng)細(xì)胞活性、降低細(xì)胞凋亡水平，從而發(fā)揮抗PD作用。槲皮素可從多條途徑在PD等神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病中發(fā)揮神經(jīng)保護作用，如抗氧化應(yīng)激、保護線粒體、抑制谷氨酸的興奮性神經(jīng)毒性作用等[12]。齊墩果酸[13]也能發(fā)揮抗抑郁、抗神經(jīng)毒性、改善學(xué)習(xí)記憶等多方面改善PD運動和（或）抑郁、認(rèn)知障礙等非運動癥狀[14]。由此可見，桑寄生在PD的治療中發(fā)揮了重要作用，但由于中藥具有“多成分、多靶點、多通路”的特點，具體的作用機制尚不明確。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，對桑寄生治療PD 的主要活性成分、重要靶點及相關(guān)生物學(xué)過程和信號通路進(jìn)行有效預(yù)測和推斷，為后續(xù)研究PD治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 桑寄生主要活性成分和靶點的收集、轉(zhuǎn)換

通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺（Tradi?tional Chinese Medicine Systems Pharmacology，TCMSP），以口服生物利用度（oral bioavail ability，OB）≥30%和類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18 作為篩選條件，篩選桑寄生主要活性成分。同時根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)檢索查找桑寄生治療帕金森病可能活性成分[15-16]，并利用Swiss ADME 進(jìn)行篩查（篩查條件：GI absorption：HIGH，drug?likeness 中至少2 個YES）。匯總所有活性成分，通過SwissTargetPrediction（http://www.swisstarget-prediction.ch/）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行靶點預(yù)測（篩選標(biāo)準(zhǔn)：同時滿足3D相似性閾值設(shè)置為0.75、2D相似性閾值設(shè)置為0.45及Prob?ability>0），并利用UniProt 數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/）進(jìn)行基因轉(zhuǎn)換。

1.2 帕金森病靶點獲取

以“Parkinson Disease”或“Parkinson's disease”為關(guān)鍵詞在Disgenet 數(shù)據(jù)庫（https://www.disgenet.org/）中檢索帕金森病相關(guān)靶點，將所得疾病靶點匯總?cè)ブ兀ㄗⅲ篸isgenet 數(shù)據(jù)庫中Score_gda 的值越高，代表該靶點與PD 聯(lián)系越密切，本研究篩選標(biāo)準(zhǔn)為Score_gda ≥0.2；genecards數(shù)據(jù)庫中按照revwlance score由大至小排列，選取前120條）。

1.3 “活性成分－關(guān)鍵靶點”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

應(yīng)用韋恩圖Venny2.1.0（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/），分別將篩選所得藥物、疾病相關(guān)靶點輸入到List1和List2下面的欄目中，獲取藥物－疾病韋恩圖及交集靶點。

1.4 交集靶點蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

將交集靶點導(dǎo)入STRING11.0 數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/）構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，設(shè)置條件如下：蛋白質(zhì)種類設(shè)置為“homo sapiens（人類）”，作用閾值設(shè)置為“medium confidence（0.400）”，其他條件維持設(shè)置默認(rèn)。根據(jù)PPI 網(wǎng)絡(luò)中靶點的Degree 值作為依據(jù)篩選核心靶點，并通過Cytoscape3.9.0 軟件進(jìn)行相應(yīng)分析并獲得蛋白互作關(guān)系網(wǎng)絡(luò)。

1.5 GO分析和KEGG通路分析

利用CytoScape 中Metascape 組件對交集靶點進(jìn)行GO富集分析和KEGG代謝通路富集分析，同時采用線上繪圖工具微生信（http://www.bioinformatics.com.cn/）將富集結(jié)果可視化，并通過Cytoscape3.9.0 軟件繪制“疾病－藥物－成分－交集靶點－KEGG 通路”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.6 分子對接

將主要化合物與PPI 網(wǎng)絡(luò)中Drgree 值前三的交集靶點分別進(jìn)行分子對接。從PubChem數(shù)據(jù)庫中獲取主要活性成分3D 結(jié)構(gòu)，通過OpenBabel 2.4.1 軟件轉(zhuǎn)化成mol2 結(jié)構(gòu)。同時從PDB（http://www1.rcsb.org/）數(shù)據(jù)庫中獲取適合化合物的蛋白晶體結(jié)構(gòu)的3D 分子結(jié)構(gòu)。將上述結(jié)構(gòu)通過Auto Dock Tools 1.5.6 軟件及Auto Dock Vina 軟件進(jìn)行分子對接。一般認(rèn)為，結(jié)合能小于-5 kcal/mol，化合物分子與受體結(jié)合能越低，二者結(jié)合能力及發(fā)生作用的可能性越大，對接結(jié)果更加可靠。

2 結(jié)果

2.1 桑寄生主要活性成分及其成分靶點

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選（篩選條件：OB ≥30%，DL≥0.18）得到2個化合物，即表1中1-2。通過文獻(xiàn)檢索及SwissADME 篩查得到桑寄生2 個化合物，即表1 中3-4。通過TCMSP、SwissTargetPrediction 等數(shù)據(jù)庫處理后，最終篩選得到268個靶點，見圖1。

表1 桑寄生主要活性成分表Table 1 Main active components of parasitic loranthus

圖1 藥物－活性成分－靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)圖Figure 1 Network diagram of drug-activity-target interaction

2.2 帕金森病相關(guān)靶點及桑寄生治療帕金森病關(guān)鍵靶點

經(jīng)篩選去重，最終選取223 個疾病靶點。桑寄生與PD靶點上傳至Venny2.1.0后獲得27個交集靶點（見圖2），分別為：MAPT、APP、SLC6A3、TNF、IL6、TP53、SOD1、IL1B、ADH1C、PON1、NOS3、IFNG、MPO、TTR、MAOB、DRD2、DRD1、IGF1R、MAOA、HMOX1、GSTM1、ABCB1、NOS1、GSTP1、NQO1、INSR、GSK3B。

圖2 疾病、藥物交集靶點Venny圖Figure 2 Venny diagram of intersection targets of diseases and drugs

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

將27個關(guān)鍵靶點輸入String（https://string-db.org/）中查詢它們之間的相互作用關(guān)系，構(gòu)建PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖（見表2、圖3）。

圖3 桑寄生抗帕金森蛋白靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)圖Figure 3 Network diagram of anti-Parkinson's protein target interaction of mulberry parasite

表2 藥物、疾病交集靶點Table 2 Intersection targets of drugs and diseases

2.4 富集分析結(jié)果

為了闡明桑寄生治療帕金森病的作用機制，我們對交集靶點進(jìn)行GO及KEGG富集分析。GO富集分析中（P＜0.05）生物過程（biological process，BP）、細(xì)胞組分（cell components，CC）、分子功能（molecular function，MF）的條目各637 條、40 條及31 條（見圖4），KEGG 富集分析得到82條（見表3、圖5）

表3 排序前20的KEGG富集條目信息Table 3 Information of KEGG enrichment items in top 20

圖4 GO三合一富集柱狀圖Figure 4 Histogram of GO enrichment in three phases

圖5 KEGG通路分析中排名前20的通路圖Figure 5 Top 20 pathways in KEGG pathway analysis

2.5 “疾?。幬铮钚猿煞郑P(guān)鍵靶點－KEGG 通路”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將桑寄生的2個活性成分、桑寄生－PD的20個交集靶點、KEGG 通路匯總建立表格后導(dǎo)入Cyto?scape3.9.0 軟件中構(gòu)建桑寄生抗PD 的“疾?。幬铮钚猿煞郑患悬c－KEGG通路”網(wǎng)絡(luò)圖（見圖6）。

圖6 “帕金森?。＜纳钚猿煞郑患悬c－KEGG通路”網(wǎng)絡(luò)圖Figure 6 Network diagram of"Parkinson's disease-Mulberry parasite-active component-intersection target-KEGG pathway"

2.6 分子對接結(jié)果

經(jīng)篩選，degree值前三的交集靶點是TNF（PDB ID:2AZ5）、IL6（PDB ID:1ALU）與TP53（PDB ID:4KVP）。分別將4種活性成分與上述靶點進(jìn)行VINA分子對接，可以發(fā)現(xiàn)，除甲基丁香酚與IL6、4KVP 結(jié)合能大于-5 kcal/mol外，其余結(jié)合能均遠(yuǎn)小于-5 kcal/mol，能夠形成較為穩(wěn)定的構(gòu)象結(jié)構(gòu)。分子對接結(jié)果見表4。

表4 分子對接結(jié)果Table 4 Molecular docking results

3 討論

帕金森?。≒arkinson's disease）可歸屬于祖國醫(yī)學(xué)“顫證”“顫振”“振掉”“震顫”等范疇。病人常因“年老體衰、情志失調(diào)、飲食不節(jié)、勞逸過度”等病因?qū)е職庋幘澨摚L(fēng)火痰瘀互結(jié)，肝風(fēng)內(nèi)動，筋脈失養(yǎng)。病位在經(jīng)脈，與肝、脾、腎關(guān)系密切?？倢俦咎摌?biāo)實，以肝腎虧虛、風(fēng)陽內(nèi)動證最為常見，故治療尤以補益肝腎、息風(fēng)通絡(luò)為主[4，17-18]。而桑寄生具有補肝腎、強筋骨功用，被廣泛應(yīng)用于帕金森病的中醫(yī)治療中。

PD 以黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元變性壞死為主要病理變化，但具體機制尚不明確。除環(huán)境、遺傳、神經(jīng)系統(tǒng)老化等因素外，更多認(rèn)為PD 是在多因素交互作用下，通過氧化應(yīng)激、線粒功能紊亂、神經(jīng)炎性或免疫反應(yīng)、鈣穩(wěn)態(tài)失衡、興奮性毒性、細(xì)胞凋亡等機制導(dǎo)致黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元大量變性、丟失，最終發(fā)病。而本文通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究，也證實了桑寄生主要通過影響炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡等途徑發(fā)揮抗PD的作用。

經(jīng)篩選，共獲取桑寄生4種抗PD的主要活性成分，包括槲皮素、豆甾醇、藏花醛及甲基丁香酚。機體活性氧（ROS）產(chǎn)生、清除速率失衡，導(dǎo)致線粒體功能障礙、氧化性DNA損傷、神經(jīng)炎癥等一系列氧化應(yīng)激反應(yīng)[19]，槲皮素具有調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡[20]、抗炎、抗氧化應(yīng)激等多種生物作用[21]，可通過活化抗氧化信號通路和抑制LRRK2 激酶活性，調(diào)節(jié)具有炎癥介質(zhì)調(diào)控作用的MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，降低LRRK2突變在PD轉(zhuǎn)基因模型果蠅的神經(jīng)毒性，保護腦內(nèi)多巴胺能神經(jīng)元[22]。小膠質(zhì)細(xì)胞作為大腦中重要的免疫細(xì)胞，其過度的激活或持續(xù)的炎性反應(yīng)會產(chǎn)生神經(jīng)毒性作用，導(dǎo)致神經(jīng)元損傷、丟失，最終引起帕金森病、阿爾茨海默癥等神經(jīng)退行性疾病。豆甾醇可通過抑制p38、ERK 和NF-κB通路的激活來減輕小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)，發(fā)揮神經(jīng)保護作用，改善此類疾病[23-24]。除典型的運動癥狀外，嗅覺減退、抑郁、癡呆等感覺、精神認(rèn)知障礙在帕金森病中也十分常見。豆甾醇可通過增強膽堿能神經(jīng)傳遞系統(tǒng)介導(dǎo)的激活雌激素或NMDA受體改善由東莨菪堿導(dǎo)致的小鼠認(rèn)知功能障礙[25]。藏花醛是一種單萜醛，主要存在于番紅花屬植物和半人馬屬植物中。研究表明，藏花醛可以通過促進(jìn)帕金森病動物模型多巴胺能神經(jīng)元分化和存活、抑制α-突觸核蛋白（α-synuclein，α-Syn）纖顫/聚集發(fā)揮抗帕金森病治療作用[15]。此外，藏花醛也可通過抗炎、抗凋亡、抗水腫等途徑發(fā)揮神經(jīng)保護作用[16]。實驗表明，甲基丁香酚可以明顯提高大鼠腦組織中GSH、SOD、CAT的活性，降低MDA的含量，發(fā)揮抗氧化作用，保護神經(jīng)元[26]。而除了抗氧化作用外，以丁香酚為主要成分的丁香揮發(fā)油在抗焦慮、抗抑郁、抗炎等方面也具有良好作用[27-30]。

靶蛋白的自由度與該靶點在疾病治療中的重要性呈正相關(guān)。腫瘤壞死因子（TNF）、白細(xì)胞介素-6（IL6）、腫瘤抑制因子（TP53）作為度值前三的靶蛋白，很可能是桑寄生抗帕金森病的關(guān)鍵靶點。為此，我們采取了分子對接技術(shù)進(jìn)行了驗證。常說的TNF是指由巨噬細(xì)胞分泌的TNF-α，可參與經(jīng)典和非經(jīng)典Caspas 途徑、NF-KB和JNK信號通路等干預(yù)細(xì)胞凋亡過程。IL-6是由T 細(xì)胞、B 淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等產(chǎn)生，可被IL-1、TNF 等細(xì)胞因子激活表達(dá)，參與機體免疫應(yīng)答及炎性反應(yīng)，是一種典型的炎性因子。IL-6 與其受體蛋白結(jié)合后激活的Janus 激酶（JAK），可以激活Ras/Raf 途徑、磷酸肌醇3 激酶（PI3K）-蛋白激酶的激活B（PKB）/Akt通路，通過作用于不同細(xì)胞產(chǎn)生促炎或抑炎反應(yīng)。TP53 可作用于B 細(xì)胞淋巴瘤-2（Bcl-2）家族蛋白相或PI3K/Akt、MAPK 等信號通路，調(diào)控細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)等多種細(xì)胞效應(yīng)及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[31-33]。正常情況下，TP53可上調(diào)線粒體谷氨酰胺酶2（GLS2），促進(jìn)線粒體代謝、呼吸，維持氧化還原穩(wěn)態(tài)。而高度表達(dá)的P53 會抑制下游蛋白增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）的生成，致使DNA 氧化損傷、多巴胺能神經(jīng)元變性凋亡[33-35]。眾多研究已表明，TNF-α、IL-6 及TP53 因子水平與PD密切相關(guān)，這可能與抗氧化應(yīng)激功能下降（如TP53 上調(diào)）或α-突觸核蛋白激活小膠質(zhì)細(xì)胞釋放大量TNFα、IL-6[36]，導(dǎo)致機體黑質(zhì)部位出現(xiàn)嚴(yán)重的氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)，一方面促使線粒體膜電位改變，引起線粒體死亡。另一方面，也可激活促凋亡蛋白（Bax），抑制抗凋亡蛋白（BCL-2）[37]，促使細(xì)胞凋亡，最終引起DA 能神經(jīng)元損傷[38-41]。

富集分析結(jié)果顯示，桑寄生治療PD的KEGG 信號通路主要涉及HIF-1、MAPK、PI3K-Akt 以及IL-17 等信號通路，以及氧化應(yīng)激、細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移、催化活性的負(fù)調(diào)控、小分子代謝過程的調(diào)控等生物過程。MAPK信號通路主要分為4個亞家族，包括細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）、c-Jun N 末端激酶/應(yīng)激活化蛋白激酶（JNK/SAPK）、p38絲裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）及細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶5（ERK5）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。其中，細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶ERK 信號通路（Ras-Raf-MEK-ERK）被稱作經(jīng)典的MAPK 信號通路，遵循MAPK 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的三級激酶級聯(lián)反應(yīng)。Ras 蛋白作為該途徑的上游蛋白，被多種刺激因子激活后，可與Raf-1 結(jié)合并使其磷酸化、轉(zhuǎn)為活化狀態(tài)。而被Raf-1磷酸化激活的MEKs后，也可通過磷酸化反應(yīng)激活ERKs。ERK主要存在于神經(jīng)系統(tǒng)中，參與各種神經(jīng)生理病理過程[42]，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖與分化、細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞凋亡等功能，同時對學(xué)習(xí)、記憶等也有重要意義[43-46]。ERK 信號通路與PD 關(guān)系密切，有研究表明，PD 患者黑質(zhì)中p-ERK 顆粒聚集數(shù)明顯高于正常老年組[42，47]。劉自華等通過對小鼠黑質(zhì)部位進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，發(fā)現(xiàn)PD 模型小鼠較正常組ERK、P38 基因表達(dá)下降，認(rèn)為其細(xì)胞增殖、分化及形態(tài)維持等功能受到破壞，神經(jīng)受損，最終導(dǎo)致PD 發(fā)生[48]。也有研究報道，ERK 信號通路參與PD 過程與炎性介質(zhì)有關(guān)。炎性因子TNF-α可激活ERK 信號通路[49]，電針在降低魚藤酮誘導(dǎo)的PD 模型大鼠中腦黑質(zhì)內(nèi)ERK 信號通路的表達(dá)水平的同時，也降低了TNF-α 的表達(dá)[42]。此外，PI3KAkt 信號通路在帕金森疾病中的作用也不容小覷。激活的磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）通過第二信使PIP3 活化胞內(nèi)的蛋白激酶B（pro?tein kinase B，PKB/AKT），進(jìn)而激活雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR），促進(jìn)細(xì)胞代謝，抑制細(xì)胞自噬[50]。研究表明，抑制mTOR 的激活可以增強自噬過程，清除α-突觸核蛋白，保護多巴胺能神經(jīng)元，達(dá)到治療PD的作用[48]。

4 結(jié)論

桑寄生可以通過TNF、IL6、TP53、HMOX1、IL1B 等多靶點作用于MAPK、PI3K-Akt等信號通路，影響炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡及增殖等生物過程，最終達(dá)到治療PD的作用，體現(xiàn)了桑寄生多成分、多靶點、多通路的作用特點。

（利益沖突：無）