董塔娜,李娜,王曉溪,張磊磊,唐立岡
1.山東省公安廳物證鑒定研究中心,山東 濟南 250001;2.山西醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院,山西 太原030001
急性心肌梗死是冠狀動脈急性或持續(xù)性缺血、缺氧導(dǎo)致的部分心肌急性壞死,常伴有冠狀動脈主要分支的粥樣硬化及不同程度狹窄,有時可見不同類型血栓[1-2],亦有無心臟基礎(chǔ)疾病的年輕女性因腸胃炎致冠狀動脈左前降支開口處形成以中性粒細胞為主的炎性血栓,最終導(dǎo)致心肌梗死的案例報道[3]。上述典型及非典型的心肌梗死(myocardial infarction,MI)案例中冠狀動脈內(nèi)血栓明顯、可檢見心肌梗死,死后診斷相對較為明確,但法醫(yī)學(xué)工作中常見冠狀動脈血栓脫落或冠狀動脈痙攣導(dǎo)致的急性心肌梗死。心肌缺血發(fā)生典型形態(tài)學(xué)改變需要缺血持續(xù)發(fā)生或在發(fā)生后存活至少6~12 h,因此,急性心肌梗死發(fā)生后立即死亡的案例以常規(guī)檢測手段常無法檢見明顯病變。此外,冠狀動脈無明顯狹窄或狹窄不嚴重,僅因冠狀動脈痙攣導(dǎo)致的心肌缺血和(或)缺氧常因缺乏冠狀動脈器質(zhì)性病變依據(jù)而難以診斷。因此在未見明顯冠狀動脈血栓的情況下,急性心肌梗死的死后診斷,特別是早期急性心肌梗死的診斷成為重點和難點?;谏鲜鰡栴},本文就常見的心肌梗死及急性心肌梗死的虛擬解剖、組織形態(tài)學(xué)、免疫組織化學(xué)、生物化學(xué)標志物及分子生物學(xué)等診斷、分析方法進行總結(jié),并試圖探索適用于早期急性心肌梗死法醫(yī)學(xué)診斷的可行方案。
虛擬解剖具有非侵入性、客觀、準確等特點,且用于死后影像學(xué)診斷可避免運動偽影以及劑量和治療時限等限制,成為近年來法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點[4]。目前常利用CT 及MRI 技術(shù)進行死后心臟血管畸形、病變以及心肌梗死的診斷[5]。
在2003—2006年,就有利用死后MRI顯示梗死心肌部位的探索[6-7],此后的研究不斷細分心肌梗死的病程進展、優(yōu)化掃描序列參數(shù),并不斷擴大死后MRI的研究人群。2006年,JACKOWSKI等[6]利用1.5T MRI檢測梗死心肌范圍,發(fā)現(xiàn)發(fā)病6 h 內(nèi)死亡的急性心肌梗死死后MRI、尸體解剖和組織病理學(xué)檢驗均無明顯病變;組織學(xué)表現(xiàn)為中央壞死及周圍水腫的急性期心肌梗死,MRI 表現(xiàn)為心肌壁壞死中心區(qū)T2加權(quán)像、短時間反轉(zhuǎn)恢復(fù)(short time inversion recovery,STIR)序列及液體抑制反轉(zhuǎn)恢復(fù)(fluid attenuated inversion recovery,F(xiàn)LAIR)序列信號減弱,外膜下邊緣位置見T2加權(quán)像、STIR 及FLAIR 序列信號增強。進一步利用3.0T MRI 對136 例心臟性死亡案例行死后MRI,見急性期心肌梗死患者心肌梗死部位T2加權(quán)像表現(xiàn)為邊緣無高信號水腫反應(yīng)的低密度區(qū);急性期心肌梗死患者心肌梗死部位T2加權(quán)像表現(xiàn)為被超高信號邊緣包圍的低信號中心區(qū)[8-9],說明3.0T MRI 相較于1.5T MRI 具有更強的顯影能力。隨著死后MRI 技術(shù)的發(fā)展、序列參數(shù)的完善以及研究數(shù)據(jù)的累積,死后MRI為早期急性心肌梗死的診斷提供了新的可能。
與臨床計算機體層血管成像(computed tomography angiography,CTA)不同,適用于死后計算機體層血管成像(postmortem computed tomography angiography,PMCTA)的造影劑易受死后變化的影響,且不同類型造影劑所受影響不同[10]。LEE 等[11]以多碘化脂肪酸酯混合物為造影劑對1 例疑似心肌梗死的死亡案例進行分析,成功發(fā)現(xiàn)其冠狀動脈右主干遠端的完全血栓及從右主干近端一直延伸至左髂總動脈的動脈夾層。該研究還發(fā)現(xiàn)右冠狀動脈對應(yīng)左心室部分區(qū)域的灌注缺失,應(yīng)是血栓堵塞使造影劑無法灌注所致,為利用PMCTA 進行心肌梗死的死后診斷提供了新思路。在MICHAUD 等[12]利用PMCTA 對缺血性心臟病案例的研究中,MPMCTA 可以發(fā)現(xiàn)78%(18/23)存在動脈狹窄、血栓及鈣化的形成。但死后CT 血管造影僅可直觀反映有顯著血管狹窄或血栓的心肌梗死,對于無血管器質(zhì)性改變的早期急性心肌梗死的死后診斷意義有限。
心肌缺血導(dǎo)致?lián)p傷通常需要5~8 h 才能出現(xiàn)明顯的組織學(xué)改變[13],因此,常規(guī)HE 染色對早期急性心肌梗死的死后診斷意義有限,但對于12 h 以后的急性心肌梗死的病理學(xué)診斷仍具參考意義。心臟缺血12~24 h,相應(yīng)部位心肌明顯蒼白[14-15],光鏡下可見缺血區(qū)域嗜酸性粒細胞顯著增多;24 h 左右梗死灶邊緣出現(xiàn)中性粒細胞浸潤;24~48 h 出現(xiàn)凝固性壞死表現(xiàn),包括不同程度的心肌細胞的核固縮、早期核破裂和核溶解;48 h 左右梗死中心部位也開始出現(xiàn)中性粒細胞浸潤[15]。但上述組織學(xué)改變特異性不足,需結(jié)合案情調(diào)查、尸體檢驗及其他驗證方法綜合分析。
2.2.1 蘇木精-堿性復(fù)紅-苦味酸(haematoxylin-basic fuchsin-picric acid,HBFP)染色
1971年,LIE等[16]首次提出HBFP染色法可標記藥物誘導(dǎo)缺血30 min 的心肌,表現(xiàn)為缺血心肌的紅色深染以及正常心肌和壞死心肌的黃染或棕黃染。1976 年,RAJS 等[17]首次證實HBFP 標記人類缺血心肌的可行性,但假陽性率、假陰性率較高。冠狀動脈結(jié)扎15 min 后即可見相應(yīng)區(qū)域心肌的紅色深染,且將心臟樣本室溫下保存14 d 仍可見HBFP 的點灶狀陽性著色[18-19]。法醫(yī)學(xué)檢驗中,發(fā)病后0.5 h 內(nèi)死亡案例的HBFP 陽性率達55%(5/9)[20];另一項研究中,發(fā)病后1 h 內(nèi)死亡案例的HBFP 陽性率達50%(3/6)[18]。雖然HBFP 可辨認小于1 h 的梗死心肌,且對腐敗的耐受度較高,但仍存在假陽性率和假陰性率高以及分化時長不易掌握等不足。
2.2.2 吖啶橙染色
吖啶橙具有極高的核酸染色特異性,可將DNA染為綠色、RNA 染為棕紅色[21]、梗死心肌染為亮綠色、正常心肌染為金褐色。冠狀動脈結(jié)扎后5~25 min 即可在相應(yīng)區(qū)域心肌檢見綠色熒光,且其在常規(guī)石蠟包埋樣本中的應(yīng)用效果更佳[22-23]。發(fā)病2 h 后死亡者的梗死心肌顯示淺綠色熒光,陳舊性梗死瘢痕也可顯示亮綠色熒光[24]。鑒于吖啶橙的觀察需要具有紫外線光源的熒光顯微鏡,而這類顯微鏡在法醫(yī)鑒定機構(gòu)中配備較少,同時吖啶橙染色切片無法長期保存以及部分學(xué)者對其應(yīng)用存在爭議[25],目前吖啶橙染色尚未普遍應(yīng)用于早期急性心肌梗死的死后診斷。
2.2.3 變色酸2R-亮綠染色
變色酸2R-亮綠染色是早期心肌梗死研究的常見特殊染色法之一,可將正常心肌及纖維性結(jié)締組織染為綠色、早期梗死心肌染為深粉紅色、紅細胞染為桔紅色[26]。該染色對心肌缺血極為敏感,急性力竭運動后出現(xiàn)心肌缺血、缺氧改變,變色酸2R-亮綠染色即可表現(xiàn)為缺血心肌的點、片狀紅色改變;在早期急性心肌梗死動物模型中,心肌缺血15 min 即出現(xiàn)陽性染色結(jié)果,心臟于室溫、-4 ℃及-20 ℃分別保存5 d、14 d 及21 d 仍可見缺血區(qū)域明顯紅染,與正常心肌細胞對比鮮明、邊界清晰[27-28]。發(fā)病1 h 后死亡者可見灶狀、大片的心肌纖維呈陽性染色,發(fā)病1 h 內(nèi)死亡的案例陽性率也達83%(5/6)[18]。但目前該方法用于檢驗人體心肌樣本的案例較少,應(yīng)進一步累積人體樣本檢測量,明確該方法的特異性、穩(wěn)定性再應(yīng)用于早期急性心肌梗死的診斷。
2.2.4 鐵礬-蘇木精染色法
鐵礬-蘇木精(Heidenhain)染色可將線粒體、染色體、核仁、中心粒等染為黑色或灰色,人類正常心肌細胞被染為紅色,細胞核一般為灰色,缺血心肌及紅細胞染為黑色[29]。Heidenhain 染色在動物模型缺血后15 min 心肌中可見心外膜下淺肌層點狀分布的陽性染色,結(jié)扎3 h 后對應(yīng)區(qū)域大部分或心肌全層心肌纖維黑染,呈片狀、團塊狀分布,且Heidenhain 染色對腐敗的耐受力略強于HBFP 染色[18,30],但其特異性不足,在低溫死亡時心肌也會出現(xiàn)類似心肌缺血的病理改變,Heidenhain 染色也可呈陽性[31-32]。在人類心肌梗死研究中,梗死心肌細胞及心臟病合并失血性休克患者的心肌細胞呈陽性著色,驗證了Heidenhain 染色對缺血和(或)缺氧心肌的敏感性[33-34]。陳冰等[35]報道,人類梗死心肌樣本的Heidenhain 染色陽性率約為54%(15/28),進一步證明了Heidenhain 染色可以用于心肌梗死的判別。
心肌梗死還可引起其特異性標記蛋白的顯著變化,這些標志物可分為心肌細胞結(jié)構(gòu)蛋白、心肌缺氧或梗死后應(yīng)激誘導(dǎo)蛋白兩類。
2.3.1 心肌細胞結(jié)構(gòu)蛋白的消耗
心肌細胞結(jié)構(gòu)蛋白通常是保證心肌細胞正常功能及細胞結(jié)構(gòu)的重要組成蛋白,心肌發(fā)生缺血或梗死后,隨著細胞結(jié)構(gòu)的破壞或質(zhì)膜滲透性的改變,這些蛋白及蛋白復(fù)合體結(jié)構(gòu)被破壞或者釋放入血,導(dǎo)致其在缺血或梗死心肌細胞內(nèi)減少甚至消失。常見的心肌細胞結(jié)構(gòu)蛋白包括肌球蛋白(myosin)、肌鈣蛋白(troponin,包括TnT 和TnI)、肌動蛋白(actin)、肌紅蛋白(myoglobin)、肌酸激酶同工酶-MB(creatine kinase isoenzyme-MB,CK-MB)、肌萎縮蛋白(dystrophin)等。
S100A1 及心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白(heart-type fatty acid-binding protein,H-FABP)是心肌缺血后最早發(fā)生變化的蛋白之一。冠狀動脈結(jié)扎后15 min,心內(nèi)膜下肌層及乳頭肌中部分心肌細胞即出現(xiàn)S100A1 及H-FABP 耗竭,且伴有血漿中S100A1 及H-FABP 濃度的升高[36-37]。此外,肌萎縮蛋白可與肌聚糖蛋白、肌養(yǎng)蛋白等肌營養(yǎng)不良蛋白相關(guān)蛋白組成復(fù)合物,參與心肌細胞收縮力傳導(dǎo)并維持質(zhì)膜穩(wěn)定,在冠狀動脈結(jié)扎后20 min 表現(xiàn)為心肌纖維膜上的完全缺失,其缺失面積隨著結(jié)扎時間的延長逐漸增大[38-39]。且肌萎縮蛋白對心肌缺血及梗死的敏感性高于整合素β1(integrin-β1)和血影蛋白(spectrin)[40]。冠狀動脈結(jié)扎30 min 后,心內(nèi)膜下肌紅蛋白出現(xiàn)局灶性不完全耗竭,且其對腐敗耐受性較強[41-42]。此外,冠狀動脈結(jié)扎后1 h 心肌肌鈣蛋白(包括cTnI 和cTnT)、肌紅蛋白以及冠狀動脈結(jié)扎后3 h 的CK-MB 均在缺血、梗死部位表現(xiàn)為顯著的減少或消失[43-44]。
上述研究均為基于動物模型展開的研究,相應(yīng)蛋白檢測還應(yīng)用于人心肌梗死的死后研究。發(fā)病1 h 內(nèi)死亡的早期急性心肌梗死表現(xiàn)為細胞骨架蛋白α 輔肌動蛋白(α-actinin)、黏著斑蛋白(vinculin)及結(jié)蛋白(desmin)的大量缺失;發(fā)病6 h 內(nèi)死亡的急性心肌梗死中,上述3 種細胞骨架蛋白缺失率達78%(11/14)[45]。cTnT 在急性心肌梗死后8 h 內(nèi)的相應(yīng)損傷區(qū)域染色缺失率達到62%(8/13)[46]。cTnI 僅分布于心肌,在有明確常規(guī)組織學(xué)改變的急性心肌梗死和無明確常規(guī)組織學(xué)改變的急性心肌梗死受損心肌中都表現(xiàn)為免疫反應(yīng)的缺失[47-48]。在發(fā)病10~24 h 死亡的急性心肌梗死中,缺血或梗死心肌均存在肌酸激酶B(creatine kinase-B,CK-B)及肌酸激酶M(creatine kinase-M,CK-M)的染色減少[44]。OUYANG 等[49]研究發(fā)現(xiàn),在發(fā)病12 h 至數(shù)天死亡的案例中,結(jié)蛋白缺失率達92.0%(23/25)。
2.3.2 心肌缺氧或梗死誘導(dǎo)蛋白積聚
心肌細胞的缺氧或梗死還通過缺氧、細胞壞死、炎癥反應(yīng)以及損傷后修復(fù)等多途徑誘導(dǎo)相關(guān)蛋白因子向損傷心肌區(qū)域聚集。相較于心肌自有蛋白的耗竭,這些蛋白標志物表現(xiàn)為相應(yīng)缺血或梗死區(qū)域的陽性染色,更易觀察與識別。
冠狀動脈的梗阻或痙攣直接導(dǎo)致其供血區(qū)域心肌的缺血缺氧,缺氧激活相關(guān)響應(yīng)蛋白及通路。其中,缺氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia-inducible factor-1,HIF-1)是參與缺氧適應(yīng)性應(yīng)激反應(yīng)的主要轉(zhuǎn)錄因子,可通過激活編碼血管生長因子的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控新血管的生成抵抗缺氧狀態(tài)[50]。大鼠冠狀動脈結(jié)扎后20~30 min即可見缺氧或梗死心肌細胞HIF-1α 增多并持續(xù)表達[51-52]。而在人體急性心肌梗死研究中,HIF-1α 在心肌梗死陽性對照心肌的細胞核及胞質(zhì)中均大量染色;發(fā)病后2 h內(nèi)死亡的患者HIF-1α陽性率達88.9%(8/9),發(fā)病2 h 后死亡的陽性率為71.4%(5/7),證明了HIF-1α應(yīng)用于急性心肌梗死死后診斷的可行性[53]。
心肌梗死的發(fā)生主要通過心肌細胞的凝固性壞死實現(xiàn),壞死的心肌細胞釋放大量的細胞內(nèi)容物激活多種免疫通路引發(fā)炎癥反應(yīng),包括膜結(jié)合Toll 樣受體(Toll-like receptor,TLR)、晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(receptor for advanced glycation end product,RAGE)以及補體系統(tǒng)等[54]。其中補體系統(tǒng)可以被凝集素等途徑激活形成C3 轉(zhuǎn)化酶并最終形成C5b9[55]。C5b9特異性聚集于壞死細胞表面,并可通過破壞細胞膜導(dǎo)致細胞損傷,抑制C5 的表達可顯著降低梗死心肌面積、改善心室功能并減少白細胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)及E 選擇素的表達[56],且其作為心肌梗死診斷標志物具有較高的敏感性和特異性[57]。在動物模型中,C5b9 最早于冠狀動脈結(jié)扎后2 h 散在分布于部分受損心肌[43];在人體心臟檢材中,心肌梗死發(fā)生后存活超過40 min 即可檢出C5b9 陽性染色[58],其陽性染色結(jié)果在死后2~3 d 開始出現(xiàn)衰減[59]。
心肌梗死后,梗死心肌細胞外基質(zhì)蛋白組分改變影響心肌修復(fù),纖維連接蛋白(fibronectin,F(xiàn)n)和細胞黏合素通常最早出現(xiàn)在受損心肌細胞外形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)供后續(xù)其他蛋白附著[60]。隨著缺血或梗死心肌細胞質(zhì)膜的破壞,纖維連接蛋白出現(xiàn)在受損心肌細胞內(nèi)。冠狀動脈結(jié)扎1 h 的缺血心肌出現(xiàn)纖維連接蛋白積聚,在人體心臟檢材中其陽性表達時間提前到出現(xiàn)癥狀后0.5 h,在疑似早期急性心肌梗死的心臟檢材中其陽性率達83.3%(15/18)[43,61-62]。
此外,縫隙連接蛋白43(connexin 43,Cx43)在冠狀動脈結(jié)扎后15 min 即出現(xiàn)局灶陽性染色,JunB 在冠狀動脈結(jié)扎后30 min 呈陽性染色[43],IL-6、IL-1β、B 細胞淋巴瘤-2(B cell lymphoma-2,BCL-2)、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、熱激蛋白70(heat shock protein 70,HSP70)等亦在梗死心肌區(qū)域呈陽性表達[41,51,63]。心肌缺血或梗死激活諸多通路,導(dǎo)致多種蛋白標志物陽性表達,但這些蛋白標志物的特異性、敏感性以及對死后變化的耐受性均不同,特別是死后變化對其陽性染色的影響仍需深入研究。
臨床上常采用檢測血液、尿液等體液中特異性標志物的濃度變化來判斷疾病發(fā)生,cTnT、cTnI、CKMB 等標志物血清濃度的檢測被廣泛應(yīng)用于心肌梗死的臨床診斷[64]。在法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域,體液中多種生物標志物的濃度可因死后變化而產(chǎn)生與臨床應(yīng)用標準的巨大差異。研究[65-67]發(fā)現(xiàn),死后血清及心包液中cTnT 及cTnI 的含量顯著高于瀕死期血清及心包液。而相應(yīng)標志物水平是否受到死亡時間影響則存在爭議。PéREZ-CáRCELES 等[68-69]認為,CK-MB、cTnT、正五聚蛋白3(pentraxin 3,PTX3)及肌紅蛋白在死后血清、血漿及心包液中的表達量與死亡時間無相關(guān)性。ZHU 等[70]則發(fā)現(xiàn)死亡時間小于12 h 的心血及心包液中cTnT 水平顯著低于死亡時間為12~48 h 的樣本。此外,PETER 等[71]指出,發(fā)病后立即死亡或僅存活3~8 h 的患者股靜脈血中cTnT、cTnI 較高,在存活時間為1~8 h 范圍內(nèi),兩者含量還與存活時間存在正相關(guān)。而生物標志物在多種體液中的表達水平與患者性別、年齡以及是否進行心肺復(fù)蘇術(shù)治療均無顯著相關(guān)性[68,72]。
體液中標志物的表達量除受死后變化影響外還取決于取材部位[65]。利用生物標志物進行急性心肌梗死的死后診斷研究中,常用的體液樣本有心血、外周血(血清或血漿)、心包液和腦脊液等[65]。心血的采集又分為左心血及右心血,外周血采集部位包括髂靜脈、髂外靜脈、股靜脈等[73-74]。心包液中cTnT、cTnI和氨基末端腦利尿鈉肽前體(N-terminal pro-brain natriuretic peptide,NT-proBNP)的含量顯著高于股靜脈血;心血和心包液中cTnT、cTnI及CK-MB 的含量顯著高于髂靜脈血、腦脊液中cTnT、cTnI 及CK-MB 的含量,髂靜脈血中cTnT、cTnI 及CK-MB 的含量顯著高于腦脊液中cTnT、cTnI 及CK-MB 的含量[65,75]。
即使存在上述多變量影響,急性心肌梗死特異性生物標志物的表達模式基本一致。常用于死后生物化學(xué)檢測的標志物包括cTnI、cTnT、CK-MB、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)以及PTX3 等,這些生物標志物在急性心肌梗死、心肌梗死或心臟性猝死患者體液中的含量常顯著高于其他類型死亡者[68-69,72-74,76]。其中,血漿中cTnI對于急性心肌梗死診斷的特異性高于CK-MB 及肌紅蛋白[77]。動物模型中,心肌及血清中肌生成抑制蛋白在冠狀動脈結(jié)扎后10 min 即顯著增高[78]。但這些生物標志物高表達的特異性有待商榷,如cTnT 在中暑、致死量甲基苯丙胺以及一氧化碳中毒導(dǎo)致的心肌損傷中也表現(xiàn)出濃度增高[70]。此外,急性心肌梗死特異性生物標志物檢測用于其死后診斷的最大障礙,是標志物的死后表達量及濃度診斷閾值的探索與確立。鑒于上述死亡時間、取材部位、標志物特異性以及診斷標準等研究尚不完善,目前仍無法利用此類方法進行急性心肌梗死的死后診斷。
除上述主流研究方案外,還有利用Western 印跡法等檢測急性心肌梗死特異性蛋白降解、利用實時熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(real time fluorescent quantitative reverse transcription polymerase chain reaction,RT-qPCR)對急性心肌梗死特異性基因的核酸定量分析等特殊診斷方法的應(yīng)用與研究。
Western 印跡法可量化標記蛋白的表達水平,并評估蛋白質(zhì)降解情況。KUMAR 等[79]發(fā)現(xiàn)死亡原因影響cTnT 蛋白降解速度和片段大小,心肌梗死患者心肌中cTnT 在缺血后1 h 發(fā)生顯著降解,且早于正常對照組、窒息死亡、燒傷死亡、電擊及中毒死亡者心肌中cTnT 的降解。
RNA 極易降解,故利用RNA 進行急性心肌梗死的死后診斷:首先要排除死后變化對RNA 完整性的影響,RNA 完整性一般以RNA 完整性指數(shù)(RNA integrity number,RIN)表示;其次要保證較高的RNA 提取質(zhì)量[80]。RNA 的提取濃度及RIN 值與死亡時間一般無相關(guān)性,但RIN 值在一定程度上受其提取檢材源影響(R2=0.4,P<0.05)[81]。RNA 提取質(zhì)量以D260/D280衡量,一般與死亡時間呈負相關(guān)[81]。目前,多數(shù)研究以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)為內(nèi)參基因,利用SYBR Green及TaqMan探針法進行RT-qPCR 對目標基因mRNA 的表達量進行相對定量[43,63,81-84]。肌球蛋白輕鏈3(myosin light chain 3,MYL3)、轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)、MMP-9、血管內(nèi)皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A,VEGFA)、心肌肌鈣蛋白I3(cardiac troponin I3,TNNI3)、腦利尿鈉肽(brain natriuretic peptide,BNP)、HIF-1α、促紅細胞生成素(erythropoietin,EPO)、血紅蛋白A1/A2(hemoglobin A1/A2,HbA1/2)、血紅蛋白β(hemoglobin β,HBB)及丙酮酸脫氫酶激酶4(pyruvate dehydrogenase kinase 4,PDK4)等已用于急性心肌梗死死后診斷的法醫(yī)學(xué)研究[43,63,81-84]。多數(shù)基因均表現(xiàn)出在心臟性猝死、冠狀動脈性心臟病及急性心肌梗死相關(guān)心肌、血液及心包液中的高表達[43,63,81-84],其中PDK4 則表現(xiàn)為在心臟性猝死心肌中表達量低于外傷死亡心肌(P<0.05)。但HIF-1α、VEGFA 等基因?qū)Σ煌潭刃募」K赖拿舾行源嬖诓町怺63,81-83],TNNI3、TGFB1、BNP 等基因?qū)Σ煌〔膩碓?、不同死亡時間的敏感性均存在差異,將成果運用于急性心肌梗死的死后診斷仍需進一步研究。此外,還有利用miR-1、miR-133、miR-208 及miR-499 等環(huán)狀RNA(circular RNA)展開的研究,也多表現(xiàn)為相關(guān)微小RNA(microRNA,miRNA)在急性心肌梗死血清、血漿中的高表達[85-88]。這些研究為急性心肌梗死的死后診斷研究提供了新思路。
急性心肌梗死導(dǎo)致的死亡,特別是發(fā)病后立即或1 h 內(nèi)死亡的案例,其早期急性心肌梗死特異性組織學(xué)改變不顯著,死后診斷困難,多年來法醫(yī)學(xué)工作者們利用上述手段從急性心肌梗死心臟影像學(xué)改變、組織學(xué)改變以及蛋白和核酸表達量改變等多角度入手,探索用于急性心肌梗死、早期急性心肌梗死死后診斷的適用標準。但上述影像學(xué)、組織學(xué)、免疫組織化學(xué)改變均存在急性心肌梗死相關(guān)改變特異性差或存在爭議,且虛擬解剖對于法醫(yī)學(xué)工作者的影像學(xué)知識水平要求高,部分特殊染色、免疫熒光染色對操作者的技術(shù)水平和法醫(yī)學(xué)設(shè)備要求較高等。而特異性蛋白及信使RNA(messenger RNA,mRNA)、miRNA 定量分析尚無公認的診斷標準值等問題,且RNA 的不穩(wěn)定性使其易受死后改變的影響,同時對RNA 提取環(huán)境及操作者的技術(shù)水平都提出了挑戰(zhàn)。上述研究成果多數(shù)尚未形成診斷標準,單獨使用某一種方法鑒定早期急性心肌梗死易引起證據(jù)依據(jù)不足等問題,因此目前的研究成果尚未普遍應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)檢驗鑒定。
典型的急性心肌梗死通常是在冠狀動脈疾病基礎(chǔ)上,于身體運動、體位突然變化或情緒劇烈波動后出現(xiàn)胸痛、胸悶、呼吸急促等癥狀,隨即發(fā)生急性心肌梗死[89]。因此,疑似急性心肌梗死案例的前期調(diào)查應(yīng)確定其是否具有高血壓、冠狀動脈粥樣硬化、心肌梗死等心腦血管疾病既往病史,明確死者生前有無情緒劇烈波動等情況。有條件的,可以在開展尸體解剖前利用死后MRI 觀察被鑒定人有無心肌梗死的相應(yīng)影像學(xué)改變。在尸體檢驗過程中,排除其他致死可能性后重點檢查冠狀動脈是否存在粥樣硬化及明顯狹窄。重點觀察、提取冠狀動脈明顯狹窄處及相應(yīng)供血部位心肌,連續(xù)切片,聯(lián)合應(yīng)用HE 染色、1~2種特殊染色及1~2 種特異性蛋白免疫組織化學(xué)染色觀察心肌是否存在缺血、梗死表現(xiàn)。鑒于以上方法,筆者推薦人體心肌梗死中陽性率高且易觀察的Heidenhain[34]或變色酸2R-亮綠染色[28]及HIF-1α 或纖維連接蛋白免疫組織化學(xué)染色。最終根據(jù)虛擬解剖、尸體檢驗、組織病理學(xué)檢驗及案情調(diào)查結(jié)果綜合分析,提出合理的鑒定意見。
目前急性心肌梗死早期診斷的最新研究可大致分為三類。(1)探索對急性心肌梗死敏感性更高、在體液中濃度更早隨急性心肌梗死的發(fā)生產(chǎn)生顯著變化的心肌梗死特異性標志物,包括Adropin、缺血修飾白蛋白(ischemia-modified albumin,IMA)、脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2(lipoprotein-associated phospholipase A2,Lp-PLA2)、同型半胱氨酸、糖原磷酸化酶同工酶BB(glycogen phosphorylase isoenzyme BB,GPBB)、外泌體中的長鏈非編碼RNA 核富集轉(zhuǎn)錄體1(nuclear enriched abundant transcript 1,NEAT1)、miR-204、miR-19a 等[90-94]。(2)就目前已有的心肌梗死診斷標志物研究更敏感、更準確且更易攜帶及操作的檢驗方法或檢驗工具,如利用表面增強拉曼光譜(surfaceenhanced Raman spectroscopy,SERS)結(jié)合免疫反應(yīng)檢測血清中H-FABP、cTnI[95],利用特異性SERS 探針檢測急性心肌梗死特異性表達miRNA[96],利用SERS 結(jié)合微流控紙芯片(microfluidic paper-based analytical device,μPAD)技術(shù)檢測GPBB、cTnT、CK-MB[97]、利用免疫磁減量分析(immunomagnetic reduction,IMR)檢測肌紅蛋白、CK-MB、cTnI[98]等。(3)利用影像學(xué)技術(shù)、光譜技術(shù)等定位心肌梗死并診斷早期急性心肌梗死,如利用中空二氧化硅納米顆粒作為造影劑進行超聲成像確定心肌梗死部位并作出急性心肌梗死的早期診斷[99],利用單光子發(fā)射計算機體層攝影(single photon emission computed tomography,SPECT)、正電子發(fā)射體層成像(positron emission tomography,PET)及MRI 等檢測方法結(jié)合分子探針準確定位并診斷急性心肌梗死[100]。此外還有利用傅里葉變換紅外(Fourier transform infrared,F(xiàn)TIR)光 譜[101]、SERS 檢測血清[102]等診斷早期急性心肌梗死。在今后的研究中,可以從優(yōu)化實驗條件,提高檢測特異性和敏感性,找尋特異性更高、對死后變化耐受度更高的特異性生物標志物等多方面完善急性心肌梗死的死后診斷相關(guān)研究,并探索新的急性心肌梗死診斷方法,爭取建立得到認可的診斷閾值標準,推進已有成果應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)檢驗鑒定實際工作。