謝青文 唐其柱

心臟纖維化是各種心血管疾病不可避免的病理改變之一，主要是由于細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度沉積，致使心臟收縮和舒張功能障礙，最終導(dǎo)致心律失常和心力衰竭。心臟纖維化的主要效應(yīng)細(xì)胞成纖維細(xì)胞可被各種病理刺激激活，從而進(jìn)行增殖，分化為肌成纖維細(xì)胞，并產(chǎn)生各種細(xì)胞因子和細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)蛋白。目前還沒(méi)有治療心臟纖維化的方法，因此了解心臟纖維化的病理發(fā)生機(jī)制具有重要意義。DNA甲基化是一種重要的表觀遺傳機(jī)制，通常發(fā)生在對(duì)環(huán)境刺激的反應(yīng)中，在調(diào)控基因表達(dá)中起關(guān)鍵作用。最近研究表明，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferases，DNMTs)在心臟纖維化中起著重要作用，控制DNA甲基化可能成為抗纖維化治療的新策略。本文就DNA甲基轉(zhuǎn)移酶在心臟纖維化中的作用最新研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，尋找心臟纖維化治療新靶點(diǎn)。

一、DNMTs概述

DNA 甲基化是指DNA的特定堿基在DNMTs的作用下，共價(jià)結(jié)合一個(gè)甲基基團(tuán)的化學(xué)修飾過(guò)程，可以發(fā)生在多個(gè)堿基基團(tuán)上。在一般研究中，主要是指在胞嘧啶第5位碳原子上添加一個(gè)甲基，產(chǎn)生 5-甲基胞嘧啶(5-mC)的過(guò)程，通過(guò)基因啟動(dòng)子區(qū)域的DNA甲基化參與轉(zhuǎn)錄基因沉默。在真核生物中，DNA甲基化主要發(fā)生在CpG島，主要DNMTs和甲基結(jié)合蛋白調(diào)控。目前，哺乳動(dòng)物中共發(fā)現(xiàn)了五種DNMT 蛋白，但只有 DNMT1、DNMT3A 和 DNMT3B 具有甲基轉(zhuǎn)移酶活性[1]。在DNA復(fù)制過(guò)程中，DNMT1將DNA甲基化從母鏈復(fù)制到新合成的子鏈。DNMT3A和DNMT3B參與從頭甲基化，在缺乏模板的情況下建立新的DNA甲基化模式。已有研究表明，在人類和小鼠心臟中表達(dá)的主要DNA甲基轉(zhuǎn)移酶是DNMT3B，而其他甲基轉(zhuǎn)移酶，DNMT1和DNMT3A幾乎檢測(cè)不到，而且DNMT3B敲除的心臟中存在著廣泛的間質(zhì)纖維化[2]。另外有研究發(fā)現(xiàn)，在異丙腎上腺素誘導(dǎo)的大鼠心臟纖維化模型中，心臟成纖維細(xì)胞DNMT3A表達(dá)上調(diào)，miR-29a及其miR-26a-5p通過(guò)下調(diào)DNMT3A而降低成纖維細(xì)胞的增殖和活化，從而改善心臟纖維化[3,4]。這些結(jié)果說(shuō)明，DNMTs各亞型在心臟纖維化中的作用不同，還需更多研究去探索DNMTs參與心臟纖維化的作用機(jī)制。無(wú)論是心肌梗死引起的急性缺血性損傷，慢性高血壓引起的壓力超載，還是糖尿病引起的代謝功能障礙，均能使心臟細(xì)胞DNA甲基化機(jī)制功能失調(diào)，導(dǎo)致心臟纖維化。下面筆者將討論DNMTs在缺血性心肌病、壓力負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌病以及糖尿病性心肌病等心臟纖維化病理機(jī)制中的作用。

二、DNMTs與心臟纖維化發(fā)生的關(guān)系

1.缺血性心肌?。篋NA甲基化在缺血性心肌病中發(fā)揮重要作用。實(shí)驗(yàn)證實(shí)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)可抑制DNMT1蛋白的表達(dá)和活性，從而抑制α平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)啟動(dòng)子甲基化，導(dǎo)致心肌梗死區(qū)α-SMA表達(dá)大幅增加。但是在該研究中， DNMT3A和DNMT3B表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[5]。Jeong等[6]研究發(fā)現(xiàn)在心肌梗死中，DNMTs抑制劑5-氮雜胞苷(5-azacytidine，5AZA)可顯著改善心臟功能和纖維化，這與巨噬細(xì)胞中干擾素調(diào)節(jié)因子-1(interferon regulatory factor-1，IRF1)的SUMO化有關(guān)。內(nèi)皮細(xì)胞通過(guò)內(nèi)皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(endothelial-to-mesenchymal transition，EndMT)獲得纖維增殖表型，在新生內(nèi)膜病變的形成中發(fā)揮關(guān)鍵作用。缺氧可通過(guò)低氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia inducible factor-1 α，HIF1α)和TGF/SMAD信號(hào)通路通過(guò)DNMT3A介導(dǎo)的Ras-Gap樣蛋白1(Ras-Gap-like protein 1，RASAL1)啟動(dòng)子的高甲基化，誘導(dǎo)人冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞EndMT[7]。

人冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞暴露于高磷酸鹽環(huán)境時(shí)也發(fā)生EndMT。進(jìn)一步研究證明，這種EndMT是通過(guò)組蛋白去乙?；?(histone deacetylase 2，HDAC2)將異常磷酸化的DNMT1募集到RASAL1 CpG島啟動(dòng)子上，并激活常見(jiàn)的EndMT調(diào)控因子Twist和Snail而導(dǎo)致的[8]。缺氧產(chǎn)生的自由基也可能激活Snail，上調(diào)DNMT1和DNMT3B，使RASSF1A蛋白合成顯著減少，相關(guān)纖維化標(biāo)志物增加。細(xì)胞外超氧化物歧化酶可以通過(guò)Ras/ERK途徑顯著降低DNMT1和DNMT-3B介導(dǎo)的RASSF1A基因甲基化，從而緩解缺氧誘導(dǎo)的心臟纖維化[9]。在研究血管成形術(shù)誘導(dǎo)再狹窄機(jī)制時(shí)，發(fā)現(xiàn)豬冠狀動(dòng)脈DNMT1和DNMT3A對(duì)細(xì)胞因子信號(hào)的抑制基因(suppression of cytokine signaling 3，SOCS3)具有抑制作用，抑制DNMT1和DNMT3A對(duì)防止冠狀動(dòng)脈再狹窄可能具有重要臨床意義[10]。同時(shí)，該研究還發(fā)現(xiàn)抑制血管平滑肌細(xì)胞DNMT1可誘導(dǎo)DNMT3A表達(dá)。DNMT1和DNMT3A之間存在一種相互調(diào)節(jié)的機(jī)制，在DNMT1缺失的情況下，誘導(dǎo)DNMT3A可補(bǔ)償DNMT1功能的喪失。這些研究結(jié)果表明，在缺血性心肌病中，DNMTs通過(guò)沉默基因表達(dá)發(fā)揮促纖維化或抗纖維化作用，但是DNMTs抑制劑治療心臟纖維化卻表現(xiàn)出積極作用。

2.壓力負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌?。涸趬毫ω?fù)荷誘導(dǎo)的心肌病中，心臟纖維化是心肌重構(gòu)的一個(gè)重要病理改變。微小RNA與DNA甲基化的相互作用可能是心臟纖維化疾病遺傳因素缺失的原因。腹主動(dòng)脈縮窄術(shù)后的大鼠纖維化心臟及雷帕霉素誘導(dǎo)的心臟成纖維細(xì)胞自噬中，DNMT3A表達(dá)水平均上調(diào)。DNMT3A通過(guò)調(diào)控miR-200b參與心臟成纖維細(xì)胞自噬[11]。同樣地，Tao等[12]研究發(fā)現(xiàn)，腹主動(dòng)脈縮窄大鼠心臟DNMT3A及纖維化相關(guān)蛋白α-SMA和膠原蛋白Ⅰ表達(dá)顯著升高。心臟成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染DNMT3A-siRNA對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞增殖有明顯抑制作用。miR-369-5p介導(dǎo)的Patched1的DNMT3A表觀遺傳沉默是心肌纖維化中成纖維細(xì)胞增殖的機(jī)制。容量負(fù)荷誘導(dǎo)的心衰小鼠心臟中的DNMT1水平上調(diào)，TIMP4表達(dá)下調(diào)，相應(yīng)的，MMP9的表達(dá)也上調(diào)，使ECM蛋白產(chǎn)生與降解失衡[13]。低劑量5-AZA可以減輕壓力負(fù)荷小鼠心臟纖維化，血管周圍膠原蛋白含量顯著降低，這種膠原沉積的減少反映在心臟膠原蛋白Ⅰ和膠原蛋白Ⅲ mRNA水平的減少，雖然射血分?jǐn)?shù)無(wú)差異，但是心臟舒張功能得到明顯改善[14]。

雖然5-AZA已獲監(jiān)管部門(mén)批準(zhǔn)用于血液系統(tǒng)惡性腫瘤的治療，但其在臨床腫瘤中的治療與多種副作用有關(guān)。這些不良反應(yīng)包括胃腸道不適、體重減輕和骨髓抑制等。另有一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)5-AZA 治療的4例腫瘤病例(既往有心血管疾病史)出現(xiàn)射血分?jǐn)?shù)改變和心衰癥狀，但是該研究并未確定所報(bào)道的心臟不良事件是由5-AZA治療引起的還是與本身的疾病過(guò)程有關(guān)[15]。因?yàn)榈蛣┝?-AZA比骨髓增生異常綜合征和急性髓系白血病患者的臨床給藥劑量低5倍，5-AZA對(duì)體重?zé)o影響，耐受性良好[14]。自發(fā)性高血壓大鼠經(jīng)5-AZA治療后，血管周圍膠原蛋白水平也顯著降低，5-AZA處理的人心室心臟成纖維細(xì)胞膠原蛋白Ⅰ、膠原蛋白Ⅲ和α-SMA表達(dá)減少[16]。此外，DNMT抑制劑RG108可以通過(guò)下調(diào)肌漿內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+-ATP酶2α(sarco/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase 2α，SERCA2α)和β2-腎上腺素受體，減輕主動(dòng)脈弓縮窄誘導(dǎo)的大鼠心肌纖維化[17]。CRISPR/Cas9介導(dǎo)的DNMT3A缺失小鼠在血管緊張素Ⅱ刺激后心功能進(jìn)一步下降，心腎纖維化程度更嚴(yán)重[18]。在肺動(dòng)脈高壓中，右心室成纖維細(xì)胞DNMT1表達(dá)上調(diào)，DNMT3A和DNMT3B無(wú)變化。右心室成纖維細(xì)胞通過(guò)DNMT1-HIF1α-丙酮酸脫氫酶激酶(pyruvate dehydrogenase kinase，PDK)促進(jìn)膠原合成和右心室纖維化。這種表觀遺傳線粒體代謝途徑也是一個(gè)潛在的抗纖維化治療靶點(diǎn)[19]?？傊?，上述研究結(jié)論并不一致，即使在壓力負(fù)荷誘導(dǎo)的心臟纖維化中，DNMTs各亞型的作用仍具有不確定性，而針對(duì)DNMTs的各種治療方法也成為潛在的候選者。

3.糖尿病性心肌病：糖尿病是心血管疾病一個(gè)危險(xiǎn)因素，糖尿病心肌病后期也存在嚴(yán)重的心臟纖維化。在一項(xiàng)糖尿病隨訪研究中，無(wú)論是糖尿病還是非糖尿病，心血管疾病的發(fā)生均與DNA甲基化有關(guān)，但兩者DNA甲基化修飾存在差異[20]。研究發(fā)現(xiàn)糖尿病心肌纖維化組織中DNMT1表達(dá)增加，然而DNMT3A和DNMT3B保持不變[21]。Tao等[22]研究也發(fā)現(xiàn)DNMT1在高糖誘導(dǎo)的心臟成纖維細(xì)胞中的表達(dá)增加，而且DNMT1介導(dǎo)的SOCS3啟動(dòng)子高甲基化，導(dǎo)致SOCS3在糖尿病心肌纖維化中的表達(dá)下調(diào)，進(jìn)而促進(jìn)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)活化，促進(jìn)心臟成纖維細(xì)胞活化和膠原沉積。基因或藥理學(xué)失活的DNMT1逆轉(zhuǎn)心臟成纖維細(xì)胞的激活表型。

在糖尿病心肌病患者心臟中，同樣觀察到DNMT1與SOCS3表達(dá)水平負(fù)相關(guān)，DNMT1表達(dá)增加和SOCS3表達(dá)缺失。血清同型半胱氨酸濃度升高是糖尿病性心臟纖維化的危險(xiǎn)因素，雄激素受體的DNMT1甲基化觸發(fā)了同型半胱氨酸誘導(dǎo)的心臟成纖維細(xì)胞自噬損傷。然而，也有研究顯示，在鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病中，盡管心臟各細(xì)胞基因表達(dá)發(fā)生了顯著變化，但DNA甲基化仍保持穩(wěn)定[23]。心臟外的甲基化也有可能參與糖尿病心肌病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程，超氧化物歧化酶模擬物B12通過(guò)調(diào)節(jié)肝臟DNMTs及SOCS 1/3來(lái)激活肝臟胰島素樣生長(zhǎng)因子1(insulin like growth factor-1，IGF-1)的產(chǎn)生以及抑制氧化應(yīng)激，減少心臟纖維化面積，增強(qiáng)心臟保護(hù)作用[24]。以上研究說(shuō)明，在糖尿病心肌病中，除了心臟的DNMTs直接參與心臟纖維化，其他器官的DNA甲基化也可能對(duì)心臟纖維化產(chǎn)生影響。

4.其他心血管疾?。涸谥嗵谴碳は拢呐K成纖維細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白Caspase 1和NLRP3以及DNMT1表達(dá)增加，lncRNA GAS5的DNMT1甲基化通過(guò)NLRP3導(dǎo)致心臟成纖維細(xì)胞焦亡[25]。阿霉素誘導(dǎo)的心臟損傷中，DNMT1的表達(dá)上調(diào)，使用CRISPR/cas9技術(shù)特異性敲除心臟DNMT1可改善心臟纖維化。DNA甲基化是生物衰老的強(qiáng)大決定因素，隨著年齡的增長(zhǎng)，成年大鼠心臟中DNMT1表達(dá)明顯下調(diào)[26]。但有研究顯示,隨著年齡增長(zhǎng)小鼠心臟成纖維細(xì)胞的甲基化狀態(tài)在14周齡之后沒(méi)有明顯變化，心臟成纖維細(xì)胞在增殖、膠原表達(dá)或DNA甲基化方面沒(méi)有表現(xiàn)出年齡依賴性的增加[27]。這說(shuō)明年齡相關(guān)的心臟纖維化增加，不能直接歸因于成纖維細(xì)胞增殖的改變或ECM基因表達(dá)的增加。DNMTs參與各種心血管疾病的心臟纖維化，這為心臟纖維化的機(jī)制研究提供了更多見(jiàn)解。

三、DNMTs作為標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)的研究進(jìn)展

DNMTs是心臟纖維化研究和治療中的一個(gè)新領(lǐng)域。DNA甲基化可用作疾病的生物學(xué)標(biāo)志物。在一項(xiàng)全表觀基因組關(guān)聯(lián)研究中，729例心腦血管病患者血液樣本中存在特異性DNA甲基化改變。在急性心肌梗死患者的211個(gè)CpG位點(diǎn)上發(fā)現(xiàn)了不同的DNA甲基化，其中42例與心血管功能、心肌發(fā)育和缺血性損傷反應(yīng)相關(guān)的基因有關(guān)[28]。盡管DNMTs抑制劑已獲批準(zhǔn)用于不同器官的纖維化疾病，但將這些藥物用于治療心臟纖維化仍存在重大挑戰(zhàn)。5-AZA處理的小鼠DNMT1和DNMT3B基因表達(dá)顯著下調(diào)，而DNMT3A水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是5-AZA導(dǎo)致DNMT1和DNMT3B表達(dá)降低的機(jī)制尚不明確[14]。

肼苯噠嗪對(duì)心臟也具有保護(hù)作用，部分與抑制DNMT1活性有關(guān)，DNMT1活性可降低SERCA2a啟動(dòng)子的甲基化程度，調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞的鈣穩(wěn)態(tài)。此外，肼苯噠嗪還能誘導(dǎo)TET3，促進(jìn)RASAL1啟動(dòng)子去甲基化[29]。因此，肼苯噠嗪可同時(shí)靶向DNMT和TET3，有潛力成為治療心肌纖維化的一種新的非核苷酸表觀遺傳藥物。CRISPR/Cas9是重要的基因編輯工具，在抗纖維化研究中，CRISPR/Cas9可用于恢復(fù)TET3的表達(dá)，以RASAL1和Klotho甲基化的啟動(dòng)子為靶點(diǎn)減少纖維化[30]。總之，DNMTs不僅可作為心臟纖維化的生物學(xué)標(biāo)志物，其抑制劑還可通過(guò)調(diào)控纖維化相關(guān)基因的甲基化發(fā)揮心臟保護(hù)作用。

四、展 望

綜上所述，DNMTs在心臟纖維化過(guò)程中參與了成纖維細(xì)胞的增殖和分化，以及ECM蛋白的產(chǎn)生和降解，為心臟纖維化的診斷和治療提供了新的策略。臨床研究已發(fā)現(xiàn)DNA甲基化與心血管疾病具有相關(guān)性，提示DNMTs可能作為心臟纖維化的診斷和預(yù)后指標(biāo)。心臟纖維化目前尚無(wú)有效的治療方法，DNMTs各亞型在心臟纖維化中發(fā)揮不同的作用，相關(guān)具體機(jī)制仍需進(jìn)一步探索。雖然DNMTs同時(shí)具有促纖維化和抗纖維化作用，但是DNMTs抑制劑對(duì)心臟纖維化始終產(chǎn)生有益作用，其作用機(jī)制仍不明確，也許開(kāi)發(fā)針對(duì)DNMTs亞型的特異性抑制劑是另一治療心臟纖維化的有效方法?？偠灾?，以DNA甲基化過(guò)程尤其是DNMTs作為靶點(diǎn)在心臟纖維化及心血管疾病中具有巨大的潛力，相關(guān)領(lǐng)域的研究也越來(lái)越多，經(jīng)過(guò)不斷地探索研究，相信能夠在理解心血管疾病發(fā)生機(jī)制及其治療方法中，發(fā)揮重要作用。