陳娜 陳文燕 崔恩海

新冠病毒感染后，免疫系統(tǒng)被過度激活時(shí)會(huì)生成大量的炎癥因子，導(dǎo)致嚴(yán)重的細(xì)胞因子風(fēng)暴。細(xì)胞因子風(fēng)暴可導(dǎo)致肺及多器官損傷，繼而出現(xiàn)肺水腫、換氣功能障礙、急性肺損傷、急性呼吸窘迫綜合征、急性心臟損傷和繼發(fā)感染，最終導(dǎo)致患者死亡。間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)是一類多潛能組織干細(xì)胞，在抗炎、再生、免疫調(diào)節(jié)等方面有著巨大潛力，能夠通過直接接觸或旁分泌多種細(xì)胞因子的方式調(diào)節(jié)免疫，適時(shí)抑制過激免疫反應(yīng)，抑制細(xì)胞因子風(fēng)暴，同時(shí)具有促進(jìn)損傷組織恢復(fù)的能力。MSCs靜脈輸注在治療急性呼吸窘迫綜合征、急性肺損傷、重癥肺炎上已被證實(shí)具有良好的安全性和有效性，在治療新型冠狀肺炎的臨床試驗(yàn)也已經(jīng)廣泛開展。本文就MSCs用于控制新冠肺炎細(xì)胞因子風(fēng)暴的情況作出綜述，提供進(jìn)一步臨床研究參考信息。

對新冠肺炎的炎癥因子風(fēng)暴與間充質(zhì)干細(xì)胞治療可行性認(rèn)識

自去年12月以來，新型冠狀病毒(COVID-19)在全球傳播迅速，造成了毀滅性的大流行，嚴(yán)重危害人們的健康。新型冠狀病毒肺炎，簡稱為“新冠肺炎”，輕者可表現(xiàn)為急性自限性癥狀，如發(fā)熱、乏力、干咳、流涕等，重者可出現(xiàn)急性呼吸窘迫綜合征(Acute Respiratory Distress Syndrome, ARDS)、膿毒癥休克、出凝血功能障礙以及多器官功能障礙綜合征(Multiple Organ Dysfunction Syndrome，MODS)甚至死亡等[1]，目前尚無確切效果的可用于治療和控制COVID-19的預(yù)防性疫苗或有效抗病毒藥，主要采用對癥和支持療法。COVID-19具有獨(dú)特的免疫病理學(xué)[2]，重癥COVID-19患者外周血CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞的數(shù)量常顯著減少，部分患者免疫系統(tǒng)因感染、藥物、自身免疫疾病等因素過度激活時(shí)，免疫細(xì)胞就會(huì)應(yīng)激過度，產(chǎn)生過多的細(xì)胞因子會(huì)導(dǎo)致正反饋循環(huán)從而出現(xiàn)細(xì)胞因子風(fēng)暴綜合征(Cytokine Storm Syndrome，CSS)，開始促炎性細(xì)胞因子(IFN-α，TNF-γ，IL-1β，IL-6，IL-12，IL-8，IL-33)和TGF-β的分泌增加，進(jìn)而發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合征，全身性炎癥反應(yīng)綜合征(Systemic Inflammatory Response Syndrome , SIRS)，多器官功能障礙綜合征，導(dǎo)致全身性衰弱性疾病患者的死亡率增加。HUANG等[3]在SARS-CoV-2感染病例首批臨床數(shù)據(jù)中的危重病人中可見細(xì)胞因子風(fēng)暴的發(fā)生。細(xì)胞因子風(fēng)暴是新冠肺炎患者輕癥向重癥和危重癥轉(zhuǎn)換的一個(gè)重要節(jié)點(diǎn)，有助于新冠肺炎的臨床分型以及預(yù)測發(fā)展的嚴(yán)重程度，并提供潛在的治療靶標(biāo)[4]。細(xì)胞療法已經(jīng)成為現(xiàn)代研究的重點(diǎn)領(lǐng)域。

間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)又稱為多能間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞，來源于胚胎發(fā)育早期的中胚層，MSCs可以進(jìn)行體外擴(kuò)增和自我更新，有損傷組織的趨化性及低免疫原性的特點(diǎn)，并且具有免疫調(diào)節(jié)功能，在臨床試驗(yàn)中獲得廣泛關(guān)注。Meng[5]等主導(dǎo)的間充質(zhì)干細(xì)胞治療新冠肺炎臨床試驗(yàn)初步證明，臍帶血來源的MSCs(Umbilical Cord- Mesenchymal Stem Cells, UC-MSCs)用于治療新冠肺炎患者安全且耐受。多項(xiàng)臨床研究表明，通過間充質(zhì)干細(xì)胞治療可改善新冠肺炎患者的呼吸功能和預(yù)后，為臨床治療提供了一個(gè)可行的方向[6]?；谀壳把芯繝顩r，現(xiàn)將進(jìn)一步探討MSCs用于治療COVID-19的潛在作用機(jī)制以及評估其在臨床試驗(yàn)中的可行性，以期提供MSCs潛在治療價(jià)值的參考信息。

間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)及抑制炎癥細(xì)胞因子風(fēng)暴作用機(jī)制

MSCs在免疫調(diào)節(jié)和抗炎信號轉(zhuǎn)導(dǎo)方面的特性特別適合用于重癥COVID-19治療，主要是通過免疫細(xì)胞激活免疫應(yīng)答，并參與非特異性免疫調(diào)節(jié)和特異性免疫調(diào)節(jié)。由于危重癥患者的免疫過度激活與免疫抑制轉(zhuǎn)化迅速，間充質(zhì)干細(xì)胞能夠通過直接接觸或旁分泌多種細(xì)胞因子調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞[7-8]，適時(shí)抑制過激免疫反應(yīng)，保護(hù)肺泡功能，降低新冠肺炎患者肺臟和全身臟器損傷。

一、非特異性免疫應(yīng)答和SARS-CoV-2感染

1 中性粒細(xì)胞與MSCs

COVID-19患者隨著病情進(jìn)展白細(xì)胞計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞百分比、絕對中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞與淋巴細(xì)胞比值(Neutrophil to Lymphocyte Ratio, NLR)逐漸增加[9]。在COVID-19患者肺部標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)肺毛細(xì)血管及肺泡腔中存在著中性粒細(xì)胞浸潤[10]。且患者支氣管肺泡灌洗液中，中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)被證實(shí)與COVID-19的嚴(yán)重程度和細(xì)胞因子風(fēng)暴呈正相關(guān)。NLR升高與COVID-19患者的不良臨床特征和死亡相關(guān)，并被確定為重癥COVID-19患者感染的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[11]。MSCs可與中性粒細(xì)胞相互作用，通過IL-6介導(dǎo)抑制靜止期，中性粒細(xì)胞的凋亡，通過IL-8和巨噬細(xì)胞遷移抑制因子(Macrophage migration Inhibitory Factor, MIF)募集中性粒細(xì)胞[12]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞衍生的外泌體被證實(shí)可以顯著減少重癥COVID-19急性呼吸窘迫綜合征患者中性粒細(xì)胞的產(chǎn)生[13]，減少了免疫復(fù)合物介導(dǎo)的血管炎的血管破壞和出血。中性粒細(xì)胞可以在早期以趨化作用到達(dá)感染部位，通過活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS)的氧化爆發(fā)和吞噬作用殺死病原體。而MSCs能抑制氧化性爆炸誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞死亡和過氧化物酶/蛋白酶溢出，還可以減少中性粒細(xì)胞胞外殺菌網(wǎng)絡(luò)(Neutrophil Extracellular Traps , NETs)的形成[14]和吞噬中性粒細(xì)胞。NETs在COVID-19疾病的免疫病理學(xué)中，起著核心作用，針對NETs的治療可降低COVID-19的臨床嚴(yán)重性和死亡率[10]。MSCs在保留了中性粒細(xì)胞的基本功能的同時(shí)，防止氧化代謝的過度或不適當(dāng)激活，從而在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮保護(hù)作用，中性粒細(xì)胞可能是重癥COVID-19患者免疫病理并發(fā)癥的靶標(biāo)。

2 抗原呈遞細(xì)胞與MSCs

樹突狀細(xì)胞(Dendritic Cells, DC)是主要的抗原呈遞細(xì)胞，可橋接非特異性免疫應(yīng)答和特異性免疫應(yīng)答。Yang等[15]證實(shí)COVID-19患者肺部感染的DC可能是產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子的來源，通過平衡Th1 / Th2反應(yīng)和調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的產(chǎn)生進(jìn)而影響疾病進(jìn)展。MSCs可以在PGE2的介導(dǎo)下抑制DC的早期成熟[16]。另外，MSCs可以通過jagged1/Notch途徑[17]，或肝細(xì)胞生長因子(HGF)/ Akt途徑[18]誘導(dǎo)成熟的DC(mDC)分化為低表達(dá)CD80和CD86的調(diào)節(jié)性DC(DCreg)，從而減輕肺部急性的病理損傷。巨噬細(xì)胞是抗原呈遞的重要組成部分，可分為M1型巨噬細(xì)胞、M2型巨噬細(xì)胞，前者可產(chǎn)生各種促炎因子來對抗與組織再生相關(guān)的病原體，后者可產(chǎn)生IL-10發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。在COVID-19早期到晚期病例中，SARS-CoV-2感染引起的局部炎癥的發(fā)生會(huì)激活該部位的巨噬細(xì)胞，迅速擴(kuò)散到整個(gè)肺部。冠狀病毒S蛋白，通過在體外激活NF-κB途徑誘導(dǎo)人單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的非特異性免疫應(yīng)答[19]，巨噬細(xì)胞可通過炎癥因子影響單核細(xì)胞，中性粒白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等，成為細(xì)胞因子風(fēng)暴的關(guān)鍵細(xì)胞[20]。而MSCs可以分泌TSG-6因子和IL-10來抑制NF-κB信號傳導(dǎo)通路和其他促炎途徑，還可以調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化，使M1型巨噬細(xì)胞分化為M2型巨噬細(xì)胞[21]，導(dǎo)致高水平的抗炎因子和低水平的促炎因子，通過增加IL-10以及減少TNF-α和IL-6的產(chǎn)生從而抑制炎癥進(jìn)展并促進(jìn)已受損組織的愈合。單核細(xì)胞在非特異性免疫應(yīng)答中是重要效應(yīng)器和調(diào)節(jié)劑，當(dāng)肺損傷時(shí)，單核細(xì)胞在短時(shí)間內(nèi)優(yōu)先遷移至肺部炎癥部位，并促進(jìn)中性粒細(xì)胞募集和放大肺損傷，最終分化為DC和巨噬細(xì)胞[22]。在重癥COVID-19患者中，單核細(xì)胞可能在細(xì)胞因子風(fēng)暴病理過程中發(fā)揮著重要作用。MSCs被發(fā)現(xiàn)可以干擾單核細(xì)胞向DC和巨噬細(xì)胞的分化，進(jìn)而在吞噬作用和抗原呈遞過程中起著抑制作用[23]。

3 自然殺傷細(xì)胞與MSCs

自然殺傷(Natural Killer, NK)細(xì)胞在非特異性免疫應(yīng)答中發(fā)揮清除病毒和控制病毒感染的功能。COVID-19感染患者的支氣管肺泡灌洗液所含NK細(xì)胞的比例為中度感染明顯高于健康者，重度卻低于輕中度感染，康復(fù)期高于活動(dòng)期，表明NK細(xì)胞的免疫狀態(tài)在一定程度上與COVID-19患者疾病的嚴(yán)重程度和預(yù)后相關(guān)[24]。體外高比例NK細(xì)胞與MSCs直接共培養(yǎng)時(shí)，MSCs不會(huì)影響NK細(xì)胞系的增殖，但會(huì)差異性調(diào)控NK細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ[25]。而NK細(xì)胞分泌IFN-γ可以激活MSCs從而發(fā)揮抗炎作用[26]。Ghanavatinejad等[27]證實(shí)月經(jīng)血來源的MSCs可調(diào)節(jié)NK細(xì)胞的分化。MSCs與NK細(xì)胞相互作用復(fù)雜，主要包括三個(gè)機(jī)制：(1)細(xì)胞之間直接的細(xì)胞間接觸； (2)釋放外泌體，細(xì)胞因子(IFN-γ，TGF-β，IL-1等)和activin A等可溶性因子； (3)通過調(diào)節(jié)其他細(xì)胞(例如調(diào)節(jié)性T細(xì)胞)的間接作用。在將NK細(xì)胞作為治療靶點(diǎn)的相關(guān)疾病中，MSCs細(xì)胞具有作為治療工具的巨大潛力，可能會(huì)引發(fā)更具體、更理想的治療結(jié)果，在明確的條件下進(jìn)行進(jìn)一步的研究是非常必要的。

4 肥大細(xì)胞與MSCs

肥大細(xì)胞是非特異性免疫應(yīng)答重要的前哨細(xì)胞，同時(shí)在促進(jìn)血栓形成和其他并發(fā)癥方面發(fā)揮重要作用。此外，在COVID-19患者中發(fā)生的高炎癥性細(xì)胞因子風(fēng)暴(Hyperinflammatory cytokine storms，HCS)可能源于SARS-CoV-2釋放組胺，增加IL-1水平，引起克隆性肥大細(xì)胞的功能失調(diào)引起的非典型反應(yīng)[28]。Afrin等[29]初步發(fā)現(xiàn)COVID-19患者使用針對肥大細(xì)胞或其介體的藥物是有效的，MSCs對肥大細(xì)胞募集和脫粒不起作用[30]，但分泌出的轉(zhuǎn)化生長因子-β(Transforming Growth Factor-β, TGF-β)可調(diào)節(jié)肥大細(xì)胞中的TNF-α，進(jìn)而調(diào)節(jié)免疫[31]。

二、特異性免疫應(yīng)答和SARS-CoV-2感染

1 T淋巴細(xì)胞與MSCs

CD4+T淋巴細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞減少也是COVID-19患者的顯著特征，影響COVID-19的疾病嚴(yán)重程度和死亡率主要是CD8+T淋巴細(xì)胞，導(dǎo)致Th1/Th2不平衡[32]，而免疫系統(tǒng)因細(xì)胞因子風(fēng)暴異常激活和失調(diào)進(jìn)而出現(xiàn)嚴(yán)重的免疫失衡。MSCs可以通過TGF-β和肝細(xì)胞生長因子(Hepatocyte Growth Factor, HGF)抑制G1期T細(xì)胞的增殖，也可以通過NKG2D途徑抑制異常激活的Th1細(xì)胞，恢復(fù)Th1 / Th2平衡。MSCs直接或間接抑制T細(xì)胞的活化，誘導(dǎo)IL-10的產(chǎn)生并抑制IFN-γ、TNF-α和IL-17的分泌，并上調(diào)IL-4的分泌，負(fù)反饋調(diào)節(jié)多種T細(xì)胞亞型的功能來改善特異性免疫狀態(tài)[33], 不同T細(xì)胞在未暴露的供體中靶向非結(jié)構(gòu)性區(qū)域(ORF1的NSP-7和NSP13)以及核衣殼蛋白(NP)的多個(gè)區(qū)域，從而使體內(nèi)環(huán)境從促炎狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榭寡谞顟B(tài)。

2 B淋巴細(xì)胞與MSCs

B淋巴細(xì)胞在COVID-19感染期間患者體內(nèi)抗體的產(chǎn)生和特異性免疫調(diào)節(jié)至關(guān)重要。COVID-19患者中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)增加，在炎癥環(huán)境下釋放可溶性BAFF，而BAFF水平與B淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)呈正相關(guān)[34]。B淋巴細(xì)胞被激活成漿細(xì)胞后分泌的抗體可以結(jié)合SARS-CoV-2結(jié)構(gòu)蛋白S蛋白和N蛋白[35]，并以高免疫原性與S蛋白S1亞基結(jié)合潛在中和并阻止病毒與ACE2受體之間的相互作用[36]。MSCs可以抑制B淋巴細(xì)胞增殖，向漿細(xì)胞的分化以及分泌抗體，還可以誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性B細(xì)胞，進(jìn)而產(chǎn)生IL-10，從而發(fā)揮抗炎作用[37]。

MSCs治療COVID-19的可行性分析

目前有72項(xiàng)評估MSCs治療新型冠狀肺炎的安全性和有效性的臨床試驗(yàn)在美國國立衛(wèi)生研究院網(wǎng)登記注冊(https://clinicaltrials.gov)，并且其中30項(xiàng)已處于完成狀態(tài)。MSCs用于新冠肺炎患者治療的相關(guān)研究仍處于摸索階段，Hashemian等[38]的1期臨床試驗(yàn)結(jié)果表明，多次、大劑量輸注同種異體產(chǎn)前來源(臍帶血與胎盤來源)的間充質(zhì)干細(xì)胞是安全的，Meng等[5]的一項(xiàng)1期臨床試驗(yàn)中未觀察到嚴(yán)重的人臍帶血來源的間充質(zhì)干細(xì)胞UC-MSCs輸注相關(guān)不良事件，表明靜脈輸注UC-MSCs是安全的，中、重度新冠肺炎患者耐受性良好。最近，Shi等[39]在一項(xiàng)對100名重癥新冠肺炎患者的隨機(jī)、雙盲、對照的2期臨床試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，UC-MSCs治療新冠肺炎所致的肺損傷是一種安全且潛在有效的治療方法。

SARS-CoV-2通過表面的S蛋白與靶細(xì)胞的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2受體(ACE2)作用，從而感染細(xì)胞[40]。當(dāng)患者的免疫系統(tǒng)為殺死病毒而被過度激活時(shí)，會(huì)生成大量的炎癥因子，導(dǎo)致嚴(yán)重的細(xì)胞因子風(fēng)暴[3]，造成嚴(yán)重的器官損傷甚至死亡。避免細(xì)胞因子風(fēng)暴可能是治療CoV-19感染患者的關(guān)鍵之一。

MSCs在抗炎、再生、免疫調(diào)節(jié)等方面有著巨大潛力，能通過直接接觸或旁分泌多種細(xì)胞因子調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞[7]，包括中性粒細(xì)胞[12]、樹突狀細(xì)胞[15, 17]、巨噬細(xì)胞[21]、單核細(xì)胞[41]、自然殺傷細(xì)胞[25, 26]、肥大細(xì)胞[28, 31]等非特異性免疫應(yīng)答途徑和T淋巴細(xì)胞[42]、B淋巴細(xì)胞等特異性免疫應(yīng)答途徑。值得一提的是，Leng等[6]的研究發(fā)現(xiàn)，MSCs的ACE-2受體和TMPRSS2表達(dá)均為陰性，表明MSCs對SARS-CoV-2有著天然的免疫力，這一點(diǎn)提示MSCs治療新冠肺炎有著廣闊前景。

MSCs能夠通過直接接觸或旁分泌多種細(xì)胞因子調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞，抑制細(xì)胞因子風(fēng)暴，保護(hù)肺泡功能，降低新冠肺炎患者肺臟和全身臟器損傷，改善重癥新冠肺炎患者的身體情況[5, 38]。MSCs還可以通過旁分泌、細(xì)胞外囊泡的轉(zhuǎn)移或細(xì)胞與細(xì)胞的接觸，促進(jìn)上皮和內(nèi)皮細(xì)胞的恢復(fù)，促進(jìn)微生物和肺泡液的清除[43]。

綜上所述，間充質(zhì)干細(xì)胞的治療可以考慮作為控制新冠肺炎細(xì)胞因子風(fēng)暴的策略之一。需要注意的是，這些臨床試驗(yàn)存在一些局限性。首先，多數(shù)試驗(yàn)樣本數(shù)量較小，可能存在誤差，結(jié)論可靠性存疑。其次，部分臨床試驗(yàn)迫于情況緊急、捐獻(xiàn)來源減少等情況，起用冷凍庫存的間充質(zhì)干細(xì)胞，其活力同新鮮來源的間充質(zhì)干細(xì)胞可能存在差異。最后，還需要進(jìn)行相關(guān)的3期試驗(yàn)，以進(jìn)一步評估MSCs用于預(yù)防新冠肺炎患者長期肺部殘疾、降低其死亡率的效果以及探究MSCs治療COVID-19疾病的潛在機(jī)制。