戎玉蘭，史成梅，郭向陽(yáng)

(北京大學(xué)第三醫(yī)院 麻醉科， 北京 100191)

DNA損傷在發(fā)育-衰老、神經(jīng)退行性疾病以及腫瘤等病生理過程中發(fā)揮著重要的作用。近來很多研究發(fā)現(xiàn)，腦細(xì)胞DNA損傷和修復(fù)之間的失衡會(huì)造成神經(jīng)元損傷，并影響多種神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生發(fā)展。多種內(nèi)源和外源性因素會(huì)造成DNA損傷。不同刺激引起不同的DNA損傷類型，主要有堿基錯(cuò)配、堿基缺失、DNA單/雙鏈斷裂、DNA交聯(lián)等，其中雙鏈斷裂(double-strand break,DSB)是最有害的一種損傷[1]。每個(gè)細(xì)胞每天大約會(huì)經(jīng)歷10 000次單鏈斷裂損傷和10～50次DSB。如果DSB沒有被修復(fù)或錯(cuò)誤修復(fù)的話，會(huì)直接導(dǎo)致細(xì)胞死亡。DSB可通過兩種途徑進(jìn)行修復(fù)[2]：同源重組(homologous recombination,HR)和非同源末端連接(nonhomolog-ous ending joining,NHEJ)。增殖期細(xì)胞可以借助姐妹染色體通過HR進(jìn)行精確修復(fù)DSB，而有絲分裂期后細(xì)胞中的DSB則主要通過NHEJ修復(fù)[3]。有效的修復(fù)對(duì)于維持神經(jīng)元功能至關(guān)重要，并且編碼DNA修復(fù)蛋白的基因與神經(jīng)退行性疾病存在千絲萬縷的聯(lián)系[4]。

圍術(shù)期認(rèn)知功能障礙(perioperative cognitive dysfunction,POCD)是一種常見的手術(shù)麻醉并發(fā)癥，以記憶、注意力、語(yǔ)言理解和社交能力的損傷為特征，可導(dǎo)致患者生活質(zhì)量下降，延長(zhǎng)住院周期、增加病死率，在老年人中的發(fā)病率高達(dá)25%～40%[5]，發(fā)生機(jī)制包括神經(jīng)炎性反應(yīng)、病理蛋白沉積、突觸功能障礙、線粒體功能障礙、DNA損傷與修復(fù)失衡、持續(xù)的腦損傷等，其中，DNA損傷及修復(fù)失衡是極其重要的一種機(jī)制。本文將以DNA損傷修復(fù)過程中主要參與蛋白質(zhì)的功能為重點(diǎn)闡明NHEJ修復(fù)機(jī)制，并簡(jiǎn)介其在POCD中的意義。

1 NHEJ的基本過程

NHEJ修復(fù)DSB的過程包括識(shí)別、聯(lián)會(huì)、末端加工和連接。DSB發(fā)生后，Ku異源二聚體(Ku70/Ku80)最先反應(yīng)，它快速識(shí)別斷端并通過環(huán)狀結(jié)構(gòu)與斷端結(jié)合，直接或間接招募NHEJ所需下游蛋白。同時(shí)Ku70/Ku80會(huì)迅速招募下游DNA蛋白激酶(DNA-dependent protein kinase catalytic submits,DNA-PKcs)至斷端，形成DNA-Ku-PKcs三元復(fù)合物，穩(wěn)定斷端，并進(jìn)行聯(lián)會(huì)。接著核酸酶Artemis被DNA-PKcs募集到DSB位點(diǎn)，剪切斷端形成適合連接的結(jié)構(gòu)。最后需要Ligase Ⅳ-XRCC4復(fù)合體、XLF和PAXX執(zhí)行連接功能。

2 NHEJ的主要參與蛋白

2.1 Ku：快速識(shí)別蛋白

Ku二聚體由Ku70和Ku80組成，由基因XRCC6和XRCC5編碼，根據(jù)來源患者的姓名首字母和蛋白質(zhì)的大小(70 ku和83 ku)命名。首次發(fā)現(xiàn)是一種自身免疫抗原，其與DSB斷端有高度親和性[6]。兩個(gè)蛋白含有相同的核心結(jié)構(gòu)和N末端，只有C末端結(jié)構(gòu)不同。它們可以組成穩(wěn)定的環(huán)狀結(jié)構(gòu)套在DSB末端并向內(nèi)滑動(dòng)，通過Ku80 C末端與DNA-PKcs相結(jié)合[7]。Ku70/Ku80在DSB末端的加載是整個(gè)NHEJ修復(fù)過程中至關(guān)重要的一步。它不僅可以像樞紐一樣與下游的修復(fù)蛋白合作，還可以與53BP1共同作用保護(hù)DSB末端免受核酸外切酶的加工[8]，并阻止其他修復(fù)方式的啟動(dòng)，比如HR等，從而起到選擇修復(fù)通路的作用。NHEJ修復(fù)通路的大部分核心蛋白都與Ku產(chǎn)生相互作用[9]。

2.2 DNA-PKcs：穩(wěn)定斷端蛋白

DNA-PKcs分子質(zhì)量高達(dá)469 ku，具有激酶活性。DNA-PKcs的N末端可以形成一個(gè)鉗子樣結(jié)構(gòu)，為DNA提供結(jié)合通道。它與斷端結(jié)合可發(fā)生自磷酸化，或被共濟(jì)失調(diào)-毛細(xì)血管擴(kuò)張突變基因(ataxia telangiectasia-mutated gene，ATM基因)編碼的ATM蛋白激酶或Rad-3相關(guān)蛋白(ATM and Rad-3 related,ATR)磷酸化，也可以磷酸化Artemis并與之結(jié)合，起到促進(jìn)核酸酶活性的作用，其主要作用就是調(diào)節(jié)并加速NHEJ修復(fù)通路[10]。DNA-PKcs不僅在NHEJ修復(fù)通路中發(fā)揮著重要的作用，也參與調(diào)節(jié)DSB位點(diǎn)NHEJ和HR修復(fù)通路的選擇[11]。

2.3 Artemis：末端加工蛋白

被識(shí)別的DNA斷端經(jīng)過加工，才能進(jìn)行下一步的連接，通常參與的蛋白質(zhì)具有多種功能。Artemis具有5′-3′核酸外切酶活性，在體內(nèi)、體外可被ATM、ATR或PKcs等多種蛋白激活，并且在不同的損傷條件下，會(huì)發(fā)生不同的激活途徑。Artemis與PKcs結(jié)合后，PKcs自磷酸化后可激活A(yù)rtemis內(nèi)切酶活性，切割突出末端以及V(J)重組過程中形成的發(fā)夾結(jié)構(gòu)[12]。Artemis不僅是NHEJ修復(fù)通路的重要核酸酶，它同時(shí)也在調(diào)節(jié)細(xì)胞周期以及DNA損傷反應(yīng)中發(fā)揮重要的作用[13]。

2.4 Ligase Ⅳ-XRCC4-XLF復(fù)合體：連接蛋白

Ligase Ⅳ只參與NHEJ修復(fù)通路，需要與XRCC4結(jié)合才能發(fā)揮作用。無論缺乏Ligase Ⅳ還是XRCC4都會(huì)出現(xiàn)對(duì)輻射敏感并且嚴(yán)重?fù)p害NHEJ修復(fù)通路[12]。XLF又稱為Cernunnos，雖然與XRCC同源序列有限，但因與XRCC4結(jié)構(gòu)相似而得名，二者均以二聚體形式存在。在人類細(xì)胞中，只有XLF可與DNA-PKcs相互作用，并與DNA斷端結(jié)合形成核蛋白絲狀結(jié)構(gòu)，起到支架作用，促進(jìn)末端連接[14]。XLF不僅在NHEJ中起到重要作用，還可以穩(wěn)定DNA的復(fù)制過程[15]。

3 NHEJ對(duì)POCD的作用

保持基因的穩(wěn)定性是每一個(gè)細(xì)胞的重要功能，因此每個(gè)細(xì)胞都具有大量高效的修復(fù)蛋白來保證基因穩(wěn)定。當(dāng)DNA損傷不能被修復(fù)或發(fā)生錯(cuò)誤修復(fù)時(shí)，就會(huì)導(dǎo)致進(jìn)行性的或持續(xù)的神經(jīng)損傷，從而影響認(rèn)知或運(yùn)動(dòng)功能[16-17]。研究提示，如果腦中DNA 損傷和修復(fù)失衡，會(huì)造成神經(jīng)元損傷，學(xué)習(xí)和記憶受損，并且被證實(shí)參與了很多神經(jīng)退行性疾病的病理生理過程，比如阿爾茨海默病、帕金森病以及肌萎縮性側(cè)索硬化癥等。POCD是一種與年齡相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病。課題組研究顯示，圍術(shù)期因素可以通過氧化應(yīng)激反應(yīng)，誘導(dǎo)中樞前額葉區(qū)DSB發(fā)生，相關(guān)標(biāo)志物蛋白γH2A.X的表達(dá)顯著增加，并在細(xì)胞核顯著聚集[18]。麻醉暴露還可以抑制中樞海馬區(qū)的P53水平，從而影響DSB程度，P53又可以影響NHEJ修復(fù)通路中的關(guān)鍵因子，從而調(diào)控NHEJ修復(fù)和細(xì)胞存活，另外NHEJ與P53之間也存在相互作用[19]。可見圍術(shù)期因素可以影響DNA損傷和NHEJ修復(fù)之間的動(dòng)態(tài)平衡，從而影響POCD的發(fā)生。

損傷和修復(fù)之間的失衡造成的DSB的積累是影響POCD的核心。減少DSB的發(fā)生，促進(jìn)NHEJ，則成為干預(yù)、治療POCD的新靶點(diǎn)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)通過補(bǔ)充葉酸或S-腺苷甲硫氨酸可以抑制DSB等DNA損傷的發(fā)生。因此，通過抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)等途徑減少DSB的發(fā)生，可以降低POCD的發(fā)生率。對(duì)于脆弱腦細(xì)胞，NHEJ相關(guān)蛋白表達(dá)減少，從而造成DSB積累[20]，故如何促進(jìn)NHEJ成為干預(yù)POCD的難點(diǎn)。

4 NHEJ近期研究進(jìn)展

有關(guān)NHEJ的核心蛋白的研究已經(jīng)很多，但是每個(gè)蛋白的具體工作機(jī)制還有很多需要探究，并且也有很多研究對(duì)NHEJ修復(fù)通路的經(jīng)典過程提出了質(zhì)疑和挑戰(zhàn)。新的研究提示XRCC-XLF是NHEJ修復(fù)通路的新核心蛋白，Ligase IV并不是NHEJ修復(fù)通路的必需蛋白質(zhì)，XLF-XRCC復(fù)合體可以在DSB末端形成袖套結(jié)構(gòu)，并在DNA鏈上滑動(dòng)，成功高效的修復(fù)DSB，不依賴于Ligase IV的存在[21]。細(xì)胞試驗(yàn)提示，與傳統(tǒng)的NHEJ序貫修復(fù)過程相反，在損傷初期，DSB位點(diǎn)就會(huì)形成一個(gè)超級(jí)NHEJ復(fù)合體，其中包括DNA-Ku-PKcs和連接蛋白，這些蛋白既可以獨(dú)立發(fā)揮作用，也可以相互促進(jìn)，共同完成修復(fù)[22]。新的NHEJ調(diào)節(jié)復(fù)合物Shieldin(REV7、RINN1、RINN2、RINN3新型復(fù)合體)在2018年由多個(gè)課題組鑒定發(fā)現(xiàn)，它與CTC1-STN1-TEN1(CST)復(fù)合物相互作用，通過抑制DNA末端切除，促進(jìn)NHEJ修復(fù)[23]。這些研究大大豐富了對(duì)NHEJ的認(rèn)識(shí)。

5 問題與展望

雖然對(duì)于NHEJ修復(fù)通路的核心蛋白和機(jī)制已經(jīng)研究的比較清楚，但其精確的作用方式及相互關(guān)系還存在很多空白：1)XRCC和XLF的C末端的結(jié)構(gòu)還不是很清楚，在NHEJ中如何起到穩(wěn)定作用？2)超級(jí)NHEJ復(fù)合體是否真的存在？3)POCD中，NHEJ修復(fù)通路是否受損？如何從修復(fù)角度進(jìn)行干預(yù)，以影響POCD的發(fā)生和發(fā)展？

解決以上問題，需要結(jié)合蛋白組學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、有機(jī)化學(xué)等相關(guān)知識(shí)，深入研究NHEJ修復(fù)通路中的相關(guān)蛋白的空間結(jié)構(gòu)，以及相互作用的順序與位點(diǎn)，探究NHEJ修復(fù)通路分子機(jī)制中的空白和疑惑。應(yīng)用細(xì)胞、動(dòng)物模型研究P53、γH2A.X等關(guān)鍵因子與NHEJ修復(fù)通路的相互作用，從而揭示DSB和NHEJ之間相互影響的分子機(jī)制。并開展相關(guān)臨床研究，探究脆弱腦功能患者的體液中，NHEJ修復(fù)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，以期能以NHEJ為核心，找到圍術(shù)期認(rèn)知功能障礙的干預(yù)新靶點(diǎn)。