王榕林 馬珮翔 花 蕾 楊 成 郭永東 李俊強 蘇海川

空軍軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院腫瘤科，陜西西安 710038

鐵死亡作為一種新型細胞死亡方式，其誘因主要包括細胞內(nèi)異常的鐵代謝、脂質(zhì)代謝及谷胱甘肽代謝過程[1]。不同于凋亡自噬及壞死，鐵死亡細胞線粒體體積變小，線粒體嵴減少及線粒體膜密度增高。腫瘤浸潤淋巴細胞（tumor-infiltrating lymphocyte，TIL）是腫瘤免疫微環(huán)境的重要組成部分，其主要包括細胞毒性T 細胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL），樹突狀（dendritic，DC）細胞，自然殺傷（natural killer，NK）細胞，調(diào)節(jié)性T（T regulatory，Treg）細胞，髓源性抑制細胞（myeloid derived suppressor cell，MDSC），以及腫瘤相關巨噬（tumor-associated macrophage，TAM）細胞等細胞類型。既往研究發(fā)現(xiàn)，鐵死亡參與調(diào)控TIL 的增殖、激活及耗竭等生命進程，進而調(diào)節(jié)腫瘤免疫微環(huán)境，影響免疫檢查點抑制劑的療效，最終參與腫瘤發(fā)生和進展[2]。為了進一步理解鐵死亡對TIL 的調(diào)控作用，現(xiàn)對鐵死亡發(fā)生機制及其在TIL 中的調(diào)節(jié)作用進行綜述，期待能加深對腫瘤發(fā)病機制的理解，同時為增敏腫瘤免疫治療提供新策略。

1 鐵死亡及其發(fā)生機制

2003 年，一種新的化合物Erastin 被發(fā)現(xiàn)可以殺死Ras 基因突變的腫瘤細胞。2008 年，一種類似Erastin的化合物RSL3 可以誘導細胞發(fā)生鐵代謝及氧化應激相關的死亡方式。2012 年，Valashedi 等[3]首次將這種鐵依賴的細胞死亡方式命名為鐵死亡。鐵死亡的發(fā)生機制為胞內(nèi)過載的鐵離子通過芬頓反應生成過量羥基自由基。這些自由基通過過氧化細胞膜上的不飽和脂肪酸，引起細胞膜破裂，導致細胞死亡。同時，細胞自身通過利用谷胱甘肽還原脂質(zhì)過氧化物來抵抗鐵死亡。當胞內(nèi)的谷氨酸-胱氨酸轉運系統(tǒng)及氧化還原功能發(fā)生紊亂時，細胞容易發(fā)生鐵死亡[4]。

1.1 鐵離子代謝影響鐵死亡

食物中的鐵離子在近端小腸被吸收入血[5]。鐵離子在血中與轉鐵蛋白（transferrin，TF）結合。通過與細胞膜表面的轉鐵蛋白受體（transferrin receptor，TFR）結合形成TF-TFR 復合物，鐵離子被轉運入組織細胞內(nèi)[6]。鐵離子可與胞內(nèi)的鐵蛋白（ferritin，F(xiàn)ER）結合形成儲存鐵[7]。游離的鐵離子也可在鐵轉運蛋白（ferroportin，F(xiàn)PN）的協(xié)助下運輸?shù)郊毎狻２±頎顟B(tài)下胞內(nèi)游離Fe2+與過氧化氫反應生成大量羥基自由基。這些羥基自由基過氧化細胞膜磷脂雙分子層上的不飽和脂肪酸，降低細胞膜流動性，引起細胞膜破裂，誘發(fā)細胞發(fā)生鐵死亡[8]。

1.2 脂質(zhì)代謝調(diào)控鐵死亡

細胞膜上含有豐富的多聚不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids，PUFAs），其在維持細胞膜流動性及細胞基本功能中發(fā)揮重要作用。因為PUFAs 上存在雙烯丙基，所以其很容易被氧化[9]。在脂氧化酶家族（lipoxygenases，LOXs），細胞色素P450 氧化還原酶（cytochrome P450 oxidoreductase，POR）及羥基自由基作用下，PUFAs 容易被過氧化，進而誘導細胞發(fā)生鐵死亡[10]。

1.3 谷胱甘肽代謝干預鐵死亡

細胞膜上的Xc-系統(tǒng)主要負責將胞外的胱氨酸和胞內(nèi)谷氨酸以1∶1 的比例分別轉運至胞內(nèi)及胞外。進入胞內(nèi)的胱氨酸經(jīng)過酶促反應最終生成谷胱甘肽[11-12]。在谷胱甘肽過氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）的作用下，谷胱甘肽還原胞內(nèi)的脂質(zhì)過氧化物，減少細胞發(fā)生鐵死亡[13-14]。

2 腫瘤免疫微環(huán)境中的主要免疫細胞

腫瘤免疫微環(huán)境不僅包括腫瘤細胞，還包括免疫細胞、腫瘤相關成纖維細胞（cancer-associated fibroblasts，CAFs）、信號分子和細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）。其中，免疫細胞主要包括CTL 細胞、DC 細胞、NK 細胞、Treg 細胞、MDSC 細胞，以及TAM 細胞。其中，NK 細胞主要在腫瘤早期殺傷腫瘤細胞，是機體預防和殺傷腫瘤的第一道防線。通過其表面的活化受體或抑制性受體識別腫瘤細胞表面非特異性抗原，直接殺傷腫瘤細胞[15]。其次，CD8+T 細胞在抗原呈遞細胞協(xié)助下激活分化為CTL 細胞。CTL 細胞通過分泌穿孔素、顆粒酶等細胞因子，殺傷腫瘤細胞。CTL細胞是殺傷腫瘤的主力免疫細胞。除了抗腫瘤免疫細胞外，機體同樣存在抑制性免疫細胞。Treg 細胞是目前研究最為深入的抑制性免疫細胞之一。通過分泌白細胞介素（interleukin，IL）-10、IL-4 等負性細胞因子，或者通過CTLA4 及轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）等靶標直接與目標免疫細胞結合，抑制目標免疫細胞的增殖與功能，促進腫瘤免疫逃逸[16]。類似于Treg，MDSC 同樣發(fā)揮免疫抑制作用。通過分泌精氨酸酶，活性氧和一氧化氮合成酶抑制CTL 及NK 的功能[17]。TAMs 可以分為M1 型（經(jīng)典型巨噬細胞）和M2 型（替代性活化巨噬細胞）。其中，M1 型在初生腫瘤中水平較高，具有抗腫瘤作用。隨著腫瘤進展，M1 型在腫瘤微環(huán)境中逐漸向M2 型轉化。研究證實M2 型TAMs 促進腫瘤血管生成，發(fā)揮促腫瘤進展作用[18]。

3 鐵死亡對免疫細胞功能及表型的影響

3.1 鐵死亡在CTL 中的免疫調(diào)節(jié)作用

一項研究發(fā)現(xiàn)，免疫檢查點抑制劑激活并誘導CD8+T 細胞分泌γ 干擾素。γ 干擾素負向調(diào)控腫瘤細胞表面Xc-系統(tǒng)組成蛋白SLC3A2 和SLC7A11 的表達，減少胱氨酸的胞內(nèi)運輸和胞內(nèi)谷胱甘肽的生成，加劇胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化水平，促進腫瘤細胞發(fā)生鐵死亡。人為降低腫瘤細胞胱氨酸和半胱氨酸水平，可以協(xié)同增強T 細胞的抗腫瘤作用[19]。另一項研究提示，鐵死亡誘導劑可以增強放療的抗腫瘤效果[20]。過表達GPX4 或FSP1 可以增強CD8+T 細胞對鐵死亡的抵抗性，進而發(fā)揮其抗腫瘤免疫作用[21]。相反，在T 細胞中敲除GPX4，則會加劇T 細胞內(nèi)的脂質(zhì)氧化過程，抑制T 細胞的增殖能力與免疫功能。這些研究證實鐵死亡參與調(diào)控CTL 的活性與功能，且CTL 影響腫瘤細胞的鐵死亡水平。然而，在腫瘤微環(huán)境中，腫瘤細胞和CTL 對鐵死亡的敏感性強弱問題存在爭論。有的研究認為鐵死亡誘導劑可以誘導腫瘤細胞發(fā)生鐵死亡，但對CTL 的影響較小，即鐵死亡誘導劑具有增敏腫瘤免疫治療的效果[22]。然而，也有研究發(fā)現(xiàn)，GPX4 抑制劑在體外模型中可以選擇性誘導CTL 發(fā)生鐵死亡，進而促進腫瘤細胞生存[23]。該問題有待進一步的研究與探索。

3.2 鐵死亡在TAM 中的免疫調(diào)節(jié)作用

TAM 主要分為抗腫瘤的M1 型巨噬細胞和促腫瘤的M2 型巨噬細胞。既往研究證實，M1 型和M2 型對鐵死亡的敏感性不同。相較于M2 型，M1 型巨噬細胞表達更高的誘導性一氧化氮合成酶，并生成更多的NO 自由基。NO 自由基通過與脂質(zhì)自由基反應，減少胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化并抑制細胞發(fā)生鐵死亡[24]。胰腺癌中，M2 型巨噬細胞比例明顯高于M1 型巨噬細胞。研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞以外泌體形式向胞外分泌KRASG12D 蛋白。KRASG12D 蛋白能被巨噬細胞吞噬，并在胞內(nèi)通過STAT3 介導的方式促進脂肪酸過氧化，誘導巨噬細胞向M2 型分化，促進腫瘤發(fā)生免疫逃逸[25]。鑒于M1 的抗腫瘤功能及比例，越來越多的研究者開始研究如何將M2 型巨噬細胞轉化為M1型巨噬細胞。研究發(fā)現(xiàn)，通過聯(lián)用鐵元素有機納米骨架顆粒和鐵死亡誘導劑，或零價鐵納米顆粒（zero-valent-iron nanoparticle，ZVI-NP），可以誘導M2 型巨噬細胞向M1 型巨噬細胞轉化[26]。

3.3 鐵死亡在Treg 中的免疫調(diào)節(jié)作用

Treg 是一類控制體內(nèi)自身免疫反應性的T 細胞亞群，其主要由胸腺來源的天然Treg 和外周性誘導的Treg 組成。Treg 在維持機體免疫耐受中發(fā)揮重要功能。然而在腫瘤微環(huán)境中，Treg 通過分泌IL-10、TGF-β 等細胞因子，抑制機體免疫反應，促進腫瘤免疫逃逸[27]。研究發(fā)現(xiàn)，GPX4 對維持Treg 免疫抑制功能至關重要。敲除Treg 中的GPX4 雖然不影響Treg細胞的生存，但會增加細胞內(nèi)的脂質(zhì)氧化與鐵死亡水平，抑制Treg 的免疫調(diào)節(jié)功能。敲除GPX4 的Treg 細胞通過分泌IL-1β 增強TH17 細胞反應，促進機體抗腫瘤免疫功能[28]。

3.4 鐵死亡在MDSC 中的研究

MDSC 來源于骨髓祖細胞和未成熟髓細胞，它是單核巨噬細胞、樹突狀細胞和粒細胞的前體。在腫瘤患者體內(nèi)，腫瘤來源的炎癥因子激活MDSC，進而發(fā)揮免疫抑制作用，促進腫瘤發(fā)生免疫逃逸。既往研究提示，N-酰基鞘氨醇氨基水解酶（N-acylsphingosine amidohydrolase，ASAH2）在MDSC 細胞中高表達。通過負向調(diào)控p53 蛋白水平，ASAH2 抑制HMOX1 蛋白表達，最終減少活性氧生成，抑制MDSC 發(fā)生鐵死亡[29]。同時，MDSC 掠奪性吸收細胞間質(zhì)的胱氨酸，抑制抗原呈遞細胞向間質(zhì)分泌半胱氨酸。這些原因?qū)е耇 細胞難以從細胞間質(zhì)獲取足夠的半胱氨酸，T 細胞功能被顯著抑制[30]。

3.5 鐵死亡在DC 中的研究

DC 攝取處理腫瘤相關抗原，并以MHC-腫瘤抗原復合物形式呈遞抗原，激活并促進T 淋巴細胞殺傷腫瘤。同時DC 也可以通過促進NK 細胞增殖，增強機體抗腫瘤免疫反應。既往研究提示，腫瘤組織浸潤的DC 含有更多的脂質(zhì)，因此更容易發(fā)生鐵死亡，從而抑制其抗原呈遞功能[31]。另外，GPX4 抑制劑RSL3 處理可以誘導DC 功能失調(diào)，而PPARG 敲除可以逆轉DC功能失調(diào)，維持其抗腫瘤作用[32]。在另一項研究中，Sestrin2 被證實可以抑制LPS 誘導的DC 鐵死亡，進而促進DC 的生存和功能[33]。

3.6 鐵死亡在NK 細胞中的作用

NK 細胞作為固有免疫細胞，通過穿孔素/顆粒酶途徑，F(xiàn)as 與FasL、TNF-α 與TNFR-1 作用途徑及抗體依賴的細胞介導的細胞毒性作用，在抗腫瘤免疫中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤浸潤的NK 細胞中含有更高水平的鐵死亡及脂質(zhì)氧化相關蛋白。相應地，腫瘤浸潤的NK 細胞氧化應激水平明顯升高，葡萄糖代謝能力顯著降低，NK 細胞發(fā)生功能紊亂。而在NK 細胞中激活NRF2 蛋白功能，則可以逆轉腫瘤微環(huán)境對NK 細胞的抑制作用，重新激活NK 細胞的抗腫瘤功能[34]。

4 小結

綜上所述，鐵死亡是一種新發(fā)現(xiàn)的細胞死亡方式、鐵離子代謝、脂質(zhì)代謝及谷胱甘肽代謝是調(diào)控鐵死亡的關鍵機制。TIL 是腫瘤免疫微環(huán)境最重要的組成成分，其決定機體抗腫瘤免疫活性，調(diào)控腫瘤免疫治療反應性。本綜述主要總結了幾種常見的TIL，歸納了其對鐵死亡的敏感性，并總結了調(diào)控其敏感性的關鍵基因。目前，鐵死亡在腫瘤浸潤免疫細胞中的研究越發(fā)深入。通過該綜述，旨在進一步理解鐵死亡對腫瘤免疫的調(diào)節(jié)作用與潛在機制，為腫瘤免疫治療提供潛在的增敏靶點。