丁坤 ，管勇 ，孔峰 ，趙升田

1山東大學，山東濟南 250100；2山東省立醫(yī)院泌尿外科，山東濟南 250021；3山東第一醫(yī)科大學附屬省立醫(yī)院泌尿外科，山東濟南 250021

慢性腎臟?。–KD）指各種因素引起的慢性腎臟結構和功能障礙，高血壓和糖尿病是重要的原因［1］，同時，伴隨著人口老齡化，其已經呈現出流行的態(tài)勢［2］。除了作為心血管系統(tǒng)疾病、腦卒中等的危險因素外［3-4］，其進展導致的終末期腎病（ESRD）也成為人口死亡的重要因素之一［5］。透析或腎臟移植是主要治療手段，然而透析需要定期進行，長期治療可能導致諸如溶血［6］、炎癥綜合征［7］等并發(fā)癥，嚴重時可能危及生命；腎臟移植作為目前最為有效的腎臟替代治療方案，目前存在腎源緊張［8］、排斥反應［9］等難點，這些都為CKD、ESRD的治療帶來了巨大的挑戰(zhàn)。當前，再生醫(yī)學成為ESRD治療的研究熱點，腎臟類器官作為其研究方向之一，獲得了廣泛關注，它是以體內腎臟發(fā)育過程為指導，通過控制Wnt等多個信號通路［10］，以干細胞等作為種子細胞，經歷自原條到腎祖細胞各個分化階段后構建的3D細胞團組織［11］。然而，現有的腎臟類器官在構建過程的后期普遍存在內部氧氣、營養(yǎng)分布不均的問題［12］，導致其無論在體積還是內部結構的成熟性都不足以應用于再生領域，而血管化則是突破這些局限的重要因素?，F就腎臟類器官血管化的研究進展進行綜述。

1 體內移植血管化

腎臟作為高度血管化的器官，接收全身約五分之一血流量，了解腎臟血管的來源，是促進腎臟類器官血管化的重要一步。血管的產生包括血管新生和血管形成兩種形式［13］，目前多認為，腎臟的血管來源具有雙重性：一方面，胚胎的腎間充質自身便存在著血管前體細胞，其能夠通過分化、遷移等產生腎臟血管，這屬于“血管新生”的過程；另一方面，胚胎發(fā)育的過程中，一些來自外部的血管也會通過出芽等方式生長至腎臟內部，即“血管形成”，并與腎內的血管祖細胞共同形成腎臟血管系統(tǒng)［14］。

由于腎臟發(fā)育過程中血管存在雙重來源的機制，將培養(yǎng)后的類器官進行體內移植便有可能通過“血管形成”過程將其血管化。因此VAN DENBERG等［15］所在的研究團隊使用人多能干細胞構建腎臟類器官后，進行了長期培養(yǎng)和體內移植培養(yǎng)的對比試驗。相較于體外的單純長期培養(yǎng)，移植入小鼠腎被膜的類器官在2周后出現了宿主來源的血管內皮，且隨著培養(yǎng)時間的延長，其小管組織也開始成熟，內皮亦出現孔狀結構。此外，RYAN等［16］使用胚胎干細胞構建腎臟類器官時，在培養(yǎng)早期，類器官內可以發(fā)現不斷增加的內皮細胞，然而12 d后，內部的血管結構便開始減少，而被植入小鼠體內的類器官則表現出良好的血管化。

除了將類器官進行小鼠腎被膜下移植外，雞絨毛尿囊膜（CAM）也是良好的移植選擇。GARRETA等［17］將分化至第16天的類器官移植入CAM中維持5 d，發(fā)現類器官中出現多條肉眼可見的血管，且觀察到類似鮑曼囊和小管樣的結構，提示類器官具有了一定程度的血管化并開始成熟化。由于CAM自身即是一種天然免疫缺陷環(huán)境，不需同腎被膜下移植一樣需要使用免疫缺陷小鼠，移植的過程相對而言更為經濟且簡便。

另外，優(yōu)化移植前的培養(yǎng)方案，也可以促進移植后的血管化。以往的腎臟類器官誘導方案中，每一步均是對所有細胞的同步誘導分化，但有研究認為，這并不符合腎臟發(fā)育的自然過程，因為腎臟發(fā)育并不是單一的時間線，而是祖細胞逐漸流入已分化的細胞群中繼續(xù)分化［18］。因此KUMAR等［19］提出將不同時段分化的前體細胞進行混合后繼續(xù)培養(yǎng)的誘導方案，他們在細胞誘導第11天時，再次加入誘導第9天時獲取的腎祖細胞，通過異時相混合培養(yǎng)后發(fā)現，前一批次細胞優(yōu)先分化為遠端小管上皮和間質細胞，后一批次則優(yōu)先分化為足細胞和近端小管。隨后他們將其進行了體內移植，相比普通誘導培養(yǎng)的類器官，混合培養(yǎng)后的類器官表現出更為廣泛的血管化，并具有更多的腎單位結構，提示其成熟度的提升。

總體而言，體內移植后的腎臟類器官有較好的血管化及成熟性，對比傳統(tǒng)培養(yǎng)有著極大的優(yōu)勢，改善了腎臟類器官進行疾病模擬或藥理毒理驗證時的效能。但是目前而言，其內部的血管網絡尚不成熟，無法實現功能性的灌注，且仍不能達到近似成人腎臟的成熟度，因此暫時不能滿足再生醫(yī)學的需求。而移植前對類器官的培養(yǎng)方式等也會影響移植后類器官的血管化及發(fā)育程度，因此，單純依靠體內移植進行血管化可能并不足夠，在移植前進行體外培養(yǎng)的調整或者體外部分血管化，可能會有助于獲得更為成熟的腎臟類器官［20］。

2 體外培養(yǎng)血管化

對比體內移植的方案，體外培養(yǎng)環(huán)境缺乏體內血流、因子作用等相關有利因素的影響，但也帶來了更為靈活的調整空間，能夠為類器官提供更為多樣的培養(yǎng)模式。因此，各研究團隊采用多種方法嘗試調整體外構建與培養(yǎng)方案，如對環(huán)境條件進行模擬，或者對信號通路進行更為精確的調控等，從而驗證促進其血管化的條件要素，進一步完善培養(yǎng)方案，以通過“血管新生”等途徑在體外實現類器官血管化。

2.1 物理環(huán)境模擬 傳統(tǒng)靜態(tài)環(huán)境下培養(yǎng)的類器官相比體內移植的類器官而言，產生血管網絡的難度較大，而以往的報道指出，體液流動等帶來的剪切應力與內皮血管網絡的形成存在相關性［21-22］。因此，HOMAN等［23］在培養(yǎng)過程中引入流體控制系統(tǒng)，從而模擬腎臟發(fā)育時體液流動的環(huán)境。培養(yǎng)方案以微流控芯片作為類器官的載體，其上方為流動的培養(yǎng)基，為腎臟類器官提供流體剪切應力環(huán)境。試驗發(fā)現，通過流體培養(yǎng)的類器官有了明顯的成熟化表現，出現了小管上皮和足細胞，并有類似血管內皮網絡向腎小球結構擴張的現象，測定顯示其血管內皮生長因子-A（VEGF-A）的表達也顯著上調，這些都是有利于血管產生的因素。同樣，LEE等［24］所在的研究團隊通過構建腎臟類器官芯片，比較了在流體作用下腎臟類器官的發(fā)育情況，與HOMAN團隊的研究結果相似，在流體剪切應力的影響下，類器官內出現了更為明顯的血管形成和足突狀結構，提示其促進了類器官的內皮分化及成熟。由此可見，進行體外培養(yǎng)時，模擬體內臟器發(fā)育時的力學等物理因素具有促進腎臟類器官成熟及血管化的潛力，這是既往單純的靜態(tài)培養(yǎng)條件下無法實現的效果。

2.2 細胞信號通路水平的精細化調控 隨著腎臟類器官體外培養(yǎng)方案的日益成熟，構建簡單的類器官已經不會有較大的困難，但培養(yǎng)方案大多無法控制類器官內部單位的結構組成，難以在體外產生更好的脈管結構。由于發(fā)育中的腎單位，其結構與βcatenin活性具有節(jié)段性相關，而Wnt信號通路能夠通過典型β-catenin信號傳導誘導腎單位的形成［25］，因此LOW等［26］提出從細胞信號通路著手，嘗試通過調控類器官生長過程中的誘導信號強度，形成相對合適的腎單位結構比例，從而產生血管。他們計劃性地使用GSK-3抑制劑CHIR99021控制Wnt通路，從而調節(jié)腎單位不同節(jié)段的誘導分化，使腎小球結構所在的近端節(jié)段與小管結構所在的遠端階段達到最佳比例，保證其具有能夠自主維持一定水平VEGF-A的能力，從而在類器官中產生了血管內皮網絡。將誘導過程進行分節(jié)段精細化調控是腎臟類器官培養(yǎng)模式的一大突破，實現了對類器官分化結構更為細致的可控性，這對于其他類器官的血管化誘導也具有參考意義。

2.3 結合生物材料的培養(yǎng)模式 隨著材料科學的進步，生物材料的引入使得腎臟類器官的血管化有了新的突破。已有的研究證實，多能干細胞等種子細胞結合腎臟脫細胞支架后可以出現相應分化，產生腎小球等結構［27-29］，表明腎臟的細胞外基質（ECM）可以為干細胞向腎單位結構分化、成熟提供機械支持以及相應的生化微環(huán)境。因此，KIM等［30］將豬腎進行脫細胞處理后獲取的ECM制備成為水凝膠，并使用誘導多能干細胞作為種子細胞進行腎臟類器官的培養(yǎng)，通過與普通培養(yǎng)方式獲取的類器官相比，添加ECM后的腎臟類器官表現出了更為明顯的血管內皮網，這一現象在加入VEGF后更為明顯，且ECM水凝膠促進了腎小球結構的血管化以及腎小管結構的生成?？梢?，ECM對于腎臟的發(fā)育成熟具有重要作用，在促進腎臟類器官的血管化及成熟方面具有不小的優(yōu)勢。但需要注意的是，研究應用的ECM是生物來源材料，制備耗時長，過程復雜，在大規(guī)模應用中存在限制。而目前的研究僅是將腎臟ECM作為整體進行相關的培養(yǎng)試驗，對于不同位點促進細胞向腎單位不同結構分化的細胞通路等機制尚不能完全明確，這也就不能為理想的人工合成ECM材料提供更加有效的參考信息，所以相關的機制需要后續(xù)研究進一步闡明。

2.4 生物3D打印的潛力 生物3D打印技術是近些年組織工程學的研究熱點之一，因其能夠通過受控沉積進行復雜立體結構的構建，相比通過誘導產生血管網絡而言，其具有效率高、可控性強等優(yōu)勢，短時間內即可完成類似“血管新生”的過程并形成灌注。因此，有關3D打印構建血管網絡的研究正在不斷推進，目前主要通過使用含有特定細胞的生物墨水在水凝膠等材料中進行血管等組織的“打印”，已有一些團隊證實了3D打印血管結構的可行性［31-32］。SINGH等［33］以ECM為基礎，分別制備含有腎近端小管上皮細胞和人臍靜脈內皮細胞的生物墨水，進行了血管化近端腎小管芯片的打印，對打印后的組織芯片培養(yǎng)后進行檢測發(fā)現，其具備了較好的成熟標記物表達，將其進行小鼠腎被膜下移植后，也出現了宿主來源的血管化，提示其構建的有效性。需要注意的是，目前的相關研究以實現簡單原理式構型打印為主，雖然有團隊通過3D打印進行了可重復性批量小型腎臟類器官的制備［34］，但其仍未能達到理想的血管化程度。受限于腎單位及其周圍血管復雜的解剖結構、打印體積的限制等，當前對于更為復雜的大體積血管化腎臟類器官的打印尚未實現，但這一技術具備的巨大潛力不可忽視，隨著高精度生物3D打印技術的發(fā)展，其未來可能具有最大的優(yōu)勢。

3 結語

人口老齡化的加劇，高血壓、糖尿病等慢性病患病率不斷上升，導致全球CKD和ESRD患者數量不斷增長，給患者的健康和保健醫(yī)療機構帶來巨大的壓力。近些年來腎臟類器官的出現是腎臟再生醫(yī)學的里程碑，而人誘導多能干細胞的出現，為類器官提供了豐富的種子細胞，也使得降低免疫排斥等風險成為可能。腎臟類器官具有治療CKD、ESRD的巨大潛力，對于腎臟的再生醫(yī)學有著重要意義。但是目前的腎臟類器官還無法完全滿足這些需求，組織結構的不成熟性、缺乏完善的血管灌注等，都限制了其進一步發(fā)揮作用，因此，越來越多的研究開始致力于解決這些問題。

本文總結了近幾年來常見的腎臟類器官血管化的研究方案，就總體上看，將類器官進行體內移植依然是實現血管化最為有效的方式，但是其仍難以達到理想的血管化程度，可能需要體外培養(yǎng)的輔助，其距離投入臨床應用還有很長的路要走。體外血管化方案雖然相對簡便，并且對類器官的生長培養(yǎng)環(huán)境有著極為靈活的可操作性，但目前已有的方案中，其形成的脈管網絡尚未能證實存在有效的血液灌流，3D打印雖然擁有解決這一問題的潛力，但其研究仍處于起步階段，這些都是當下類器官體外培養(yǎng)需要面對的挑戰(zhàn)。

隨著干細胞技術水平的進步，培養(yǎng)設備技術的更新，醫(yī)學新突破的不斷出現，腎臟類器官的研究將會被逐步向前推進，直到具有理想結構與功能性的類器官真正出現。在老齡人口不斷增加、患病人數不斷增長的現狀下，這將會為人類對于腎臟疾病的研究，新藥的研發(fā)，CDK、ESRD的治療帶來有力的支持，為再生醫(yī)學的進步提供源源不斷的動力。