謝燕君，盧健聰，葉 凱，林俊鴻

惠州市中心人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科二區(qū),廣東惠州 516001

肺部感染是臨床上的常見病，在一份全球死亡率分析報告中指出，呼吸道感染依然是死亡的首要緣由之一[1]。肺部感染病例中大部分無法明確致病菌，而經(jīng)驗性治療往往只覆蓋常見菌群。非典型病原體的定義具有廣義和狹義之分，狹義上是指支原體、衣原體和軍團菌，廣義上是指除細菌以外的所有病原體[2]。非典型病原體如真菌、病毒、衣原體、支原體、軍團菌等所致的感染治療效果欠佳[2]，即使臨床上對病原體的檢出率不斷提高，也改變不了肺部感染病死率高的現(xiàn)狀，究其原因主要是病原體無法及早明確診斷。在感染性疾病中，超過30%的呼吸道感染通過傳統(tǒng)的檢測方法[直接檢查、抗原抗體檢測、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、分離和培養(yǎng)等]仍無法鑒別其病原體[3]。宏基因組二代測序(mNGS)是近年新興的微生物檢測方法，具有靈敏度高、特異性強、覆蓋度廣、檢測能力強等優(yōu)勢[4]，mNGS檢測對重癥肺炎合并免疫缺陷患者病原體的檢出率明顯高于傳統(tǒng)檢測方法，而且不受使用抗菌藥物種類的影響[5]。對非典型病原體的診斷，傳統(tǒng)的檢測方法能力有限，隨著mNGS 的應(yīng)用，有望改變這一困境。本研究將從幾個方面觀察mNGS在肺部非典型病原體感染中的應(yīng)用價值?，F(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2019年11月20日至2020年7月17日本院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科收治的診斷為肺部感染性疾病并行mNGS檢測的51例患者，其中女12例，男39例；年齡16～89歲，平均(61.24±18.87)歲；社區(qū)獲得性肺炎35例，醫(yī)院獲得性肺炎16例；符合重癥肺炎診斷標準13例。納入標準：肺部感染的診斷標準遵循《內(nèi)科學(xué)》第9版中的肺炎章節(jié)[6]。如果患者沒有支氣管肺泡灌洗禁忌證，首選肺泡灌洗液檢測，如果存在禁忌證或者患者拒絕纖維支氣管鏡檢查，則選擇痰液檢測，如果患者沒有痰，則選擇血液檢測。排除標準：(1)不配合檢查；(2)妊娠或哺乳期女性；(3)資料不齊全。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準(編號：KYLL2020055)，所有患者及其家屬均已簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1炎癥指標 所有入選的患者在入院后，使用抗感染藥物前抽取靜脈血，送檢驗科用全自動生化分析儀檢測患者血常規(guī)、C反應(yīng)蛋白、降鈣素原等。

1.2.2傳統(tǒng)病原體檢測方法 入選患者外送行抗原及抗體檢測(包括軍團菌、支原體、立克次體、衣原體、腺病毒、合胞病毒、流感病毒)，特異性核酸序列檢測(包括流感病毒、腺病毒、鼻病毒、冠狀病毒、合胞病毒、流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌、軍團菌、結(jié)核分枝桿菌等)，在本院行微生物的涂片、培養(yǎng)等，標本來源包括血液、痰液、肺泡灌洗液、咽拭子等，菌種的培養(yǎng)分離根據(jù)《下呼吸道感染細菌培養(yǎng)操作指南：WSIT 499-2017》[7]進行。

1.2.3肺泡灌洗液的采樣流程 (1)部位：根據(jù)患者胸部CT影像學(xué)，選擇病灶較嚴重的相應(yīng)肺段；彌漫性改變者選擇右肺中葉或左肺上葉舌段；(2)支氣管鏡頂端嵌頓于相應(yīng)支氣管段或亞段開口，經(jīng)操作孔分多次注入37 ℃無菌生理鹽水，總量60～90 mL，用低于100 mm Hg負壓吸引獲取肺泡灌洗液，總回收率≥30%；(3)棄去回收液前段可能被污染的部分，收集約5 mL立即送檢。標本交由某基因公司配送和檢測。

1.2.4mNGS檢測 外送某基因公司，采用高通量測序技術(shù)，對標本中微生物核酸序列進行分析，通過與數(shù)據(jù)庫中已有微生物的核酸序列進行比對，從而對微生物進行鑒定。檢測流程包括前處理、核酸提取、合成cDNA、片段化、文庫構(gòu)建、測序、生物信息分析及報告解讀等?；贗llumina測序高通量測序平臺進行mNGS檢測。質(zhì)量控制要求：測序數(shù)據(jù)量≥20 M，測序讀長>50 bp，去人源序列達90%以上，病原數(shù)據(jù)庫>10 000種，涵蓋細菌、真菌、病毒、寄生蟲、分枝桿菌、衣原體和支原體多種病原微生物。

1.2.5mNGS檢測結(jié)果判讀 (1)若兩種檢測鑒定出相同微生物，則認為是致病菌；(2)若影像學(xué)提示存在病變且mNGS檢測檢出序列數(shù)為其他微生物的兩倍，可考慮為致病菌；(3)若呼吸道標本檢出結(jié)核分枝桿菌、腺病毒、流感病毒，血液標本中檢出布魯菌屬，不論mNGS檢出序列數(shù)如何，均可認為是致病菌[6]。

1.2.6分組標準 根據(jù)mNGS檢測是否檢出微生物分為檢出組與未檢出組。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS23.0軟件進行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析。非正態(tài)分布的計量資料以M(P25,P75)表示，兩組間比較采用秩和檢驗。計數(shù)資料采用頻數(shù)或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1檢出組與未檢出組相關(guān)炎癥指標比較 兩組白細胞計數(shù)、降鈣素原、C反應(yīng)蛋白水平比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 檢出組與未檢出組相關(guān)炎癥指標比較[M(P25,P75)]

2.2mNGS檢測與傳統(tǒng)檢測方法檢出率比較 51例患者中，采取傳統(tǒng)檢測方法標本顯示陽性結(jié)果有24例，檢出率為47.06%，而mNGS檢測標本顯示陽性結(jié)果45例，檢出率為88.24%，mNGS檢測檢出率明顯高于傳統(tǒng)檢測方法(χ2=19.75，P<0.05)。

2.3mNGS檢測與傳統(tǒng)檢測方法對非典型病原體感染檢出率比較 mNGS檢測檢出病毒20例(皰疹病毒7例、EB病毒10例、巨細胞病毒2例、甲型流感病毒1例)，支原體4例，衣原體1例，彎孢霉屬1例，白色念珠菌14例，曲霉菌2例，馬拉色菌2例，肺孢子菌5例，共30例患者檢出非典型病原體感染，檢出率為58.82%。傳統(tǒng)檢測方法檢出曲霉菌2例，白色念珠菌5例，支原體2例，共8例患者檢出非典型病原體感染，檢出率為15.69%。mNGS檢測對非典型病原體感染的檢出率高于傳統(tǒng)檢測方法(χ2=40.60，P<0.05)。

2.4mNGS檢測與傳統(tǒng)檢測方法對非典型病原體混合感染檢出率比較 mNGS檢測檢出30例非典型病原體感染患者中，在同一患者中檢出2種及以上非典型病原體的混合感染共13例；傳統(tǒng)檢測方法檢出8例非典型病原體感染患者中，檢出1例混合感染；mNGS檢測對非典型病原體混合感染檢出率高于傳統(tǒng)檢測方法(χ2=16.59，P<0.05)。

3 討 論

相關(guān)研究表明，非典型病原體感染在肺部感染中占比逐漸上升，約22%的肺部感染致病菌為非典型病原體，且在肺部感染患者中，若初始經(jīng)驗性治療覆蓋非典型病原體可加快病情控制、縮短住院時間及降低病死率，但大部分患者未能接受上述治療[8]，并且經(jīng)驗性治療可導(dǎo)致傳統(tǒng)檢測方法對病原體的檢出率下降，從而增加治療疾病所需的費用及時間[9]，故尋找一個可供臨床醫(yī)生及早準確識別非典型病原體感染的方法顯得尤為重要。

本研究發(fā)現(xiàn)，mNGS檢測對總體病原體及非典型病原體的檢出率均高于傳統(tǒng)檢測方法。這是因為mNGS是新一代的病原微生物鑒定方法，以序列為基礎(chǔ)，不需要培養(yǎng)，通過直接提取標本中全部微生物的核酸進行高通量測序，目前mNGS檢測的數(shù)據(jù)庫覆蓋超過10 000種病原體，能同時檢測多種病原體(細菌、真菌、病毒、寄生蟲、支原體、衣原體)，具有無偏倚、廣覆蓋的特點，能快速準確地提供病原鑒定、分型結(jié)果，拓寬檢測的病原譜，提高病原體的整體檢出率。傳統(tǒng)病原體檢測方法多以培養(yǎng)為主，耗時需要3～5 d，檢出率僅有15%～20%。PCR檢測與血清學(xué)檢測在靈敏度、特異性和檢測時效上明顯優(yōu)于培養(yǎng)法，但是其僅能基于已知的病原菌進行，檢測目標局限，所能提供的信息有限，依然無法解決臨床病原體檢出率低的問題。除此之外，對于混合感染和未知病原體的檢測是傳統(tǒng)檢測方法無法逾越的障礙。本研究發(fā)現(xiàn)，mNGS檢測不僅對非典型病原體感染的檢出率優(yōu)于傳統(tǒng)檢測方法，且對于同一患者存在2種及以上病原體的混合感染的檢出較傳統(tǒng)檢測方法也具有明顯的優(yōu)勢。本研究發(fā)現(xiàn)，mNGS檢測與傳統(tǒng)檢測方法對部分標本的檢測結(jié)果存在差異，考慮可能存在以下因素：(1)標本取樣時間不一致；(2)標本的取樣位置存在差別；(3)mNGS檢測在檢測真菌和結(jié)核分枝桿菌上存在一定缺陷，存在假陰性的可能；(4)所使用的的標本類型不同，本研究中部分采用血液標本進行mNGS檢測。

本研究發(fā)現(xiàn)，mNGS檢測在多種非典型病原體的檢測中存在明顯優(yōu)勢，傳統(tǒng)病毒檢測方法中，病毒特異性抗原抗體檢測的檢出率偏低，PCR檢測雖然可以準確檢測病毒核酸，但只能檢出已知的致病菌[10]，對于未知的病原體檢測，mNGS檢測較PCR檢測具有明顯優(yōu)勢[11]，故mNGS檢測可作為傳統(tǒng)檢測方法的補充手段，有助于更快更早地定位致病菌[11-12]。本研究中，1例病毒感染患者入院時的咽拭子并未檢測出甲型流感病毒感染，外送肺泡灌洗液行mNGS檢測后提示甲型流感病毒感染，予抗病毒治療后病情逐步得到控制。真菌感染多發(fā)生于免疫力低下患者，如艾滋病、器官移植、慢性消耗性疾病及服用免疫抑制藥物等患者[13]。對于肺孢子菌肺炎患者，確診需檢出肺孢子菌的滋養(yǎng)體或包囊，本研究中mNGS檢測共檢出5例肺孢子菌，但傳統(tǒng)檢測方法均未能在上述標本中檢出致病菌，對這類患者進行對癥治療后其病情好轉(zhuǎn)并出院。在支原體、衣原體及軍團菌檢測方面，因其培養(yǎng)條件苛刻，臨床中需比較恢復(fù)期血清學(xué)指標或尿抗原等進行確診，雖然血清學(xué)檢測及PCR檢測的開展為其診斷提供了幫助，但需臨床醫(yī)生有目的性地進行檢測，因此診斷較難[14]。有研究表明，mNGS檢測可彌補傳統(tǒng)檢測方法在少見致病菌中檢測的不足[15]，且mNGS檢測范圍大，檢測所需時間短，僅需48 h即可得出結(jié)果，為臨床下一步診治提供參考，故mNGS檢測為非典型病原體感染的診斷提供了強有力的幫助[16]。同時，mNGS檢測結(jié)果受抗菌藥物的影響小，可以為臨床用藥提供更準確地指導(dǎo)[17]。

綜上所述，mNGS檢測作為新的檢測手段，目前已經(jīng)在臨床中廣泛應(yīng)用，其對非典型病原體的檢出優(yōu)勢明顯，對肺部非典型病原體感染的病原學(xué)診斷價值優(yōu)于傳統(tǒng)檢測方法。雖然mNGS檢測的優(yōu)點很多，但是其價格昂貴，標本保存條件高，對于耐藥菌的檢測仍在探索中，且對于報告準確性的解讀仍有待進一步提升。