王麗萍,邵春紅,范 會(huì),周 正,仝 艷,金 炎△

1.山東省公共衛(wèi)生臨床中心病原微生物實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南 250100;2.山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)部，山東濟(jì)南 250002

肺炎克雷伯菌(Kpn)是克雷伯菌屬中最重要的一類菌，可誘發(fā)重癥肺炎、肝膿腫、肺膿腫和尿路感染等。資料顯示，Kpn已取代大腸埃希菌成為腹腔感染最常見(jiàn)的致病菌[1]。根據(jù)毒力特點(diǎn)的不同，可將Kpn分為普通Kpn(cKp)和高毒力Kpn(hvKp)。hvKp因不僅能對(duì)健康宿主造成侵襲性感染，還能引起特殊部位的感染，而受到全球關(guān)注[2]。為進(jìn)一步認(rèn)識(shí)hvKp，本研究對(duì)腹腔感染hvKp患者的臨床及其分子特征進(jìn)行分析?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1材料來(lái)源 收集山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院(以下簡(jiǎn)稱本院)2019年1月至2020年10月腹腔感染患者分離的Kpn和其他部位感染分離的Kpn(剔除同一患者分離的重復(fù)菌株)，對(duì)腹腔感染患者的病歷進(jìn)行臨床資料總結(jié)和分析。Kpn來(lái)源患者共84例，其中男54例，女30例；年齡18～86歲，根據(jù)拉絲試驗(yàn)結(jié)果分為hvKp組和cKp組，對(duì)兩組患者臨床資料進(jìn)行分析。

1.2儀器與試劑 VITEK MS全自動(dòng)快速微生物質(zhì)譜分析儀(法國(guó)生物梅里埃有限公司)，VITEK 2 Compact 全自動(dòng)微生物分析儀及配套藥敏卡(AST-GN13) (法國(guó)生物梅里埃有限公司)，TC-96PCR儀(杭州博日科技有限公司)，Power Pac Basi電泳儀(美國(guó)伯樂(lè)公司)，血平板、麥康凱平板、MH平板、藥敏紙片(美國(guó)賽默飛世爾科技公司)。

1.3方法

1.3.1細(xì)菌鑒定及藥敏試驗(yàn) 采用VITEK MS全自動(dòng)快速微生物質(zhì)譜分析儀進(jìn)行細(xì)菌鑒定；采用VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物分析儀(藥敏卡AST-GN13)聯(lián)合紙片擴(kuò)散(K-B)法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。藥敏結(jié)果參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)2019年版標(biāo)準(zhǔn)[3]進(jìn)行判讀。

1.3.2hvKp菌株篩選 采用黏液表型檢測(cè)(拉絲試驗(yàn))進(jìn)行篩選，將凍存菌株用血瓊脂平板轉(zhuǎn)種，置于CO2恒溫箱，37 ℃培養(yǎng)18～24 h，用滅菌接種針輕放于單個(gè)菌落上，慢慢向上挑起菌落，如果有黏液絲形成，且長(zhǎng)度≥5 mm，則拉絲試驗(yàn)陽(yáng)性，判定為hvKp；反之，則拉絲試驗(yàn)陰性，判定為cKp[4]。

1.3.3毒力水平檢測(cè) 取經(jīng)過(guò)夜培養(yǎng)的hvKp和cKp新鮮菌落，配制成濃度為1×104菌落形成單位(CFU)/mL、1×106CFU/mL、1×108CFU/mL的菌懸液，取每種菌懸液10 μL分別注入大蠟螟尾部的第二和第三對(duì)足之間(每個(gè)濃度10只)，以注入生理鹽水為對(duì)照組，幼蟲(chóng)在37 ℃孵育4 d，每12 h觀察并記錄大蠟螟的存活情況。

1.3.4血清分型及毒力基因檢測(cè) 用煮沸法提取細(xì)菌的模板DNA，引物委托上海生工生物工程有限公司合成，血清型引物參照文獻(xiàn)[5-6]，毒力基因引物序列見(jiàn)表1，聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增后，將陽(yáng)性產(chǎn)物送至上海生工生物工程有限公司測(cè)序，結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上運(yùn)用BLAST比對(duì)確定其基因型。

表1 莢膜血清分型及毒力基因引物序列

2 結(jié) 果

2.1hvKp確認(rèn) 腹腔感染患者分離的84株Kpn，其中43株拉絲試驗(yàn)陽(yáng)性，判定為hvKp，陽(yáng)性率為51.19%；41株拉絲試驗(yàn)陰性，判定為cKp。

2.2毒力水平檢測(cè) hvKp和cKp的半數(shù)致死量分別為每只大蠟螟1×104CFU/mL和每只大蠟螟1×106CFU/mL，對(duì)照組大蠟螟24 h仍然存活，當(dāng)給菌劑量為1×108CFU/mL時(shí)，hvKp組大蠟螟24 h的存活率為58.75%，cKp組大蠟螟24 h的存活率為82.86%，hvKp組與cKp組和對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)圖1。

圖1 毒力水平檢測(cè)

2.3血清分型結(jié)果 腹腔感染患者分離的Kpn中共30株檢出常見(jiàn)的血清分型，其中以K1型為主，檢出16株(19.05%)，其次為K2型，檢出11株(13.10%)。hvKp組K1型的檢出率高于cKp組(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 莢膜血清分型比較

2.4毒力基因檢測(cè) 腹腔感染患者分離的Kpn中，毒力基因以peg-344和icuA為主(61.90%、54.76%)。hvKp組peg-344、icuA和rmpA的檢出率均高于cKp組(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 毒力基因分布比較

2.5耐藥性 hvKp和cKp對(duì)常用抗菌藥物的耐藥率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但腹腔感染患者分離的Kpn與同時(shí)期本院其他來(lái)源的Kpn的藥物敏感率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 抗菌藥物耐藥性比較(%)

2.6臨床特征 hvKP組和cKp組的年齡，住院時(shí)間，性別，感染來(lái)源，是否入住ICU，生活習(xí)慣，臨床診斷(腎膿腫、其他感染)，基礎(chǔ)疾病(高血壓、心臟病)，臨床用藥(除出院帶藥)患者比例比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而hvKP組臨床診斷中肝膿腫、膽囊感染，基礎(chǔ)疾病中糖尿病、腫瘤和臨床用藥中出院帶藥患者比例均高于cKp組(P<0.05)。見(jiàn)表5。

表5 hvKp與cKp感染患者臨床特征比較

續(xù)表5 hvKp與cKp感染患者臨床特征比較

2.7危險(xiǎn)因素分析 結(jié)合單因素分析結(jié)果，將肝膿腫、膽囊感染、糖尿病、腫瘤和出院帶藥作為自變量，hvKp感染作為因變量。多因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示，糖尿病是hvKp感染的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)，見(jiàn)表6。

表6 hvKp感染多因素Logistic回歸分析

3 討 論

Kpn是引起醫(yī)院獲得性感染和社區(qū)獲得性感染常見(jiàn)的細(xì)菌，可造成多部位感染[7]。hvKp具有高黏性和高致病性[8]。與cKp感染不同的是，其可感染無(wú)基礎(chǔ)疾病的年輕人，且易發(fā)生轉(zhuǎn)移感染，導(dǎo)致其他多部位和組織的感染，在臨床受到高度關(guān)注。通過(guò)大蠟螟毒力水平檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在相同的給菌劑量下，hvKp組大蠟螟存活率明顯低于cKp組和對(duì)照組，在給菌劑量1×108CFU/mL，經(jīng)過(guò)24 h，hvKp組的存活率為58.75%，而對(duì)照組仍然全部存活，這顯示了hvKp組的毒力水平較高，印證了hvKp的高毒力性。

腹腔感染患者分離的Kpn以K1型為主，檢出率為19.05%(16株)，其次為K2，檢出率為13.10%(11株)，此外還檢出2株K20和1株K57，未檢出K5和K54。hvKp與cKp兩組比較，K1型檢出率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，這與以往研究結(jié)果一致[9]，K1型在hvKp感染中最常見(jiàn)，且與肝膿腫密切相關(guān)。但本研究共有54株(64.29%)Kpn未檢出常見(jiàn)的血清分型，這說(shuō)明導(dǎo)致腹腔感染的Kpn可能存在其他血清分型。

毒力基因檢測(cè)以peg-344和icuA檢出率較高，其次是rmpA和wabG。hvKp與cKp兩組比較，peg-344、icuA和rmpA檢出率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。rmpA是經(jīng)質(zhì)粒介導(dǎo)的細(xì)胞外調(diào)節(jié)多糖因子，能促進(jìn)Kpn莢膜基因和高黏表型的表達(dá)，但有研究發(fā)現(xiàn)，rmpA不能獨(dú)立發(fā)揮作用，必須與碲酸鹽抗性因子、銀抗性因子以及需氧菌素鐵離子復(fù)合體受體等共同作用[10]。iucA位于Kpn毒力質(zhì)粒上，對(duì)高毒力表型起至關(guān)重要的作用，可作為鑒別hvKp和cKp的遺傳標(biāo)志物[11]。peg-344是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的毒力基因，存在于hvKP毒力質(zhì)粒上[12]，且有報(bào)道顯示，peg-344是hvKp特有的，可用于hvKp快速診斷試驗(yàn)[5]。單獨(dú)以peg-344判定hvKp，其準(zhǔn)確度為97%、靈敏度為99%、特異度為96%；單獨(dú)以icuA判定hvKp，其準(zhǔn)確度為96%、靈敏度為99%、特異度為94%；而二者聯(lián)合則準(zhǔn)確度可以提高到98%、靈敏度為94%、特異度達(dá)100%[5]。此外，還有文獻(xiàn)報(bào)道，聯(lián)合大蠟螟毒力水平檢測(cè)，其靈敏度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值可提高到95.56%、94.83%、93.48%和96.49%[13]。

hvKp對(duì)除頭孢唑啉和氨芐西林/舒巴坦外的普通抗菌藥物均表現(xiàn)為100.00%的敏感率，且hvKp較cKp有更高的敏感率，這與SHAH等[9]報(bào)道的基本一致，這可能是因?yàn)閔vKp菌株不能獲得相關(guān)的耐藥質(zhì)粒，或者是某些耐藥基因在普通菌株轉(zhuǎn)變?yōu)楦叨玖甑倪^(guò)程中丟失[8]。雖然本研究未發(fā)現(xiàn)多重耐藥或特殊耐藥的菌株，但是近年來(lái)報(bào)道的產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)的hvKp和耐碳青霉烯類的hvKp(cr-hvKp)菌株越來(lái)越多，產(chǎn)ESBLs的hvKp是比較重要的耐藥菌株，有更好的傳播效應(yīng)，而cr-hvKp具有超強(qiáng)毒力、多重耐藥性、傳播性強(qiáng)等特點(diǎn)，給臨床治療帶來(lái)更大的挑戰(zhàn)，臨床應(yīng)加強(qiáng)重視，積極早期治療、預(yù)防耐藥菌株的產(chǎn)生[14-15]。

本研究中，hvKP組肝膿腫及膽囊感染患者比例高于cKp組，這可能與hvKp比cKp更容易引起肝膿腫及膽囊感染有關(guān)，hvKp感染多以原發(fā)性肝膿腫為首要癥狀，這與CUBERO等[16]的研究結(jié)果基本一致。經(jīng)多因素Logistic回歸分析，糖尿病是hvKp感染的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，這主要與糖尿病患者自身免疫功能低下密切相關(guān)，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[17-18]，在高糖的情況下機(jī)體的免疫系統(tǒng)易遭到破壞，進(jìn)而使hvKp莢膜多糖合成能力大大提高，從而使細(xì)菌侵襲及抵抗中性粒細(xì)胞吞噬的能力得到增強(qiáng)。此外，本研究中，hvKP組腫瘤患者比例高于cKp組，結(jié)合臨床資料分析，腫瘤也是hvKp感染的易感因素，這可能與腫瘤患者自身免疫功能低下有關(guān)[19]。

由于hvKp耐藥率較低，臨床主要選擇頭孢菌素類抗菌藥物，并且輔以經(jīng)皮穿刺引流膿液治療，但與cKp感染不同的是，hvKp感染患者中有41.86%的患者出院后帶藥繼續(xù)治療，這主要是由于hvKp感染痊愈數(shù)周或數(shù)月后可能會(huì)復(fù)發(fā)，因此對(duì)于hvKp感染患者，可以靜脈輸液治療3～4周后，繼續(xù)口服抗菌藥物3～4周以防止復(fù)發(fā)[18-19]。

現(xiàn)階段臨床診治中并未區(qū)分hvKp和cKp感染，但hvKp的高侵襲性及潛在的嚴(yán)重后遺癥和耐藥性，在將來(lái)可能成為人類健康的重大威脅。雖然hvKp對(duì)大部分抗菌藥物敏感，但明確hvKp感染有利于對(duì)轉(zhuǎn)移灶的治療和防止復(fù)發(fā)，避免出現(xiàn)嚴(yán)重后遺癥和高耐藥性菌株。分析本院腹腔感染hvKp的藥物敏感性及臨床特征，可以幫助臨床醫(yī)生增加對(duì)hvKp的認(rèn)知，從而為下一步預(yù)防及治療提供借鑒。