馬光恕，張 渟，李潤哲，李 梅，廉 華

(1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)園藝園林學(xué)院，黑龍江 大慶 163319；2中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，北京 100081)

黃瓜(CucumissativusL.)屬葫蘆科甜瓜屬植物，是我國具有最大種植面積和最廣泛栽培范圍的主要蔬菜作物之一[1]。據(jù)聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織數(shù)據(jù)顯示，2020年全球的黃瓜總生產(chǎn)面積達(dá)225萬hm2，我國達(dá)到127萬hm2，占全球的56.4%；全球的黃瓜總產(chǎn)量為9035萬t，我國達(dá)到7336萬t，占全球的81.2%[2]。而且我國黃瓜種植面積、產(chǎn)量持續(xù)呈現(xiàn)正增長趨勢，目前在蔬菜種植面積中占比約6%、產(chǎn)量占比近10%。隨著種植面積逐年增加，特別是設(shè)施生產(chǎn)中，持續(xù)連作造成的土傳病害加重逐漸成為影響我國設(shè)施黃瓜生產(chǎn)的最大障礙[3]，黃瓜枯萎病就是其中影響最大的病害之一。黃瓜枯萎病是由尖孢鐮孢黃瓜?；?Fusariumoxysporumf.sp.cucumeriumOwen，F(xiàn)OC)侵染引起的真菌病害，發(fā)病周期涉及黃瓜整個生長期，發(fā)病率通常為10%～30%，嚴(yán)重年份可達(dá)50%；產(chǎn)量損失10%～50%，甚至絕收[4]。長期連作、土壤肥力下降、微生物菌群失衡是導(dǎo)致該病害日漸嚴(yán)重的主要原因[5]。目前，黃瓜枯萎病的防治趨向低毒、低殘留及綠色生態(tài)型發(fā)展，生物防治因其安全、友好、成本低、來源廣等優(yōu)點(diǎn)，逐漸成為當(dāng)今枯萎病防治的研究熱點(diǎn)[6]，木霉(Trichodermaspp.)是目前研究和應(yīng)用最為廣泛的生防真菌類型之一。

木霉菌是真菌界、雙核菌門、半知菌亞門、絲孢綱叢、梗孢目、叢梗孢科、木霉屬一種真菌[7]，Ahmad等[8]研究表明，木霉菌通過分泌植物生長激素等物質(zhì)，具有促進(jìn)植物生長的功能。Harman[9]研究表明，木霉菌通過分泌細(xì)胞壁降解酶類和次級代謝產(chǎn)物，可以誘導(dǎo)植物抗性提高。植物抗性主要通過防御酶系統(tǒng)的應(yīng)答體系表現(xiàn)出來，防御酶系統(tǒng)主要包括過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)、多酚氧化酶(PPO)、超氧化物歧化酶(SOD)等，防御酶活性大小與植物抗病性之間呈一定正相關(guān)關(guān)系[10]。當(dāng)植物受病原菌侵染后，木霉等生防微生物能夠誘導(dǎo)植物抗病相關(guān)防御酶發(fā)生變化，增強(qiáng)植物體的抗病防御功能，而防御反應(yīng)與各種保護(hù)性酶活性的提高關(guān)系密切[11]。同時，當(dāng)植物感病后，會造成細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)大量外滲，丙二醛(MDA)和質(zhì)膜透性均可以作為膜脂過氧化作用強(qiáng)弱的指標(biāo)，在植物的抗病應(yīng)答中發(fā)揮重要作用[12]。關(guān)于木霉促進(jìn)植物生長、提高抗病性以及改善植物體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)功能方面的研究報道較多，如Mohamed等[13]研究了陰溝腸桿菌PS14與棘孢木霉(Trichodermaasperellum)T34對馬鈴薯青枯病的防治效果，結(jié)果表明二者聯(lián)合施用后提高了植株P(guān)OD、脂肪氧合酶和PPO活性，青枯病的溫室發(fā)病率下降幅度達(dá)10.7%～26.5%，大田發(fā)病率下降幅度達(dá)26.6%～36.6%。李玲等[14]研究表明，綠木霉(Trichodermaviride)DB14、加納木霉(Trichodermaghanense)DB35孢子懸浮液對盆栽小麥白粉病的防效分別可達(dá)68.63%、66.67%；噴施2種木霉菌均提高了小麥葉片葉綠素含量和SOD、POD、CAT活性，分別提高69.06%、96.64%、60.38%、54.46%和66.79%、86.43%、34.97%、37.62%；同時降低了MDA含量，分別降低32.97%和32.43%，說明噴施木霉可增強(qiáng)小麥抗逆性。宋明霞等[15]研究了綠色木霉和枯草芽孢桿菌對番茄幼苗生長的影響，結(jié)果顯示施加混合菌液處理番茄株高、莖圍、葉片SPAD值分別比單施綠色木霉增加了23.95%、6.90%、14.69%，番茄葉片PSII最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)、光化學(xué)猝滅系數(shù)(qP)、電子傳遞速率(ETR)分別比單施綠色木霉增加了13.43%、98.20%、29.93%，說明混合菌液更能激活番茄光合系統(tǒng)的活性，提高光合速率，促進(jìn)番茄幼苗的生長。

木霉菌在其生命過程中可以產(chǎn)生菌絲體、分生孢子和厚垣孢子3種繁殖體，目前國內(nèi)外已經(jīng)有50多種木霉商品化制劑[16]，這些制劑均為木霉菌分生孢子制劑或分生孢子與菌絲體混合制劑。厚垣孢子是木霉菌抵抗逆境條件而產(chǎn)生的細(xì)胞壁加厚的孢子，與分生孢子相比，具有耐干燥、對土壤抑菌作用不敏感、存活期長、對病原微生物的生防效果不易受環(huán)境影響等優(yōu)點(diǎn)，因此木霉菌厚垣孢子制劑的商品化開發(fā)將成為木霉菌制劑的發(fā)展趨勢[17]，開發(fā)性能穩(wěn)定的木霉菌厚垣孢子制劑，對于保證植物高產(chǎn)和優(yōu)質(zhì)生產(chǎn)具有重要意義。本試驗(yàn)選擇的擬康氏木霉菌(Trichodermapseudokoningii)886，在前期對黃瓜枯萎病菌平板對峙試驗(yàn)中抑制率達(dá)到74.17%且田間防治效果達(dá)到78.64%，所以本試驗(yàn)以其為試驗(yàn)菌種，選擇擬康氏木霉886厚垣孢子菌劑，系統(tǒng)研究其對黃瓜幼苗生長、抗氧化系統(tǒng)及黃瓜枯萎病防治效果的影響，深化木霉菌劑提高黃瓜抗枯萎病侵染的生理機(jī)制，為“農(nóng)藥化肥雙減”和“農(nóng)藥零增長”的推行提供技術(shù)支持，為木霉菌劑未來研發(fā)和推廣提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試黃瓜品種 供試黃瓜品種為‘長春密刺’，購買于山東新泰市裕園種業(yè)有限公司。

1.1.2 供試培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂固體培養(yǎng)基(PDA)和馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(PD)參照Li等[18]方法；尖孢鐮刀菌選擇培養(yǎng)基參照張樹生等[19]方法；木霉選擇性培養(yǎng)基(PDAm)參照Masunaka等[20]方法；木霉厚垣孢子發(fā)酵培養(yǎng)基參照張林[21]方法。

1.1.3 供試菌株 擬康氏木霉菌Trichodermapseudokoningii886，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所木霉菌研究組提供。

1.1.4 供試基質(zhì)材料 試驗(yàn)中所使用的基質(zhì)材料是草炭和蛭石的混合物，草炭∶蛭石(體積比)= 2∶1(基質(zhì)基本農(nóng)化性狀如下：pH 6.92，有機(jī)質(zhì)34.5%，堿解氮760 mg·kg-1，速效磷53 mg·kg-1，速效鉀157 mg·kg-1)?；|(zhì)過篩(1 mm)后于烘箱中160℃高溫滅菌2 h，自然冷卻后繼續(xù)在160℃烘2 h后放涼備用。

1.2 尖孢鐮刀菌粉劑和木霉孢子粉劑的制備

1.2.1 尖孢鐮刀菌粉劑的制備 將黃瓜枯萎病原菌接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂固體培養(yǎng)基(PDA)上，28℃下培養(yǎng)3 d，從菌落邊緣取直徑5 mm的菌餅5塊，接種在含有100 mL馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(PD)的250 mL的三角瓶中，28℃、120 r·min-1搖床振蕩培養(yǎng)7 d，用雙層紗布過濾去除菌絲，濾液經(jīng)5 000 r·min-1離心10 min，沉淀后的孢子重新懸浮于與發(fā)酵液等量的無菌水中，加入3%硅藻土，混勻、抽濾、干燥，制成病原菌孢子粉劑。為計算粉劑中病原菌孢子含量，將粉劑用無菌水梯度稀釋后，涂布于尖孢鐮刀菌選擇培養(yǎng)基，放置1 h 后將培養(yǎng)平板倒置于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)3～4 d，計菌落數(shù)，計算孢子含量為1.9×107cfu·g-1，按照試驗(yàn)要求計算應(yīng)用劑量。

1.2.2 擬康氏木霉厚垣孢子粉劑的制備 將擬康氏木霉菌886接入到滅菌的木霉菌厚垣孢子發(fā)酵培養(yǎng)基中，于28℃、200 r·min-1搖床中發(fā)酵 7 d。發(fā)酵液用雙層紗布過濾后，將濾液離心得到厚垣孢子，用無菌水反復(fù)沖洗3次，即得干凈的木霉菌厚垣孢子。用無菌水配制成孢子懸浮液，涂布于木霉選擇培養(yǎng)基上，在25～28℃下倒置培養(yǎng)1～2 d，記錄菌落數(shù)，計算木霉厚垣孢子含量。發(fā)酵液加入3%硅藻土，混勻、抽濾、干燥，碾碎成粉末，獲得木霉厚垣孢子粉劑。平板計數(shù)法測得木霉菌886粉劑濃度為4.7×107cfu·g-1，按照試驗(yàn)要求計算應(yīng)用劑量。

1.3 試驗(yàn)方法

2019年5—8月，在黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)教學(xué)基地塑料大棚內(nèi)開展相關(guān)試驗(yàn)研究。將滅菌基質(zhì)材料裝入塑料材質(zhì)的育苗盤(34.5 cm×24 cm×11 cm)中，每盤基質(zhì)重2.5 kg。試驗(yàn)在施用104cfu·g-1濃度的尖孢鐮刀菌粉劑基礎(chǔ)之上，其分別與不同濃度擬康氏木霉菌厚垣孢子菌劑拌入裝有滅菌土的育苗盒中，以不施用擬康氏木霉菌劑為對照。2019年5月20日，播種催芽處理后的黃瓜種子，每盤播80粒，出苗后選留50株。播種后每隔2 d澆施一次無菌水，每盤澆施1 000 mL，保持黃瓜正常生長狀態(tài)。

試驗(yàn)在接種104cfu·g-1濃度的尖孢鐮刀菌粉劑基礎(chǔ)上，共設(shè)置6個不同濃度的擬康氏木霉菌劑處理，即103、104、105、106、107cfu·g-1,分別記為T1、T2、T3、T4、T5,并以不施用擬康氏木霉菌劑為對照(CK)。采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計，每個處理4盤，重復(fù)3次。

在黃瓜播種后15 d，測定防病效果；在黃瓜播種后30 d取其植株，每個處理選取30株(每個重復(fù)10株)，用于測定黃瓜幼苗形態(tài)指標(biāo)和物質(zhì)積累量指標(biāo)，計算根冠比和壯苗指數(shù)；在黃瓜播種后15 d和30 d取其植株，每個處理選取30株，用于測定黃瓜幼苗抗氧化系統(tǒng)相關(guān)指標(biāo)。

1.4 試驗(yàn)測定指標(biāo)與方法

1.4.1 形態(tài)指標(biāo)測定 株高：植株的莖基部到生長點(diǎn)之間的距離，用直尺測定；莖粗：植株子葉節(jié)下1 cm處粗度，用游標(biāo)卡尺測定；葉面積：用剪紙稱重法測定。

1.4.2 物質(zhì)積累量指標(biāo)測定 利用清水反復(fù)沖洗植株，再用吸水紙吸干，按照地上部與地下部分開后測其鮮重；而后將鮮樣在105℃殺青15 min后，在70℃烘至恒重，用1/1 000電子天平分別測定地上部與地下部干重。

根冠比計算：根冠比=地下部鮮重/地上部鮮重

壯苗指數(shù)計算：壯苗指數(shù)=(莖粗/株高+地下部干重/地上部干重)×全株干重

1.4.3 抗氧化系統(tǒng)相關(guān)指標(biāo)測定 丙二醛(MDA)：硫代巴比妥酸法；脯氨酸(Pro)：酸性茚三酮顯色法；質(zhì)膜透性：相對電導(dǎo)率法；超氧化物歧化酶(SOD)活性：氮藍(lán)四唑光化還原法；抗壞血酸過氧化物酶(APX)活性：抗壞血酸法；過氧化氫酶(CAT)活性：紫外吸收法；過氧化物酶(POD)活性：愈創(chuàng)木酚法；多酚氧化酶(PPO)活性：參照Zhao等[22]的方法。

1.4.4 抗病性指標(biāo)測定方法 抗病性指標(biāo)包括植株發(fā)病率、病情指數(shù)、防治效果。黃瓜播種后15 d，調(diào)查發(fā)病株數(shù)占調(diào)查總株數(shù)的百分比，計算各處理的發(fā)病率。黃瓜苗期枯萎病參照張素平[23]的分級標(biāo)準(zhǔn)，病情指數(shù)參照宗兆鋒等[24]的計算方法，具體如下：0級：無癥狀；1級：真葉、子葉黃化或萎蔫面積不超過總面積的50%；2級：真葉、子葉黃化或萎蔫面積超過總面積的50%；3級：葉片萎蔫或枯死，僅生長點(diǎn)存活；4級：全株嚴(yán)重萎蔫，以致枯死。

病情指數(shù)= [∑(病級株數(shù)×代表級數(shù))/(植株總數(shù)×最高代表級值)]×100%

防治效果=(對照病情指數(shù)-處理病情指數(shù))/對照病情指數(shù)×100%

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2007軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，用DPS 7.05軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和方差分析，不同處理間數(shù)據(jù)的多重比較采用Duncan新復(fù)極差法檢驗(yàn)(P<0.05)；采用Excel 2007軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 擬康氏木霉厚垣孢子菌劑對黃瓜幼苗形態(tài)指標(biāo)的影響

注：CK，不施用擬康氏木霉菌劑；T1，103 cfu·g-1擬康氏木霉菌劑；T2，104 cfu·g-1擬康氏木霉菌劑；T3，105 cfu·g-1擬康氏木霉菌劑；T4，106 cfu·g-1擬康氏木霉菌劑；T5，107 cfu·g-1擬康氏木霉菌劑。圖中正負(fù)誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差大小，不同小寫字母表示在同一時期各處理之間差異顯著(P<0.05)。下同。Note：CK，0 cfu·g-1 Trichoderma pseudokoningii agents；T1，103 cfu·g-1 Trichoderma pseudokoningii agents；T2，104 cfu·g-1 Trichoderma pseudokoningii agents；T3，105cfu·g-1 Trichoderma pseudokoningii agents；T4，106cfu·g-1 Trichoderma pseudokoningii agents；T5，107cfu·g-1 Trichoderma pseudokoningii agents.Values in the chart are standard error.Different lowercase letters in the same period indicate that the difference reach a significant level(P<0.05)among different treatments.The same below.圖1 擬康氏木霉菌劑對黃瓜幼苗株高和莖粗的影響Fig.1 Effect of Trichoderma pseudokoningii agents on plant height and stem diameter of cucumber seedlings

2.1.1 擬康氏木霉厚垣孢子菌劑對黃瓜幼苗株高和莖粗的影響 如圖1所示，在黃瓜播種后30 d，T3處理黃瓜幼苗株高和莖粗均最高，分別為17.28 cm和4.24 mm；且顯著高于其他處理，株高和莖粗分別比CK、T1、T2、T4、T5高70.93%、27.78%、9.43%、5.82%、22.28%和50.76%、20.18%、7.56%、4.28%、15.37%；T2黃瓜幼苗株高和莖粗和T4之間差異不顯著，但二者均顯著高于CK、T1、T5，T2分別高56.19%、16.77%、11.74%和40.17%、11.73%、7.26%，T4分別比CK、T1、T5高61.53%、20.76%、15.56%和44.58%、15.25%、10.64%；T5黃瓜幼苗株高和莖粗和T1之間差異不顯著，但二者均顯著高于CK，T5分別比CK高39.78%和30.68%，T1分別比CK高33.76%和25.45%；CK黃瓜幼苗的株高和莖粗最低，分別為10.11 cm和2.81 mm。說明適量木霉菌劑處理即T3對黃瓜幼苗株高和莖粗具有更好促進(jìn)效果，為以后幼苗物質(zhì)積累和壯苗形成提供基礎(chǔ)條件。

2.1.2 擬康氏木霉厚垣孢子菌劑對黃瓜幼苗葉面積和根體積的影響 如圖2所示，在黃瓜播種后30 d，T3黃瓜幼苗葉面積和根體積最高，分別為37.84 cm2和0.51 cm3；T3黃瓜幼苗葉面積與T4之間差異不顯著，但均顯著高于CK、T1、T2、T5，分別高105.41%、55.44%、15.50%、42.99%和92.30%、45.52%、8.13%、33.87%；T3黃瓜幼苗根體積顯著高于CK、T1、T2、T4、T5，分別高200.00%、54.55%、21.43%、15.91%、37.84%；T4黃瓜幼苗葉面積和根體積與T2之間差異不顯著，但均顯著高于CK、T1、T5，葉面積分別高92.30%、45.52%、33.87%和77.84%、34.58%、23.80%，根體積分別高158.82%、33.33%、18.92%和147.06%、27.27%、13.51%；T1黃瓜幼苗葉面積和根體積與T5之間差異不顯著，但均顯著高于CK，分別高32.15%、43.65%和94.12%、117.65%；CK黃瓜幼苗的葉面積和根體積最低，分別為18.42 cm2和0.17 cm3。說明適量木霉菌劑處理對黃瓜幼苗葉面積和根體積具有促進(jìn)效果，為以后黃瓜壯苗形成提供保證。

2.1.3 擬康氏木霉厚垣孢子菌劑對黃瓜幼苗根冠比和壯苗指數(shù)的影響 如圖3所示，在黃瓜播種后30 d，T3黃瓜幼苗根冠比和壯苗指數(shù)最高，分別為0.103和0.108；T3黃瓜幼苗根冠比和壯苗指數(shù)顯著高于其他處理，分別比CK、T1、T2、T4、T5高51.47%、43.06%、10.75%、8.42%、37.33%和68.75%、30.12%、13.68%、10.20%、21.35%；T4幼苗根冠比和壯苗指數(shù)與T2之間差異不顯著，但均顯著高于CK、T1、T5，根冠比分別高39.71%、31.94%、26.67%和36.76%、29.17%、24.00%，壯苗指數(shù)分別高53.13%、18.07%、10.11%和48.44%、14.46%、6.74%；T1黃瓜幼苗根冠比和壯苗指數(shù)與T5之間差異不顯著，但均顯著高于CK，分別高5.88%、29.69%和10.29%、39.06%；CK黃瓜幼苗根冠比和壯苗指數(shù)最低，分別為0.068和0.064。說明適量木霉菌劑處理對黃瓜根冠比和壯苗指數(shù)具有促進(jìn)效果，為提高黃瓜抗逆性提供了基礎(chǔ)保證。

圖2 擬康氏木霉菌劑對黃瓜幼苗葉面積和根體積的影響Fig.2 Effect of Trichoderma pseudokoningii agents on leaf area and root volume of cucumber seedlings

圖3 擬康氏木霉菌劑對黃瓜根冠比和壯苗指數(shù)的影響Fig.3 Effect of Trichoderma pseudokoningii agents on root shoot ratio and strong seedling index of cucumber

2.2 擬康氏木霉厚垣孢子菌劑對黃瓜幼苗抗氧化指標(biāo)的影響

2.2.1 擬康氏木霉厚垣孢子菌劑對黃瓜幼苗葉片過氧化氫酶活性的影響 如圖4所示，在黃瓜播種后15 d和30 d，擬康氏木霉厚垣孢子菌劑不同處理下黃瓜幼苗葉片過氧化氫酶活性均顯著高于CK。在黃瓜播種后15 d和30 d，黃瓜幼苗葉片過氧化氫酶活性隨處理濃度增加呈先升高后降低趨勢，且T3最高，分別為113.87 U·g-1·min-1和167.22 U·g-1·min-1；黃瓜播種后30 d，擬康氏木霉厚垣孢子菌劑不同處理下黃瓜葉片過氧化氫酶活性均比播種后15 d有所提高。T3顯著高于其他處理，在黃瓜播種后15 d分別比其他處理(CK、T1、T2、T4、T5)高160.95%、33.86%、26.49%、9.88%、47.77%，在黃瓜播種后30 d分別比其他處理(CK、T1、T2、T4、T5)高119.96%、56.49%、15.87%、6.16%、69.88%；其次，T4對葉片過氧化氫酶活性促進(jìn)效果表現(xiàn)較好，顯著高于CK、T1、T2、T5，在黃瓜播種后15 d分別比CK、T1、T2、T5高137.50%、21.83%、15.12%、34.49%，而在黃瓜播種后30 d則分別高107.20%、47.42%、9.15%、60.03%；在黃瓜播種后15 d和30 d，T1、T2、T5幼苗葉片過氧化氫酶活性與CK之間均呈現(xiàn)顯著性差異，以CK最低，分別為43.64 U·g-1·min-1和76.02 U·g-1·min-1，分別比T1、T2、T5低94.95%、106.31%、76.59%和40.56%、89.84%、29.48%。說明適量木霉菌劑處理對黃瓜幼苗葉片過氧化氫酶活性具有促進(jìn)效果，進(jìn)而有助于提高黃瓜幼苗對枯萎病的抗性。

2.2.2 擬康氏木霉厚垣孢子菌劑對黃瓜幼苗葉片過氧化物酶活性的影響 如圖5所示，在黃瓜播種后15 d和30 d，擬康氏木霉厚垣孢子菌劑不同處理下黃瓜幼苗葉片過氧化物酶活性均顯著高于CK。在黃瓜播種后15 d和30 d，黃瓜幼苗葉片過氧化物酶活性隨處理濃度增加呈先升高后降低趨勢，且T3最高，分別為145.67 U·g-1·min-1和248.33 U·g-1·min-1；黃瓜播種后30 d，擬康氏木霉厚垣孢子菌劑不同處理下黃瓜葉片過氧化物酶活性均比播種后15 d有所提高，隨濃度增加，各處理的增加幅度分別為105.77%、61.65%、39.43%、70.47%、34.58%、73.34%。T3顯著高于其他處理，在黃瓜播種后15 d分別比其他處理(CK、T1、T2、T4、T5)高278.72%、93.55%、15.33%、6.77%、137.41%，在黃瓜播種后30 d分別比其他處理(CK、T1、T2、T4、T5)高213.75%、104.12%、41.01%、35.25%、133.49%。其次，T4對葉片過氧化物酶活性促進(jìn)效果表現(xiàn)較好，在黃瓜播種后15 d，T4顯著高于CK、T1、T2、T5，分別高254.70%、81.27%、8.01%、122.35%；在黃瓜播種后30 d，T4與T2之間差異不顯著，但二者均顯著高于CK、T1、T5，T4分別高131.98%、50.92%、72.63%，T2分別高122.51%、44.76%、65.58%。在黃瓜播種后15 d和30 d，T1、T5幼苗葉片過氧化物酶活性與CK之間均呈現(xiàn)顯著性差異，以CK最低，分別為38.46 U·g-1·min-1和79.15 U·g-1·min-1，分別比T1、T5低95.67%、59.52%和53.71%、34.38%。同樣說明，適量木霉菌劑處理對黃瓜幼苗葉片過氧化物酶活性具有促進(jìn)效果，有助于提高黃瓜幼苗對枯萎病的抗性。

圖4 擬康氏木霉菌劑對黃瓜幼苗過氧化氫酶活性的影響Fig.4 Effect of Trichoderma pseudokoningii agents on catalase activity of cucumber seedlings

圖5 擬康氏木霉菌劑對黃瓜幼苗過氧化物酶活性的影響Fig.5 Effect of Trichoderma pseudokoningii agents on peroxidase activity of cucumber seedlings

圖6 擬康氏木霉菌劑對黃瓜幼苗超氧化物歧化酶活性的影響Fig.6 Effect of Trichoderma pseudokoningii agents on superoxide dismutase of cucumber seedlings

2.2.3 擬康氏木霉厚垣孢子菌劑對黃瓜幼苗葉片超氧化物歧化酶活性的影響 如圖6所示，在黃瓜播種后15 d和30 d，擬康氏木霉厚垣孢子菌劑不同處理下黃瓜幼苗葉片超氧化物歧化酶活性均顯著高于CK。在黃瓜播種后15 d和30 d，黃瓜幼苗葉片超氧化物歧化酶活性均隨處理濃度增加呈先升高后降低趨勢，且T3最高，分別為323.85 U·g-1和429.82 U·g-1。在黃瓜播種后15 d，T3顯著高于其他處理，分別比其他處理(CK、T1、T2、T4、T5)高235.77%、82.44%、39.02%、19.29%、94.56%；T4顯著高于CK、T1、T2、T5，分別高181.47%、52.94%、16.54%、63.10%；T2顯著高于CK、T1、T5，分別高141.53%、31.23%、39.95%；T1與T5之間差異不顯著，但二者均顯著高于CK，分別高84.04%、72.58%；CK葉片超氧化物歧化酶活性最低，為96.45 U·g-1。在黃瓜播種后30 d，T3顯著高于其他處理(CK、T1、T2、T4、T5)，分別高139.29%、36.86%、24.36%、17.29%、68.60%；T4與T2之間差異不顯著，但二者均顯著高于CK、T1、T5，T4分別高104.02%、16.69%、43.75%，T2分別高92.42%、10.05%、35.58%；T1、T5、CK之間均呈現(xiàn)顯著性差異，以CK最低，為179.62 U·g-1，分別比T1、T5低74.84%、41.93%。同樣說明，適量木霉菌劑處理對黃瓜幼苗葉片超氧化物歧化酶活性具有促進(jìn)效果，進(jìn)而提高了黃瓜幼苗對枯萎病的抗性。

2.2.4 擬康氏木霉厚垣孢子菌劑對黃瓜幼苗葉片抗壞血酸過氧化物酶的影響 如圖7所示，在黃瓜播種后15 d和30 d，擬康氏木霉厚垣孢子菌劑不同處理下黃瓜幼苗葉片抗壞血酸過氧化物酶均顯著高于CK。在黃瓜播種后15 d和30 d，抗壞血酸過氧化物酶均隨處理濃度增加呈先升高后降低趨勢，且T3最高，分別為192.16 U·g-1·min-1和259.61 U·g-1·min-1。在黃瓜播種后15 d，T3與T4之間差異不顯著，但二者均顯著高于CK、T1、T2、T5，T3分別高107.45%、15.51%、10.70%、48.93%，T4分別高102.37%、12.68%、7.98%、45.28%；T2與T1之間差異不顯著，但二者均顯著高于CK、T5，T2分別高87.41%、34.54%，T1分別高79.60%、28.93%；T5較CK顯著高39.30%；CK抗壞血酸過氧化物酶最低，為92.63 U·g-1·min-1。在黃瓜播種后30 d，T3顯著高于其他處理(CK、T1、T2、T4、T5)，分別高97.53%、38.36%、17.12%、9.80%、63.73%；T4與T2之間差異不顯著，但二者均顯著高于CK、T1、T5，T4分別高79.90%、26.01%、49.12%，T2分別高68.65%、18.13%、39.79%；T1、T5、CK之間均呈現(xiàn)顯著性差異，以CK最低，為131.43 U·g-1·min-1，分別比T1、T5低42.77%、20.64%。這也說明，適量木霉菌劑處理對黃瓜幼苗葉片抗壞血酸過氧化物酶具有促進(jìn)效果，進(jìn)而提高了黃瓜幼苗對枯萎病的抗性。

2.2.5 擬康氏木霉厚垣孢子菌劑對黃瓜幼苗葉片多酚氧化酶活性的影響 如圖8所示，在黃瓜播種后15 d和30 d，擬康氏木霉厚垣孢子菌劑不同處理下黃瓜幼苗葉片多酚氧化酶活性均顯著高于CK。在黃瓜播種后15 d和30 d，多酚氧化酶活性均隨處理濃度增加呈先升高后降低趨勢，且T3最高，分別為3.72 U·g-1·min-1和5.61 U·g-1·min-1。在黃瓜播種后15 d和30 d，T3顯著高于CK、T1、T2、T4、T5，分別高137.65%、22.22%、12.03%、8.67%、25.77%和101.15%、16.60%、12.53%、11.14%、17.72%；在黃瓜播種后15 d和30 d，T4與T2之間差異不顯著，但二者均顯著高于CK、T1、T5，T4、T2在黃瓜播種后15 d分別高118.70%、12.47%、15.74%和112.13%、9.09%、12.26%，T4、T2在黃瓜播種后30 d分別高80.98%、4.91%、5.92%和78.76%、3.62%、4.62%；在黃瓜播種后15 d和30 d，T1與T5之間差異不顯著，但二者均顯著高于CK，在黃瓜播種后15 d分別高94.45%、88.96%，在黃瓜播種后30 d分別高72.52%、70.86%；在黃瓜播種后15 d和30 d，CK均最低，分別為1.57 U·g-1·min-1和2.79 U·g-1·min-1。結(jié)果說明，適量木霉菌劑處理對黃瓜幼苗葉片多酚氧化酶活性具有促進(jìn)效果，進(jìn)而提高了黃瓜幼苗對枯萎病的抗性。

2.2.6 擬康氏木霉厚垣孢子菌劑對黃瓜幼苗葉片生理指標(biāo)的影響 表1表明，黃瓜播種后15 d，擬康氏木霉厚垣孢子菌劑不同處理下黃瓜幼苗葉片丙二醛含量、質(zhì)膜透性均顯著低于CK，T1、T2、T3、T4、T5丙二醛含量分別低29.70%、41.70%、60.82%、49.76%、21.94%，質(zhì)膜透性分別低9.44%、34.46%、50.91%、36.61%、6.56%。T1、T5之間丙二醛含量差異不顯著，但二者均顯著高于T2、T3、T4，分別高20.59%、79.44%、39.93%和33.89%、99.23%、55.36%；T2、T4之間差異不顯著，但二者均顯著高于T3，分別高48.80%和28.24%；T3丙二醛含量最低，為10.41 μmol·g-1。T1、T5之間質(zhì)膜透性差異不顯著，但二者均顯著高于T2、T3、T4，分別高38.18%、84.46%、42.87%和42.58%、90.33%、47.42%；T2、T4之間差異不顯著，但二者均顯著高于T3，分別高33.49%和29.11%；T3質(zhì)膜透性最低，為37.65%。T3脯氨酸含量最高，為123.62 μg·g-1，顯著高于CK、T1、T2、T4、T5，分別高70.18%、43.46%、31.16%、15.16%、48.58%；T4顯著高于CK、T1、T2、T5，分別高47.78%、24.58%、13.90%、29.03%；T2顯著高于CK、T1、T5，分別高29.75%、9.38%、13.28%；T1與T5之間差異不顯著，但二者均顯著高于CK，分別高18.63%、14.54%；CK脯氨酸含量最低，為72.64 μg·g-1。

黃瓜播種后30 d，擬康氏木霉厚垣孢子菌劑不同處理下黃瓜幼苗葉片丙二醛含量、質(zhì)膜透性均比播種后15 d有所增高，且T1、T2、T3、T4、T5丙二醛含量、質(zhì)膜透性均顯著低于CK，丙二醛含量分別低34.84%、45.07%、60.28%、50.46%、27.35%，質(zhì)膜透性分別低15.39%、29.30%、46.10%、32.86%、11.16%。T5丙二醛含量顯著高于T1、T2、T3、T4，分別高11.49%、32.25%、82.88%、46.65%；T1著高于T2、T3、T4，分別高18.61%、64.03%、31.53%；T2、T4之間差異不顯著，但二者均顯著高于T3，高38.29%和24.71%；T3丙二醛含量最低，為15.54 μmol·g-1。

圖7 擬康氏木霉菌劑對黃瓜幼苗抗壞血酸過氧化物酶活性的影響Fig.7 Effect of Trichoderma pseudokoningii agents on ascorbate peroxidase activity of cucumber seedlings

圖8 擬康氏木霉菌劑對黃瓜幼苗多酚氧化酶活性的影響Fig.8 Effect of Trichoderma pseudokoningii agents on polyphenol oxidasea activity of cucumber seedlings

T1、T5之間質(zhì)膜透性差異不顯著，但二者均顯著高于T2、T3、T4，分別高19.68%、56.96%、26.02%和25.67%、64.81%、32.32%；T2、T4之間差異不顯著，但二者均顯著高于T3，高31.15%和24.56%；T3質(zhì)膜透性最低，為51.84%。在播種后30 d擬康氏木霉厚垣孢子菌劑不同處理下黃瓜幼苗葉片脯氨酸含量比播種后15 d有所增高，T3脯氨酸含量最高，為157.47 μg·g-1，顯著高于CK、T1、T2、T4、T5，分別高70.39%、43.74%、32.93%、24.87%、47.86%；T4顯著高于CK、T1、T2、T5，分別高36.45%、15.12%、6.46%、18.41%；T2顯著高于CK、T1、T5，分別高28.18%、8.13%、11.23%；T1與T5之間差異不顯著，但二者均顯著高于CK，分別高18.53%和15.23%；CK脯氨酸含量最低，為92.42 μg·g-1。

綜上可知，適量木霉菌劑處理可以降低黃瓜幼苗葉片中的丙二醛和質(zhì)膜透性，提高脯氨酸含量以及CAT、POD、SOD、APX、PPO等酶活性，增強(qiáng)了抗氧化系統(tǒng)的功能，提高了黃瓜幼苗對枯萎病的防治效果。

表1 擬康氏木霉菌劑對黃瓜幼苗生理指標(biāo)的影響Table 1 Effect of Trichoderma pseudokoningii agents on physiological indexes of cucumber seedlings

2.3 擬康氏木霉厚垣孢子菌劑對黃瓜枯萎病盆栽試驗(yàn)防治效果的影響

在黃瓜播種后15 d，調(diào)查擬康氏木霉厚垣孢子菌劑處理下的黃瓜幼苗的發(fā)病率、病情指數(shù)和防治效果，結(jié)果如表2所示。不同擬康氏木霉菌劑處理下的發(fā)病率和病情指數(shù)均顯著低于CK，其中T3發(fā)病率和病情指數(shù)最低，分別為6.32%和8.27。T3與T4、T4與T2發(fā)病率差異均不顯著；T1、T5發(fā)病率差異不顯著但二者均顯著高于T2、T3、T4，分別高126.56%、198.26%、152.68%和88.46%、148.10%、110.19%。T1、T5病情指數(shù)差異不顯著但二者均顯著高于T2、T3、T4，分別高45.06%、137.85%、61.36%和30.97%、114.75%、45.69%；T2、T4之間差異不顯著但二者均顯著高于T3，分別高63.97%和47.40%。T3防治效果最好，為83.98%；T3顯著高于T1、T2、T4、T5，分別高35.69%、13.90%、9.95%、28.04%；T2與T4、T1與T5之間差異均不顯著；T1防治效果最低，為61.89%。

3 討 論

隨著黃瓜規(guī)?；?、基地化、專業(yè)化的不斷發(fā)展和生態(tài)環(huán)境的變化，使得黃瓜病害問題十分突出，危害程度日趨嚴(yán)重，其中枯萎病是黃瓜生產(chǎn)中一種危害嚴(yán)重的土傳真菌性病害[25]。長期以來，黃瓜枯萎病的防治主要依靠化學(xué)農(nóng)藥，化學(xué)農(nóng)藥的應(yīng)用雖然取得了一定的效果，但其對人畜健康的影響以及對生態(tài)環(huán)境的危害日益嚴(yán)重并受到廣泛關(guān)注[26]，生產(chǎn)出對人類身體健康有益、對環(huán)境友好的綠色無公害園產(chǎn)品是一項非常重要的任務(wù)。因此，制定對生態(tài)友好且高效的植物病害管理戰(zhàn)略顯得尤為必要[27]。

表2 擬康氏木霉菌劑對黃瓜枯萎病防效的影響Table 2 Effect of Trichoderma pseudokoningii agents against cucumber Fusarium wilt

木霉作為廣泛應(yīng)用的植病生防真菌，對植物病原真菌有廣譜的拮抗作用，如鐮刀菌Fusariumspp.、腐霉菌Pythiumspp.、疫霉菌Phytophthoraspp.、立枯絲核菌Rhizoctoniasolani等。利用生防木霉菌防治鐮刀菌引起的植物土傳病害已有較多的研究報道：如畢卉[28]利用綠色木霉Trichodermaviride的TV菌株對黃瓜枯萎病的防效為47.49%；長枝木霉Trichodermalongibrachiatum對黃瓜枯萎病的防效達(dá)到75.74%，而綠色木霉Trichodermaviride的防效為70.76%。本研究中的T3處理即施用105cfu·g-1擬康氏木霉菌劑，對枯萎病的防治效果最好，為83.98%；T3的病情指數(shù)則降為8.27，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于CK即不施用擬康氏木霉菌劑。

此外，木霉不僅能夠防治植物病害，還對植物具有良好的促生作用，如張樹武等[29]研究表明，深綠木霉發(fā)酵液對黑麥草幼苗的生長具有明顯的促生作用，尤其是100倍稀釋液處理的黑麥草幼苗根系長度、株高、鮮重、干重和根冠比的相對增長率分別為16.95%、13.33%、40.57%、73.68%和36.36%；趙玳琳等[30]研究發(fā)現(xiàn)，生防木霉GYXM-1p1菌株對甘藍(lán)的促生作用最明顯，處理后甘藍(lán)植株的總鮮重和總干重分別較清水對照增加417.60%和762.69%。本研究中T3即105cfu·g-1擬康氏木霉厚垣孢子菌劑處理的株高、莖粗、葉面積、根體積、根冠比和壯苗指數(shù)均在各處理中為最高，分別為17.284 cm、4.241 mm、37.843 cm2、0.510 cm3、0.103、0.108，分別比CK高70.93%、50.76%、105.41%、200.00%、51.47%、68.75%，表現(xiàn)出擬康氏木霉處理對黃瓜幼苗的促生作用。這可能是因?yàn)槟久雇ㄟ^調(diào)節(jié)植物生理生化代謝過程，影響到植物的生長狀態(tài)，起到了促進(jìn)生長的作用[31]。

木霉菌與植物互作過程中木霉菌誘導(dǎo)植物分泌CAT、POD、APX、SOD、PPO、PAL(苯丙氨酸解氨酶)等次生代謝產(chǎn)物，影響MDA、質(zhì)膜透性、Pro等生理物質(zhì)含量，這些物質(zhì)既能抑制病原菌也能誘導(dǎo)植物系統(tǒng)抗性[32]。前人的許多研究報道中均指出抗氧化酶和膜脂過氧化的主要產(chǎn)物均與植物的抗病性密切相關(guān)，如藺澤榮等[33]研究表明，多孢木霉HZ-31菌株侵染藜后，POD活力、PAL活力、SOD活力一直高于對照組，分別增加46.44%、72.21%和8.12%。隨著防御酶活性升高，植物防御能力也逐漸增強(qiáng)，CAT活力、PPO活力和MDA含量先升高后降低，說明藜受菌株HZ-31侵染后防御酶被激活，增強(qiáng)了對侵染的防御能力；王繼雯等[34]研究表明，施加0.5 g·kg-1棘孢木霉SFC-3菌劑可以有效提高小麥葉片中SOD和POD活性，當(dāng)施用量達(dá)1.0 g·kg-1時能顯著降低MDA含量，當(dāng)施用量為1.5 g·kg-1時對小麥孢囊線蟲病的防效可達(dá)到88.68%；侯雪月等[35]利用哈茨木霉T8進(jìn)行浸種和澆根處理，結(jié)果表明，T8組無論是葉鮮重、葉干重還是根鮮重、根干重、根長指標(biāo)均顯著高于同茬CK組，第3茬T8組蕓芥的SOD、POD、PPO和脯氨酸含量分別比CK組高9.89%、130.00%、13.89%和59.05%，這或許與木霉誘導(dǎo)植物提高局部和系統(tǒng)抗性有關(guān)。本研究結(jié)果表明，在黃瓜播種后15 d和30 d，各濃度擬康氏木霉厚垣孢子菌劑均對黃瓜幼苗葉片CAT、POD、SOD、APX、PPO活性具有影響作用，且黃瓜播種后30 d的CAT、POD、SOD、APX、PPO活性均比播種后15 d有所提高。在黃瓜播種后30 d，T3的促進(jìn)作用最強(qiáng)，CAT、POD、SOD、APX、PPO分別比CK提高了119.96%、213.75%、139.29%、97.53%、101.15%。同時，擬康氏木霉厚垣孢子菌劑均對黃瓜幼苗葉片MDA含量、質(zhì)膜透性、Pro含量具有一定影響，在黃瓜播種后30 d，T3丙二醛含量和質(zhì)膜透性最低，分別為15.536 μmol·g-1和51.842%，分別比CK低46.10%和60.28%；T3脯氨酸含量最高，為157.467 μg·g-1，比CK高70.38%。這些均與前人研究結(jié)果相類似，這可能是因?yàn)閿M康氏木霉通過與黃瓜互作，誘導(dǎo)病原菌侵染條件下黃瓜植株產(chǎn)生CAT、POD、SOD、APX、PPO等保護(hù)性酶，清除了植物體內(nèi)活性氧(ROS)[36]，降低了MDA含量，增加了Pro含量[37]，緩解了病害脅迫下膜脂過氧化作用對細(xì)胞膜的傷害，但本研究中僅對葉片中相關(guān)抗氧化指標(biāo)進(jìn)行了研究，在后續(xù)試驗(yàn)中，將對根系相關(guān)生理指標(biāo)進(jìn)行系統(tǒng)研究，進(jìn)一步充實(shí)擬康氏木霉厚垣孢子菌劑對黃瓜生長的促生抗病機(jī)理。

4 結(jié) 論

擬康氏木霉886厚垣孢子菌劑通過提高黃瓜幼苗保護(hù)酶活性，改善了生理活性，促進(jìn)了幼苗形態(tài)建成，增強(qiáng)了黃瓜對枯萎病的抗性。其中以T3即105cfu·g-1擬康氏木霉厚垣孢子菌劑應(yīng)用效果最好，在黃瓜播種后30 d，黃瓜幼苗葉片中CAT、POD、SOD、APX、PPO分別比CK提高了119.96%、213.75%、139.29%、97.53%、101.15%，MDA含量、質(zhì)膜透性分別比CK降低46.10%和60.28%，Pro含量比CK高70.38%。同時，T3處理黃瓜幼苗株高、莖粗、葉面積、根體積、根冠比和壯苗指數(shù)分別比CK高70.93%、50.76%、105.41%、200.00%、51.47%、68.75%，對黃瓜枯萎病的防效達(dá)到83.98%。