王英娜,王佳瑋,夏依婷,劉 濤,李聯(lián)歡,劉建利,康 鵬,李素芬

(1.北方民族大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，國家民委黃河流域農(nóng)牧交錯區(qū)生態(tài)保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧夏特殊生境微生物資源開發(fā)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧夏 銀川 750021；2.西鄂爾多斯國家級自然保護(hù)區(qū)管理局,內(nèi)蒙古 鄂爾多斯 014300)

干旱作為最主要的非生物脅迫因素限制了干旱和半干旱地區(qū)農(nóng)作物生長，導(dǎo)致生產(chǎn)力大幅降低，進(jìn)而造成巨大的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)損失[1]。干旱區(qū)約占全球陸地表面積的41%，全球約38%以上的人口生存依賴干旱區(qū)。我國旱區(qū)約占國土面積的53%～68%，其中西北內(nèi)陸荒漠草原、黃土高原、黃河流域的絕大部分區(qū)域都屬于干旱區(qū)[2-3]。

植物微生物作為植物的“第二基因組”存在于根際或根內(nèi)，有研究表明植物微生物有助于提高宿主植物對不良環(huán)境的抗性[4-6]。內(nèi)生真菌作為這些有益微生物的重要組成部分廣泛存在于植物組織中，相較于根際微生物，內(nèi)生真菌可與宿主形成較強(qiáng)的共生關(guān)系[7-9]。研究表明內(nèi)生真菌有利于提高宿主植物應(yīng)對干旱脅迫的能力,尤其以專性共生的禾草內(nèi)生真菌(Epichlo?spp.)、印度梨形孢(Piriformosporaindica)和深色有隔內(nèi)生真菌(DSE)研究居多。李飛[10]和夏超[11]研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)生真菌(Epichlo?gansuensis)與醉馬草(Achnatheruminebrians)共生提高了宿主抗旱性。張雪[12]、任穎[13]、He等[14]和Liu等[15]報道了DSE提高植物抗旱性。蒿若超等[16]、韋巧等[17]、徐樂等[18]和Xu等[19]報道了印度梨形孢提高植物抗旱性。

西鄂爾多斯是我國干旱半干旱地區(qū)生物多樣性保育的關(guān)鍵地區(qū)以及全球溫帶草原灌木物種起源地和分布中心。該地區(qū)的植被類型主要包括沙生植被、草原化荒漠植被、荒漠植被和干旱草原植被，且超旱生灌木、半灌木在植物群落中占據(jù)生態(tài)位優(yōu)勢。由于該區(qū)地處草原向荒漠的過渡帶，加之邊緣效應(yīng)及古地理等原因，故該地區(qū)生長著豐富的古地中海孑遺植物、亞洲中部珍稀瀕?；哪参锛拔覈赜兄参?，如沙冬青(Ammopiptanthusmongolicus)、四合木(Tetraenamongolica)、綿刺(Potaniniamongolica)、半日花等(Helianthemumsongaricum)[20]，這些超旱生植物共生微生物資源急需開發(fā)利用。

青貯玉米作為食草家畜的優(yōu)質(zhì)飼料在寧夏和內(nèi)蒙河套地區(qū)農(nóng)牧交錯帶干旱半干旱地區(qū)種植面積較大，但由于其種植需水量大，對水分脅迫敏感，產(chǎn)量受干旱影響較大[21]。因此，加強(qiáng)青貯玉米抗旱性的微生物菌劑研究對于干旱半干旱地區(qū)青貯玉米種植具有重要意義[22]。本研究用從西鄂爾多斯荒漠強(qiáng)旱生植物四合木、綿刺和沙冬青根內(nèi)分離出的8株內(nèi)生真菌和1株內(nèi)生真菌模式種印度梨形孢接種青貯玉米幼苗，評價植株在聚乙二醇6000(PEG6000)模擬干旱脅迫下植株的抗旱能力，檢測荒漠強(qiáng)旱生植物內(nèi)生真菌能否幫助異源宿主植物提高抗旱性，研究成果可為開發(fā)利用荒漠超旱生植物共生微生物資源奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試內(nèi)生真菌菌株共9株：菌株Tm02、Tm30、Tm36分離自四合木根內(nèi)，菌株P(guān)m06、Pm37、Pm38和Pm53分離自綿刺根內(nèi)，菌株Am04分離自沙冬青根內(nèi)，印度梨形孢購自中國普通微生物菌種保藏管理中心。青貯玉米品種為‘寧丹33’，購自寧夏潤豐種業(yè)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 供試內(nèi)生真菌制備 將供試菌株接種到PDA固體培養(yǎng)基上27℃培養(yǎng)7 d，待菌絲長滿平板后用滅菌后的1 mL槍頭打成菌餅，將5個菌餅接入200 mL PDA液體培養(yǎng)基中，在溫度28℃和轉(zhuǎn)速180 r·min-1條件下培養(yǎng)5 d，將培養(yǎng)液用榨汁機(jī)打碎，用PDA液體培養(yǎng)基調(diào)整OD600值為0.932用于接種。

1.2.2 盆栽青貯玉米幼苗 挑選大小一致且顆粒飽滿的玉米種子自來水沖洗后采用無菌水浸泡12 h，用2.5%次氯酸鈉溶液表面消毒3 min，無菌水沖洗3～4次，再用70%酒精消毒5 min，無菌水沖洗3～4次，最后用0.1%氯化汞溶液消毒1 min，無菌水沖洗3～4次。將消毒后的種子置于水瓊脂培養(yǎng)基上，在28℃培養(yǎng)箱中催芽，2 d后胚根長度達(dá)2 cm左右。

蛭石80℃干熱滅菌6 h后，裝入酒精消毒后的花盆(盆高14.0 cm,上口徑20.1 cm,下口徑12.9 cm)。將催芽后的種子種入花盆中，每盆3粒種子，試驗(yàn)設(shè)置9株內(nèi)生真菌和1個陰性對照組共10個處理，接種陽性對照印度梨形孢處理為E+，未接種陰性對照處理為E-，其余每組處理按菌株編號標(biāo)記，每個處理分為干旱脅迫組(D+)與非干旱脅迫組(D-)，每組各6盆，共120盆。

1.2.3 回接內(nèi)生真菌試驗(yàn) 種子移入盆中10 d后，輕輕撥開三葉期青貯玉米幼苗根部土壤，使其根系裸露出來，將10 mL內(nèi)生真菌培養(yǎng)液圍繞青貯玉米幼苗根系四周進(jìn)行澆灌，對照組以等體積的無菌PDA液體培養(yǎng)基灌根處理，每株內(nèi)生真菌接種12盆，接種后3 d不澆水或營養(yǎng)液，平時用燒杯澆800 mL無菌水，每3 d澆一次30 mL無菌的Hoagland’s營養(yǎng)液，將每個處理盆栽隨機(jī)擺放，為規(guī)避位置效應(yīng)，每7 d挪動位置，培養(yǎng)25 d左右至拔節(jié)期。

1.2.4 PEG6000模擬干旱脅迫試驗(yàn) 將E-、E+和每個接種內(nèi)生真菌拔節(jié)期青貯玉米幼苗各取6盆置于托盤中，向托盤內(nèi)倒入深度為10 cm的30% PEG6000(-1.2 MPa)溶液，確保盆中蛭石能將PEG6000溶液上吸，另6盆托盤中放置等體積的無菌水作為非干旱脅迫對照，約2周后，當(dāng)E-干旱脅迫處理植株葉片全部萎蔫卷曲時停止脅迫。

1.2.5 植株生理指標(biāo)測定 地上部分生理指標(biāo)參考黃倩等[23]和郝建軍等[24]方法進(jìn)行測定，采用丙酮提取法[24]測定葉綠素含量，采用茚三酮法測定脯氨酸含量，采用硫代巴比妥酸法測定丙二醛含量，采用愈創(chuàng)木酚法測定過氧化物酶活性，采用分光光度法測定過氧化氫酶活性，采用氮藍(lán)四唑光化還原法測定超氧化物歧化酶活性。根系生理指標(biāo)參考陳鵬獅等[25]方法測定。

1.2.6 染色鏡檢青貯玉米幼苗根系侵染 參考陳思杰等[26]和Mcgonigle等[27]方法稍作修改：將青貯玉米幼苗根系用自來水沖洗干凈，隨機(jī)挑選直徑小于2 mm的細(xì)根剪成1 cm長的根段，各處理分開放置，共10個試管，向各試管中加入10% KOH溶液淹沒根樣，90℃水浴加熱1 h后倒掉KOH溶液，用無菌水沖洗干凈控干水分，加入10%堿性H2O2溶液室溫放置30 min，倒掉H2O2溶液無菌水沖洗干凈控干水分后加入1% HCl溶液浸泡5 min，倒掉HCl溶液后加入0.05%臺盼藍(lán)染液室溫染色25 min，倒去染液，將染色后的根樣置于乳酸甘油混合液中脫色12 h，每10個根段置于一個載玻片上，蓋上并輕敲蓋玻片，將根段組織均勻分散在載玻片上，觀察并統(tǒng)計侵染率。

侵染率(%)=受侵染根段數(shù)/總鏡檢根段數(shù)×100%

(1)

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

相對含水量(RWC)=[(樣品鮮重-樣品干重)/(樣品飽和鮮重-樣品干重)]×100%

(2)

抗旱系數(shù)計算公式：只選E-干旱脅迫處理組和非干旱脅迫處理組測定值有顯著差異的指標(biāo)計算抗旱系數(shù)。

MDA含量抗旱系數(shù)(DTC)=-(干旱脅迫測定值/未干旱脅迫測定值)

(3)

其余指標(biāo)耐旱系數(shù)(DTC)=干旱脅迫測定值/未干旱脅迫測定值[28-29]

(4)

采用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行主成分分析[28,30]和方差分析，采用Origin 2019軟件進(jìn)行回歸分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 接種內(nèi)真菌對青貯玉米幼苗地上部分抗旱性的影響

如圖1所示青貯玉米幼苗地上部分，E-所有干旱脅迫植株葉片均表現(xiàn)出卷曲萎蔫甚至出現(xiàn)枯死現(xiàn)象，而非干旱脅迫處理的植株生長正常。各接菌組脅迫植株均出現(xiàn)不同程度葉卷曲癥狀，其中接種菌株P(guān)m53、Pm06、Am04、Tm30較嚴(yán)重，E+及接種其它菌株的植株能在一定程度上緩解干旱脅迫對植株的影響。

為進(jìn)一步量化干旱脅迫對青貯玉米幼苗的影響，測定了非脅迫和干旱脅迫后的植株株高、基徑粗、總?cè)~片數(shù)、地上部分鮮重、地上部分干重等5個地上部分形態(tài)學(xué)性狀，以及葉綠素含量和葉相對含水量等2個生理指標(biāo)。研究發(fā)現(xiàn)，只有地上部分鮮重、葉相對含水量、葉綠素含量等指標(biāo)在E-的非干旱脅迫和干旱脅迫之間存在顯著差異，脅迫造成這3個指標(biāo)都比對應(yīng)的非脅迫值低。因此，只基于這3個指標(biāo)計算所得的抗旱系數(shù)均小于1.0。如圖2所示，各處理地上部分鮮重抗旱系數(shù)在0.6～0.8之間，其中E-、E+和菌株Am04處理最高，顯著高于接種其它組，菌株P(guān)m57處理最小，較E-組降低了30.59%；葉相對含水量抗旱系數(shù)也在0.6～0.8之間，其中E-和菌株Am04最高，顯著高于其他接種其它菌株，E+次之、菌株P(guān)m53最??；葉綠素含量抗旱系數(shù)在0.3～0.9之間(圖3)，其中菌株Am04 和Pm53最高，顯著高于其他組，菌株P(guān)m38和Tm30最小。

注：E-：未接種內(nèi)生真菌；E+：接種印度梨形孢；Pm38：接種內(nèi)生真菌Pm38；Pm57：接種內(nèi)生真菌Pm57；Pm53：接種內(nèi)生真菌Pm53；Tm36：接種內(nèi)生真菌Tm36；Pm06：接種內(nèi)生真菌Pm06；Am04：接種內(nèi)生真菌Am04；Tm30：接種內(nèi)生真菌Tm30；Tm02：接種內(nèi)生真菌Tm02；D+：干旱脅迫處理；D-：非干旱脅迫處理，后同。Note:E-:not inoculated with endophytic fungi;E+ :inoculated with Piriformis indica;Pm38:inoculated with endophytic fungi Pm38;Pm57:inoculated with endophytic fungi Pm57;Pm53:inoculated with endophytic fungi Pm53;Tm36:inoculated with endophytic fungi Tm36;Pm06:inoculated with endophytic fungi Pm06;Am04:inoculated with endophytic fungi Am04;Tm30:was inoculated with endophytic fungi Tm30;Tm02:was inoculated with endophytic fungi Tm02;D+:was a drought stress treatment,D-:was a non-drought stress treatment,the same later.圖1 干旱脅迫下接種內(nèi)生真菌對青貯玉米幼苗地上及地下部分影響Fig.1 The morphology of aboveground part and underground part of silage maize seedling inoculated with endophytic fungi under drought stress

2.2 接種內(nèi)生真菌對青貯玉米幼苗根系抗旱性的影響

如圖1所示青貯玉米幼苗地下部分根系，與非干旱脅迫相比，干旱脅迫后的青貯玉米幼苗植株根系均出現(xiàn)不同程度的體積增大和根數(shù)增多現(xiàn)象。

注：不同小寫字母表示差異顯著。下同。Note:Different lowercase letters indicate significant difference.The same below.圖2 接種內(nèi)生真菌對青貯玉米幼苗地上部分鮮重抗旱系數(shù)及葉相對含水量抗旱系數(shù)的影響Fig.2 Effects of endophytic fungi on the drought resistance coefficient of fresh weight and relative leaf water content of the aboveground part of silage maize seedlings inoculated with endophytic fungi

根表面積、根體積、根鮮重、根干重和根干物質(zhì)含量等5個指標(biāo)在E-的非干旱脅迫和干旱脅迫植株之間存在顯著差異，且在大多數(shù)接種組中，干旱脅迫造成除根鮮重外的4個指標(biāo)都比對應(yīng)的非干旱脅迫植株高。因此，基于這5個指標(biāo)所得的抗旱系數(shù)均大于1.0(除根鮮重)。如圖4所示，根體積抗旱系數(shù)在1.5～5.5之間，除菌株P(guān)m57和Pm53外，其他菌株均顯著高于E-組，其中菌株Tm36最大，為E-的3.55倍；根表面積抗旱系數(shù)在1.2～2.5之間，除菌株P(guān)m57和Pm53小于E-，菌株P(guān)m06和E-無差異外，其余菌株均顯著大于E-，其中菌株Tm36和Am04較高；根鮮重抗旱系數(shù)在0.3～0.6之間，只有接種Am04與E-組差異不顯著，其余均顯著低于E-；根干重抗旱系數(shù)在1.2～2.5之間，其中E-、菌株Tm02和Am04較高，菌株P(guān)m38和Tm30較低；根干物質(zhì)含量抗旱系數(shù)在1.5～5.0之間，除菌株P(guān)m53外，其余組菌株均大于E-組，其中E+最大，菌株P(guān)m38、Tm36、Am04和Tm02次之。

圖3 內(nèi)生真菌對青貯玉米幼苗葉綠素含量抗旱系數(shù)的影響Fig.3 Effect of endophytic fungi on the drought resistance coefficient of chlorophyll content of silage maize seedlings inoculated with endophytic fungi

圖4 內(nèi)生真菌對青貯玉米幼苗根系各指標(biāo)抗旱系數(shù)的影響Fig.4 Effect of endophytic fungi on every drought resistance coefficient of silage maize seedlings inoculated with endophytic fungi

2.3 接種內(nèi)生真菌對干旱脅迫下青貯玉米幼苗滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和保護(hù)酶的影響

植物體內(nèi)的脯氨酸(Pro)含量、膜脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)含量、保護(hù)酶超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)活性等指標(biāo)，干旱脅迫處理和非干旱脅迫處理之間均存在差異顯著，故以這5個指標(biāo)為基礎(chǔ)計算抗旱系數(shù)。

如圖5所示，干旱脅迫造成植株體內(nèi)滲透壓調(diào)節(jié)物質(zhì)Pro含量增加，因此其抗旱系數(shù)介于1.0～4.0之間，其中菌株Tm02最大，菌株P(guān)m38、Pm53和Tm30低于E-；干旱脅迫導(dǎo)致MDA含量增加或降低，其含量與植株抗旱性呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，因此其抗旱系數(shù)介于-0.3～-5.0之間，其中菌株P(guān)m53最大，菌株P(guān)m57最小；干旱脅迫導(dǎo)致SOD、POD和CAT等3種保護(hù)酶活性增高，因此導(dǎo)致其抗旱系數(shù)整體表現(xiàn)為大于1.0。如圖6所示，SOD抗旱系數(shù)介于1.0～6.0之間，其中菌株Tm02最高，是E-的1.63倍，其余菌株均低于E-。POD抗旱系數(shù)介于0.5～2.0之間，其中菌株P(guān)m57和Pm06小于1.0，其余菌株則大于1.0，菌株P(guān)m57、Tm36、Am04和E-無顯著差異，其余菌株均低于E-；CAT抗旱系數(shù)介于0.5～2.5之間，菌株P(guān)m57、Pm53、Pm06、Am04、Tm30小于1.0，其余菌株大于1.0，菌株E+、Tm36、Tm02最高，分別為E-的1.93倍、1.70倍和1.74倍。

圖5 內(nèi)生真菌對青貯玉米幼苗滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)抗旱系數(shù)的影響Fig.5 Effect of endophytic fungi on the drought resistance coefficient of osmotic adjustment of silage maize seedlings inoculated with endophytic fungi

圖6 內(nèi)生真菌對青貯玉米幼苗體內(nèi)保護(hù)酶抗旱系數(shù)的影響Fig.6 Effects of endophytic fungi on the drought resistance coefficient of protective enzymes of silage maize seedlings inoculated with endophytic fungi

2.4 各指標(biāo)抗旱性系數(shù)相關(guān)性分析

如表1所示，根干重抗旱系數(shù)和地上部分鮮重抗旱系數(shù)呈顯著正相關(guān)；根鮮重抗旱系數(shù)與根干重抗旱系數(shù)呈顯著正相關(guān)關(guān)系；根體積抗旱系數(shù)與根表面積抗旱系數(shù)呈極顯著正相關(guān)關(guān)系；根干重抗旱系數(shù)與SOD活性呈顯著正相關(guān)關(guān)系；CAT活性抗旱系數(shù)和Pro含量抗旱系數(shù)均與根干物質(zhì)含量抗旱系數(shù)呈顯著正相關(guān)關(guān)系。

2.5 指標(biāo)抗旱系數(shù)主成分分析

將13個指標(biāo)抗旱系數(shù)進(jìn)行主成分分析，前5個主成分的特征值均大于1，因此提取出5個主成分(F1～F5)，其貢獻(xiàn)率分別為32.812%、21.096%、14.049%、12.784%、9.589%，累計貢獻(xiàn)率為90.329%(表2)。主成分載荷矩陣中青貯玉米幼苗植株各項(xiàng)指標(biāo)主成分負(fù)荷的相對大小可以表示該指標(biāo)對主成分影響的程度。由表2可知，F(xiàn)1的所有指標(biāo)均起正向作用，其中根干重抗旱系數(shù)、地上部分鮮重抗旱系數(shù)和Pro含量抗旱系數(shù)對其正向作用較大；F2的根表面積抗旱系數(shù)和根干物質(zhì)含量抗旱系數(shù)正貢獻(xiàn)較大，根鮮重抗旱系數(shù)和根干重抗旱系數(shù)負(fù)貢獻(xiàn)較大；F3的MDA含量抗旱系數(shù)和POD含量抗旱系數(shù)正貢獻(xiàn)較大，相對含水量對其負(fù)向作用較大；F4中根體積抗旱系數(shù)正貢獻(xiàn)較大，CAT活性抗旱系數(shù)和SOD活性抗旱系數(shù)負(fù)貢獻(xiàn)較大；F5中葉綠素含量抗旱系數(shù)和SOD活性抗旱系數(shù)正貢獻(xiàn)較大，地上鮮重抗旱系數(shù)和POD活性抗旱系數(shù)負(fù)貢獻(xiàn)較大。

根據(jù)各指標(biāo)因子得分系數(shù)矩陣，構(gòu)建5個主成分的函數(shù)表達(dá)式，隨后根據(jù)每個主成分的貢獻(xiàn)率計算綜合得分，結(jié)果見表3(見 53頁)，與未接種菌株的E-組相比，接種菌株Am04、Tm36、Tm02和E+的青貯玉米幼苗植株綜合得分均高于E-，說明接種菌株Am04、Tm36、Tm02、印度梨形孢等4株內(nèi)生真菌可提高青貯玉米幼苗抗旱性，并以菌株Am04最優(yōu)；而接種菌株P(guān)m53、Tm30、Pm38、Pm06、Pm57等5株內(nèi)生真菌反而降低了青貯玉米幼苗抗旱性。

表1 各指標(biāo)抗旱系數(shù)相關(guān)性Table 1 Correlation analysis of various drought resistance coefficient

表2 各指標(biāo)抗旱系數(shù)的主成分特征值、方差貢獻(xiàn)率、累計貢獻(xiàn)率和成分載荷矩陣Table 2 Principal component eigenvalues,variance contribution rate,cumulative contribution rate and component loading matrix of drought resistance coefficient

圖7 青貯玉米幼苗根系內(nèi)生真菌侵染率 Fig.7 Infection rate of endophytic fungi in the root system of silage maize seedlings

2.6 接種內(nèi)生真菌系侵染率與抗旱系數(shù)相關(guān)性

菌液灌根20～25 d后，將青貯玉米幼苗根系進(jìn)行染色，顯微觀察內(nèi)生真菌侵入植物根系共生情況，E-內(nèi)未見根內(nèi)菌絲，E+和其余菌株接種菌發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)根內(nèi)存在菌絲，菌絲呈蜿蜒狀或直線型，可見分叉，具橫隔，具有絲狀真菌典型形態(tài)，接種菌株P(guān)m06植株根內(nèi)可見微菌核，其余菌株未見微菌核。

對各處理侵染率進(jìn)行方差分析，如圖7所示，E-侵染率為0，接種E+的在單個植株的平均根系侵染率最高(70%)，其余8株內(nèi)生真菌在單個植株的平均侵染率僅在20%～50%之間，遠(yuǎn)低于E+。

將侵染率與各指標(biāo)抗旱系數(shù)、抗旱系數(shù)主成分綜合得分進(jìn)行線性回歸，只有根鮮重抗旱系數(shù)與侵染率之間存在顯著線性相關(guān)(R2=0.346，P=0.043)，其余各指標(biāo)抗旱系數(shù)、抗旱系數(shù)主成分綜合得分都與侵染率之間均不存在顯著線性相關(guān)關(guān)系(表4，見54頁)。

3 討 論

本研究采用主成分分析法綜合分析接種9株內(nèi)生真菌的青貯玉米幼苗在PEG6000模擬重度干旱脅迫下與非干旱脅迫植株有顯著差異的13個指標(biāo)，接種Am04、Tm36、Tm02、印度梨形孢等4株內(nèi)生真菌可提高青貯玉米幼苗抗旱性，而接種Pm53、Tm30、Pm38、Pm06、Pm57等5株內(nèi)生真菌反而降低了青貯玉米幼苗抗旱性。接種印度梨形孢試驗(yàn)結(jié)果和徐樂等[18]、Xu等[19]、張文英等[31]報道的印度梨形孢提高玉米抗旱性一致，接種其它內(nèi)生真菌的結(jié)果與胡美玲等[32]報道的部分內(nèi)生真菌能提高玉米抗旱性一致。

在大多數(shù)接種菌劑提高植物抗逆性試驗(yàn)中，除與禾草共生的Epichlo?屬內(nèi)生真菌可以依靠檢測種子帶菌情況建立E+和E-植株外[10-11]，其它非專性共生內(nèi)生真菌與宿主植物共生體的建立均需在建立在種子消毒建立E-植株的基礎(chǔ)上，人工回接建立E+植株，然后再施以各種脅迫處理檢測內(nèi)生真菌對植物抗逆性影響，因此，試驗(yàn)中大多設(shè)置接菌+干旱處理組、未接菌+干旱處理組、未接菌+非干旱處理組。數(shù)據(jù)分析過程中，首先對未接菌+干旱處理組和未接菌+非干旱處理組各生理指標(biāo)絕對值進(jìn)行比較，確定干旱脅迫對植物產(chǎn)生了影響，然后各個接菌+干旱處理組和未接菌+干旱處理組各生理指標(biāo)絕對值比較，以及各個接菌+干旱處理組各生理指標(biāo)絕對值之間比較，確定接菌對植物抗旱性有無影響以及各個菌株影響力大小[12-19]。本研究中，在脅迫試驗(yàn)開始時，發(fā)現(xiàn)各接菌植株長勢差異較大，其原因是為確保脅迫試驗(yàn)中的植株均與接種內(nèi)生真菌共生，鏡檢發(fā)現(xiàn)內(nèi)生真菌侵染植物根部存在差異，部分侵染較慢，此時有些內(nèi)生真菌的促生作用已顯現(xiàn)，因此導(dǎo)致各接菌植株長勢差異很大。在脅迫試驗(yàn)結(jié)束后，直接比較各個接菌+干旱處理組和未接菌+干旱處理組，以及各個接菌+干旱處理(菌株組之間各生理指標(biāo)絕對值，以評價接種各種內(nèi)生真菌菌株對植物抗旱性影響大小，顯然不合理。因此，本試驗(yàn)參考朱志明等[28]和樸明鑫等[29]方法，避免接種各內(nèi)生真菌的植株脅迫試驗(yàn)前的長勢本底差異對脅迫后各生理指標(biāo)的影響，采用抗旱系數(shù)，即同一接菌處理組的干旱脅迫值/非干旱脅迫值來度量植株抗旱性，比較各生理指標(biāo)絕對值更能準(zhǔn)確反映植物抗旱能力的大小，抗旱系數(shù)越大代表植株抗旱性越強(qiáng)，這樣抗旱系數(shù)不同真正代表接種內(nèi)生真菌不同。

表3 不同處理青貯玉米幼苗的主成分得分、綜合得分(F) 及優(yōu)良度排序Table 3 Principal component score,comprehensive score (F) and goodness ranking of silage corn seedlings with different treatments

當(dāng)接菌植株受到干旱脅迫后，根表面積抗旱系數(shù)、根體積抗旱系數(shù)、根干重抗旱系數(shù)、根干物質(zhì)含量抗旱系數(shù)、Pro含量抗旱系數(shù)、CAT活性抗旱系數(shù)、SOD活性抗旱系數(shù)和POD活性抗旱系數(shù)等指標(biāo)抗旱系數(shù)大于1，說明脅迫造成這些指標(biāo)絕對值增高；而地上部分鮮重抗旱系數(shù)、葉相對含水量抗旱系數(shù)、葉綠素含量抗旱系數(shù)、根鮮重抗旱系數(shù)和MDA含量抗旱系數(shù)等指標(biāo)抗旱系數(shù)小于1，說明脅迫導(dǎo)致這些指標(biāo)絕對值降低，并且同一指標(biāo)抗旱系數(shù)在不同接菌處理間的變化幅度存在差異，鑒于采用各抗旱系數(shù)之間比較，很難獲得統(tǒng)一結(jié)論，其原因是植物的抗旱性是一個復(fù)雜綜合能力，是多因素共同作用的結(jié)果，在不同的生理指標(biāo)上體現(xiàn)出的變化幅度并不相同，采用某單一指標(biāo)未必能夠直觀、準(zhǔn)確地評價其抗旱性。為了彌補(bǔ)單一指標(biāo)評價的不足，本試驗(yàn)參考朱志明等[28]和朱娟娟等[30]方法，以13個指標(biāo)抗旱系數(shù)為基礎(chǔ)，采用主成分分析法綜合評價抗旱性更客觀、科學(xué)。

內(nèi)生真菌侵染植物并與植物建立共生體，影響植物生長、發(fā)育和次生代謝產(chǎn)物積累，以往的研究中很少有檢測內(nèi)生真菌與植物是否形成共生體的報道，并未證明接種的內(nèi)生真菌是否真正在植物體內(nèi)“內(nèi)生”，尤其在接種異源植物的研究中更是如此。本試驗(yàn)通過染色鏡檢，發(fā)現(xiàn)印度梨形孢在單個青貯玉米幼苗植株的平均侵染侵染率高達(dá)70%，另外8株內(nèi)生真菌對單個青貯玉米幼苗植株的平均侵染率僅在20%～50%之間。用侵染率與各指標(biāo)抗旱系數(shù)、抗旱系數(shù)主成分分析綜合得分進(jìn)行線性回歸分析，表明只有根鮮重抗旱系數(shù)與侵染率之間存在顯著線性關(guān)系(P<0.05)，說明共生成功只是內(nèi)生真菌影響植物的前提條件，內(nèi)生真菌在植物體內(nèi)的生物量、菌株刺激植物的機(jī)制、植物應(yīng)答內(nèi)生真菌的機(jī)制等都可能影響內(nèi)生真菌對植物的效應(yīng)。

表4 侵染率與各指標(biāo)抗旱系數(shù)及主成分綜合得分線性回歸分析Table 4 Linear regression analysis diagram of infection rate, drought resistance coefficient of each index and principal component comprehensive score

植物面對脅迫時，會從各個方面對脅迫做出響應(yīng)，本試驗(yàn)選取在未接菌(E-)組的非干旱脅迫和干旱脅迫植株之間差異顯著的地上部分鮮重、葉相對含水量、葉綠素含量、根體積、根表面積、根鮮重、根干重、根干物質(zhì)含量、Pro含量、MDA含量、CAT活性、SOD活性、POD活性等13個生理指標(biāo)進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)雖然接種Am04、Tm36、Tm02、印度梨形孢等4株內(nèi)生真菌可提高青貯玉米幼苗抗旱性，但各菌株對這些指標(biāo)的影響存在較大差異。菌株Am04可顯著降低地上部鮮重的損失，增加葉片的保水性、玉米植株根體積與根表面積、根系保水性和干物質(zhì)累積；同時提高植株體內(nèi)過氧化物酶活性，增加脯氨酸和葉綠素含量，并且能顯著降低丙二醛含量，最大化減少植株受干旱脅迫的損傷。菌株Tm36可顯著增加根系體積與表面積，顯著降低青貯玉米幼苗體內(nèi)丙二醛的累積；菌株Tm02可增加根系干物質(zhì)的累積，顯著提高過氧化氫酶活性，增加脯氨酸含量降低丙二醛的積累；印度梨形孢可以影響地上部鮮重和根干物質(zhì)含量，還可以顯著增加脯氨酸含量并顯著降低丙二醛含量。以上分析可以看出菌株Am04幫助植株對干旱脅迫的響應(yīng)是從形態(tài)到生理生化多方面的，而其余3種菌株則更側(cè)重于抗氧化系統(tǒng)的酶活性和細(xì)胞滲透物質(zhì)的調(diào)節(jié)。

4 結(jié) 論

用內(nèi)生真菌模式種印度梨形孢和分離自荒漠強(qiáng)旱生植物根系的8株內(nèi)生真菌接種青貯玉米幼苗，所有菌株均能侵入青貯玉米幼苗根系形成共生，但侵染率存在差異，且侵染率和大多數(shù)抗旱性生理指標(biāo)之間無相關(guān)性；基于13個生理指標(biāo)進(jìn)行主成分分析，表明只有Am04、Tm36、Tm02、印度梨形孢等4株內(nèi)生真菌可提高青貯玉米幼苗抗旱性，并以菌株Am04最優(yōu)；而Pm53、Tm30、Pm38、Pm06、Pm57等5株內(nèi)生真菌并未提高青貯玉米幼苗抗旱性。