王彩霞， 王俊怡， 黎夏彤， 舒 婷， 王小波， 王 詩(shī)*

(湖北科技學(xué)院藥學(xué)院，湖北咸寧 437100)

1 引言

生命體結(jié)構(gòu)和功能的基本單元為細(xì)胞，細(xì)胞則通過(guò)釋放各種信號(hào)分子進(jìn)行胞間信息傳導(dǎo)交流，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)機(jī)體整體功能調(diào)節(jié)控制，如果信號(hào)分子在生命系統(tǒng)中異常表達(dá)會(huì)導(dǎo)致多種疾病。NO是由NO合酶產(chǎn)生的親脂性、高度擴(kuò)散性的氣體信號(hào)分子[1]，高水平NO可造成細(xì)胞毒性與亞硝基應(yīng)激，與腦缺血、腦部感染和神經(jīng)退行性疾病的神經(jīng)元死亡有關(guān)[2]。H2S不僅是血管調(diào)節(jié)分子，還是大腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)調(diào)質(zhì)信號(hào)分子，參與學(xué)習(xí)、記憶和疼覺(jué)調(diào)節(jié)，H2S的異常產(chǎn)生和代謝與缺血性中風(fēng)、阿爾茲海默癥、帕金森氏病和癲癇發(fā)作的機(jī)制相關(guān)[3]。H2O2作為信使分子，通過(guò)細(xì)胞和組織擴(kuò)散可引發(fā)細(xì)胞形狀改變、細(xì)胞增殖和免疫細(xì)胞增殖等細(xì)胞效應(yīng)[4]，涉及多種退行性改變或氧化應(yīng)激有關(guān)的疾病[5]。因此，對(duì)細(xì)胞釋放的生物信號(hào)分子進(jìn)行準(zhǔn)確、實(shí)時(shí)和動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，對(duì)認(rèn)識(shí)胞間信息交流機(jī)制、分析正常生理過(guò)程，以及揭示疾病的分子機(jī)制具有重要意義。由于細(xì)胞釋放的各種信號(hào)分子濃度較低，半衰期短[6]，檢測(cè)必須具有高靈敏度、高選擇性及快速響應(yīng)能力的特點(diǎn)。

近年來(lái)，電化學(xué)分析方法發(fā)展迅速，如電化學(xué)陣列傳感器、微電極電化學(xué)檢測(cè)，以及活體、微區(qū)或單細(xì)胞分析等技術(shù)已被用于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞釋放的生物信號(hào)分子。電化學(xué)陣列傳感器以陣列中每根電極所產(chǎn)生的電化學(xué)信號(hào)為檢測(cè)信號(hào)，具有高通量、快速和高選擇性等特性[7]。隨著微電子技術(shù)的應(yīng)用，傳感器陣列技術(shù)的發(fā)展可以減少樣品體積降至亞微升水平，但其對(duì)于細(xì)胞特異性較低[8]。活體電化學(xué)分析能夠更加真實(shí)直接地反映各種生理病理過(guò)程中對(duì)外界刺激的反應(yīng)[9]，但生命體系復(fù)雜性，分子間相互作用多樣性使活體電化學(xué)傳感器面臨嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。單細(xì)胞分析技術(shù)精密度高，但是難以實(shí)現(xiàn)高通量[10]。因此，利用合適的檢測(cè)手段實(shí)現(xiàn)細(xì)胞釋放生物信號(hào)分子的實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)仍然充滿挑戰(zhàn)。電化學(xué)分析中未修飾電極容易受到外界或者內(nèi)部干擾，因此研究者們利用納米材料固定細(xì)胞，用以保持細(xì)胞的生物活性并提高電化學(xué)響應(yīng)信號(hào)。因此，尋找具有易于制備、低成本、高穩(wěn)定性等優(yōu)點(diǎn)的納米材料一直是研究的重點(diǎn)[11]，如：納米金屬材料，包括金屬納米顆粒(Au、Pt、Ag、Cu等)[12]、金屬氧化物(Cu2O等)[13]，具有高比表面積、高電子遷移率、熱穩(wěn)定性和機(jī)械強(qiáng)度等特性[14]；納米非金屬材料如石墨烯[15]、碳納米管[16]、碳納米纖維和碳量子點(diǎn)[17]等，具有較大比表面積、高導(dǎo)電性，可再生性和結(jié)構(gòu)多樣化等特點(diǎn)[18]；納米復(fù)合材料如金屬材料或非金屬材料與碳材料復(fù)合，復(fù)合后電化學(xué)反應(yīng)活性增強(qiáng)，材料的力學(xué)性能得到顯著提升，具有極高的可塑性和強(qiáng)度[19]，可更準(zhǔn)確快速的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞釋放的生物信號(hào)分子。

本文通過(guò)總結(jié)近年基于納米材料的電化學(xué)傳感器用于檢測(cè)細(xì)胞釋放的生物信號(hào)分子的研究進(jìn)展，為未來(lái)深入研究細(xì)胞傳感器提供參考。

2 碳納米材料

2.1 碳納米管

碳納米管(CNTs)是單層或多層石墨片圍繞中心軸按一定的螺旋角卷曲而成的無(wú)縫納米級(jí)管，具有優(yōu)異的力學(xué)、電子、熱力學(xué)等特性[20]。Bai等[16]利用碳點(diǎn)(CDs)修飾的多壁碳納米管(MWNTs)提高傳感器的電催化活性，用于實(shí)時(shí)檢測(cè)從細(xì)胞中釋放的H2O2。Du等[21]通過(guò)將單壁碳納米管(SWNTs)和Nafion膜修飾到碳纖維微盤(pán)電極表面，用于單個(gè)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞NO釋放的實(shí)時(shí)檢測(cè)。Sahraoui等[22]將(APy)6[H2W12O40] 共價(jià)接枝到SWNTs-COOH表面，對(duì)H2O2的檢測(cè)靈敏度提高了38.5倍。

2.2 石墨烯

石墨烯(Graphene,Gr)是一種具有單原子厚度的二維碳材料，sp2鍵合C原子緊密堆積在蜂窩晶格結(jié)構(gòu)中，具有高導(dǎo)熱性、化學(xué)柔韌性、優(yōu)異的電子特性和機(jī)械強(qiáng)度[23]。Guo等[24]在芘丁酸功能化Gr表面共價(jià)結(jié)合RGD肽構(gòu)建仿生膜供細(xì)胞附著生長(zhǎng)。該仿生膜修飾傳感器具有出色的選擇性和穩(wěn)定性，能夠?qū)崟r(shí)檢測(cè)細(xì)胞釋放的NO。Yusoff等[25]利用Gr修飾玻碳電極(GCE)，該修飾電極對(duì)NO的氧化表現(xiàn)出出色的電催化性能。Hu等[26]將3-氨基苯基硼酸(3-Aminophenylboronic acid，3-APBA)的仿生特性與Gr泡沫的電化學(xué)特性相結(jié)合，開(kāi)發(fā)了一種3-APBA功能化的Gr泡沫網(wǎng)絡(luò)，可用于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)從三維支架培養(yǎng)的細(xì)胞中釋放的H2S。Devi等[27]也報(bào)道了一種9，10-苯醌系氧化Gr修飾的GCE，用于包含H2S在內(nèi)的硫化物離子的電催化氧化分析。Manibalan等[28]利用氧化石墨烯(GO)膜修飾電極作為傳感器，可以實(shí)時(shí)定量檢測(cè)大腸桿菌內(nèi)產(chǎn)生的H2S。

3 金屬納米材料

各種金屬納米粒子Cu、Ag、Ti等因其獨(dú)特物理化學(xué)特性具有低毒、高表面積和易于表面功能化等特點(diǎn)，被廣泛用于制造非酶型H2O2傳感器。Qi等[29]開(kāi)發(fā)了一種基于Fe3O4-Ag納米材料的電化學(xué)傳感器，可以在0.5 μmol/L～4.0 mmol/L的線性范圍內(nèi)檢測(cè)H2O2。Kang等[30]在不添加表面活性劑的情況下，通過(guò)電沉積和電流置換反應(yīng)，在Cu箔上合成樹(shù)枝狀納米Ag-Cu，將其修飾在電極上進(jìn)行H2O2檢測(cè)，結(jié)果顯示納米Ag-Cu具有良好電還原活性。Yin等[31]采用在納米多孔Au表面電沉積Pt納米顆粒(Pt NPs)的方法修飾Au電極，由于Pt MPs對(duì)H2O2具有良好電催化活性，納米多孔Au可增加有效表面積并促進(jìn)電子轉(zhuǎn)移能力，結(jié)果顯示H2O2檢測(cè)的線性范圍為1.0×10-7～2.0×10-5mol/L。Karuppiah等[32]構(gòu)建了基于Pd NPs和Nafion修飾的超高選擇性和高靈敏的無(wú)酶型H2O2傳感器。此外，PtW納米晶體和MoS2納米片結(jié)合形成的雜化納米材料對(duì)H2O2的還原也具有良好的催化反應(yīng)[33]。

過(guò)渡金屬磷化物因其類金屬特性表現(xiàn)出極好電催化還原活性。Li等[34]通過(guò)制備磷酸銅納米線，首次實(shí)現(xiàn)了基于過(guò)渡金屬磷化物材料的傳感器。構(gòu)建的這種傳感器用于檢測(cè)腫瘤細(xì)胞釋放的H2O2，檢測(cè)限達(dá)到 2 nmol/L。

電化學(xué)傳感器檢測(cè)細(xì)胞中釋放的H2S鮮有報(bào)道。Zhao等[35]利用Au-Ag核殼-納米粒修飾電極用于檢測(cè)Hela細(xì)胞釋放的H2S，其線性范圍為0.1～500 nmol/L。

4 納米復(fù)合材料

4.1 復(fù)合金屬/碳材料

與單獨(dú)的碳材料相比，復(fù)合金屬/碳材料可以提供獨(dú)特的特性[36]。各種Gr -金屬納米粒子已用于H2O2的檢測(cè)，如Gr與Ag納米粒[37]、Pt納米粒[38]、Au納米粒[39]等的結(jié)合使電化學(xué)傳感器表現(xiàn)出優(yōu)異電催化性能。Gr與金屬氧化物結(jié)合而成的納米復(fù)合材料用于H2O2檢測(cè)也是熱點(diǎn)之一。Fang等[40]基于Fe3O4-還原氧化石墨烯(RGO)納米復(fù)合材料，制備了一種無(wú)酶型電化學(xué)傳感器，并用于檢測(cè)從Hela細(xì)胞釋放的H2O2。

MnO2對(duì)H2O2有電催化活性[41]。Dong等[42]采用MnO2納米線/RGO為柔性電極，檢測(cè)巨噬細(xì)胞釋放的H2O2，方法具有良好的穩(wěn)定性、選擇性和重現(xiàn)性。也有研究者合成羥基氧化鈷納米薄片組合在GO表面，表現(xiàn)出優(yōu)異電化學(xué)性能，H2O2的檢測(cè)限為0.01 μmol/L[43]。Wang等[44]將NiCo2O4-CoNiO2納米材料嵌入Gr中，將該復(fù)合材料修飾電極用于檢測(cè)從癌細(xì)胞中釋放的H2O2，結(jié)果顯示傳感器表現(xiàn)出高靈敏度和低檢測(cè)限(0.41 μmol/L)。

細(xì)胞釋放的NO濃度低、半衰期短，因此監(jiān)測(cè)細(xì)胞中NO含量需要傳感器有足夠的靈敏度和生物相容性。Liu等[45]利用Au納米材料和CNTs的復(fù)合納米材料，設(shè)計(jì)了一種可伸縮電化學(xué)傳感器，該復(fù)合納米材料不僅具有極好的細(xì)胞相容性，還具有出色的電化學(xué)性能。研究表明，Gr-Au納米復(fù)合材料[46]、CeO2-RGO納米復(fù)合材料[47]、Pt-Fe(Ⅲ)氧化物納米復(fù)合材料[48]修飾的電化學(xué)傳感器也對(duì)NO的檢測(cè)表現(xiàn)出明顯的電催化反應(yīng)。Dou等[49]在氮摻雜石墨烯片上生長(zhǎng)高度分散的Au納米材料檢測(cè)癌細(xì)胞中釋放的NO。Xu等[50]合成的酞菁功能化的氮摻雜Gr納米復(fù)合材料也表現(xiàn)出優(yōu)異電催化活性，該復(fù)合材料修飾電極可以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)活細(xì)胞釋放的NO。

復(fù)合金屬材料/碳材料也廣泛用于H2S的檢測(cè)。Asif等[51]在導(dǎo)電CNTs支架上接CuMn層狀雙氫氧化物納米片，形成獨(dú)特的核-殼結(jié)構(gòu)，因核-殼結(jié)構(gòu)有大量表面活性部位和層狀雙氫氧化物優(yōu)越的比表面積，對(duì)活細(xì)胞釋放的H2S氧化表現(xiàn)出優(yōu)秀的電催化活性。Shang等[52]設(shè)計(jì)了基于GO/亞甲基藍(lán)/Ag納米復(fù)合材料的電化學(xué)傳感器用于檢測(cè)生物樣品中H2S，由于GO的良好吸附能力和樹(shù)枝狀A(yù)g納米結(jié)構(gòu)，該電化學(xué)傳感器具有高靈敏度、高選擇性和良好的穩(wěn)定性。

4.2 復(fù)合非金屬/碳材料

Balamurugan等[53]將普魯士藍(lán)微立方體與Gr化CNTs混合，通過(guò)水熱法形成納米復(fù)合材料，用于修飾電極來(lái)實(shí)時(shí)追蹤哺乳動(dòng)物細(xì)胞釋放的H2O2，結(jié)果顯示該傳感器具有響應(yīng)速度快、檢測(cè)限低的特點(diǎn)。Jiao等[54]利用聚二烯丙基二甲基氯化鈉封端的RGO烯納米片組成有效電極用于動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)細(xì)胞內(nèi)H2O2，線性范圍為0.05 μmol/L～5.5 mmol/L，檢測(cè)限為1.2 nmol/L。Zhang等[55]基于還原的血紅蛋白和SWCNTs研制了一種高靈敏度生物傳感器，用于檢測(cè)從活細(xì)胞中釋放的H2O2，研究表明所制備的傳感器對(duì)H2O2檢測(cè)表現(xiàn)出高的靈敏度、選擇性和親和性。

此外，將CNTs與聚合物如聚苯胺[56]、聚乙醇烯[57]、聚吡咯[58]等形成CNTs/聚合物復(fù)合材料也顯示出良好電催化反應(yīng)。量子點(diǎn)(Quantum Dots，QDs)具有良好的細(xì)胞相容性、低細(xì)胞毒性的特點(diǎn)[59]也成為近年來(lái)研究熱點(diǎn)。Zhang等[60]設(shè)計(jì)了新型N、S摻雜的QDs/Gr雜化納米片，可催化Raw 264.7細(xì)胞釋放的H2O2的還原反應(yīng)。Cai等[61]發(fā)現(xiàn)Co3O4QDs-胺化碳納米管(ACNTs)對(duì)H2O2還原的電催化效應(yīng)遠(yuǎn)高于Co3O4納米顆粒-ACNTs。

復(fù)合非金屬材料/碳材料也可用作催化NO的電催化媒介。Zheng等[62]利用偶氮胭脂紅B功能化的MWCNTs設(shè)計(jì)了一種電化學(xué)傳感器，該傳感器用于檢測(cè)鼠肝臟細(xì)胞中釋放的NO，結(jié)果表明在2.2×10-7～1.2×10-4mol/L范圍內(nèi)，氧化電流隨NO濃度呈線性增加，表現(xiàn)出高的穩(wěn)定性、靈敏度和選擇性。

5 結(jié)語(yǔ)

本文綜述了基于碳、金屬等納米材料的電化學(xué)傳感器檢測(cè)細(xì)胞釋放的NO、H2S及H2O2。納米材料的納米級(jí)尺寸可以增加檢測(cè)靈敏度；高導(dǎo)電性加快了電子轉(zhuǎn)移能力；生物相容性為檢測(cè)細(xì)胞釋放的各種信號(hào)分子提供了更多的可能性。但納米材料也存在一些問(wèn)題，例如機(jī)制不確定，合成制備較復(fù)雜影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性與重現(xiàn)性等。因此，發(fā)展具有更出色催化活性并安全可靠的新型納米材料勢(shì)在必行。

細(xì)胞分泌的各種信號(hào)分子在機(jī)體整體調(diào)節(jié)中起至關(guān)重要作用，而檢測(cè)各種信號(hào)分子的方法對(duì)正常生理過(guò)程及揭示疾病的分子機(jī)制具有重要意義。近年來(lái)，細(xì)胞電化學(xué)傳感器迅速發(fā)展，在細(xì)胞的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)上已經(jīng)得極大進(jìn)步。然而不同疾病情況下細(xì)胞所呈現(xiàn)不同狀態(tài)，利用細(xì)胞電化學(xué)傳感器精確測(cè)定不同狀態(tài)下細(xì)胞釋放的信號(hào)分子仍具有挑戰(zhàn)。細(xì)胞電化學(xué)傳感器領(lǐng)域還有待于人們更加系統(tǒng)而深入的研究，若能連續(xù)監(jiān)測(cè)不同生理病理?xiàng)l件下細(xì)胞所釋放的生物信號(hào)分子，將更有利于為臨床分析提供依據(jù)。