余耀華，張兵，張華

(鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院 a.呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科一病區(qū)；b.泌尿外科，河南 鄭州 450000)

嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)引發(fā)了新型冠狀病毒肺炎(coronavirus disease 2019，COVID-19)的全球大流行，給人類生命健康和公共安全帶來了巨大威脅[1-2]。先天免疫是抗病毒防御的第一道防線，SARS-CoV-2能夠激活模式識別受體(pattern-recognition receptors，PRRs)觸發(fā)下游級聯(lián)信號分泌干擾素、腫瘤壞死因子和白細(xì)胞介素等細(xì)胞因子，而細(xì)胞因子進(jìn)一步誘導(dǎo)抗病毒程序并增強(qiáng)適應(yīng)性免疫反應(yīng)[3]。在病毒感染持續(xù)刺激下，先天免疫和適應(yīng)性免疫的過度激活，將導(dǎo)致大量炎癥細(xì)胞因子分泌和T細(xì)胞反應(yīng)失衡，引發(fā)“炎癥風(fēng)暴”，加重全身炎癥反應(yīng)[3-5]。研究表明，COVID-19更傾向于一種免疫相關(guān)疾病，感染者常伴有中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞減少，以及促炎基因和先天免疫基因的高表達(dá)[4,6-8]。然而，COVID-19患者先天免疫基因表達(dá)改變及其與免疫細(xì)胞豐度的關(guān)系仍不清楚。本研究采用生物信息學(xué)分析方法，利用GEO公共數(shù)據(jù)庫中公開數(shù)據(jù)，探討COVID-19患者外周血先天免疫基因表達(dá)改變及其與24種免疫細(xì)胞豐度的關(guān)系。

1 數(shù)據(jù)與方法

1.1 數(shù)據(jù)獲取使用NCBI GEO數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)[9]，以“COVID-19”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索。篩選條件：(1)轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)集；(2)外周血樣本；(3)樣本來源的患者年齡、性別和人種信息完整。最終選擇了基于Illumina NovaSeq 6000測序平臺的GSE161731數(shù)據(jù)集，共包括198例外周血樣本，本研究選取了其中77例COVID-19患者樣本和19例健康對照樣本納入分析。

1.2 基因重注釋和差異表達(dá)基因篩選下載GENCODE(https://www.gencodegenes.org/)[10]人類基因組GRCh38注釋文件對GSE161731數(shù)據(jù)集原始測序數(shù)據(jù)進(jìn)行重注釋，并以校正后P<0.05及差異倍數(shù)[log2(fold change)，log2FC]絕對值>2為閾值，采用DESeq2包[11]篩選COVID-19患者和健康對照之間的差異表達(dá)基因(differentially expressed genes，DEGs)。

1.3 差異表達(dá)先天免疫基因篩選基于篩選出的DEGs，與InnateDB數(shù)據(jù)庫(https://www.innatedb.ca/)[12]中的人類先天免疫基因集取交集，鑒別出差異表達(dá)的先天免疫基因(differentially expressed innate immunity genes，DEIIGs)。

1.4 DEIIGs功能富集分析基于篩選出的DEIIGs，采用Metascape(http://metascape.org)[13]在線分析平臺，以P<0.01，富集因子>1.5，最小匹配count值>3為閾值，進(jìn)行GO[14]和KEGG[15]功能富集分析。

1.5 外周血免疫細(xì)胞豐度估計(jì)采用ImmuCellAI(http://bioinfo.life.hust.edu.cn/web/ImmuCellAI/)[16]平臺預(yù)測24種免疫細(xì)胞豐度，包括CD4+T細(xì)胞，CD8+T細(xì)胞，幼稚CD4+T細(xì)胞，幼稚CD8+T細(xì)胞，中樞記憶性T細(xì)胞(central memory T cells，Tcm)，效應(yīng)T細(xì)胞(effector memory T cells，Tem)，Ⅰ型調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(type 1 regulatory T cells，Tr1)，誘導(dǎo)性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(inducible regulatory T cells，iTreg)，天然調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(natural regulatory T cells，nTreg)，輔助性T細(xì)胞1(T helper 1 cells，Th1)，輔助性T細(xì)胞2(T helper 2 cells，Th2)，輔助性T細(xì)胞17(T helper 2 cells，Th17)，濾泡輔助性T細(xì)胞(T follicular helper cells，Tfh)，細(xì)胞毒性T細(xì)胞(cytotoxic T cells，Tc)，黏膜相關(guān)恒定T細(xì)胞(mucosal-associated invariant T cells，MAIT)，耗竭性T細(xì)胞(exhausted T cells，Tex)，gamma delta T細(xì)胞(gamma delta T cells，γδT)和天然殺傷T細(xì)胞(natural killer T cells，NKT)共18個T細(xì)胞亞型，以及B細(xì)胞、NK細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞6種重要免疫細(xì)胞。

1.6 統(tǒng)計(jì)處理及可視化采用R軟件(4.0.2)進(jìn)行基因重注釋、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和可視化。組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)或H檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用校正后的Spearman相關(guān)，采用ggplot2包繪制火山圖，corrplot包和pheatmap包進(jìn)行相關(guān)性分析可視化。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料COVID-19患者與健康對照年齡、種族差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，性別差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 COVID-19患者與健康對照一般資料比較

2.2 基因重注釋和DEGs表達(dá)共重新注釋到55 586條基因，差異分析篩選出88個DEGs，包括 49個上調(diào)基因和39個下調(diào)基因。見圖1。

A為DEGs火山圖(Down為下調(diào)基因，Up為上調(diào)基因，Ns為無表達(dá)差異基因)；B為DEGs相對豐度熱圖。圖1 COVID-19患者DEGs及其相對豐度

2.3 DEIIGs及其表達(dá)將人類先天免疫基因數(shù)據(jù)集的1 378個先天免疫基因與88個DEGs取交集，共鑒定出7個DEIIGs，包括UCHL1，IFI27，PPARG，CCL2，IGF1，BIRC5和IGHG1，其表達(dá)量在COVID-19患者中均上調(diào)。見圖2A。

2.4 DEIIGs功能富集GO分析富集于STAT受體信號通路、淋巴細(xì)胞活化的正向調(diào)控和細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號通路；KEGG分析富集于癌癥代謝途徑。見表2、圖2B。

表2 COVID-19患者DEIIGs GO、KEGG功能富集分析

A為7個DEIIGs表達(dá)；B為7個DEIIGs GO、KEGG功能分析。圖2 DEIIGs及其功能分析

2.5 24種外周血免疫細(xì)胞豐度改變COVID-19患者外周血幼稚CD4+T、Th1和Tcm細(xì)胞豐度降低，而Tr1和nTreg細(xì)胞豐度升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其余免疫細(xì)胞差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖3。

注：*P<0.05；**P<0.01；ns為差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。圖3 COVID-19患者外周血24種免疫細(xì)胞豐度改變

2.6 免疫細(xì)胞豐度改變與DEIIGs的關(guān)系外周血幼稚CD4+T細(xì)胞豐度與PPARG、IGHG1表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，Tr1豐度與IGHG1表達(dá)呈正相關(guān)，nTreg豐度與BIRC5表達(dá)呈正相關(guān)，Th1與IFI27表達(dá)呈正相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖4。

注：*P<0.05；**P<0.01。圖4 DEIIGs與免疫細(xì)胞的相關(guān)性

3 討論

先天免疫在SARS-CoV-2感染中至關(guān)重要，干擾素作為先天免疫防御中抵抗病毒感染的重要細(xì)胞因子，主要經(jīng)由Jak/STAT信號通路，誘導(dǎo)干擾素刺激基因的轉(zhuǎn)錄和抗病毒蛋白的表達(dá)，限制SARS-CoV-2復(fù)制并發(fā)揮抗病毒功能[17-18]。但與此同時，SARS-CoV-2也進(jìn)化出多種機(jī)制逃避先天免疫感知，例如逃避PRRs感應(yīng)和抑制干擾素信號傳遞，引發(fā)先天免疫反應(yīng)不足或延遲，使得病毒在感染早期大量復(fù)制，導(dǎo)致過度激活的促炎反應(yīng)并損傷組織器官[19-20]。SARS-CoV-2主要通過血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2受體進(jìn)入靶細(xì)胞，由于其對先天免疫的逃避機(jī)制，機(jī)體通常無法短時間內(nèi)清除病毒，而先天免疫細(xì)胞則進(jìn)一步通過上調(diào)組織相容性復(fù)合體MHC Ⅱ 和免疫檢查點(diǎn)分子表達(dá)來增強(qiáng)處理和呈遞抗原的能力，形成抗原呈遞細(xì)胞并激活適應(yīng)性免疫程序，以此促進(jìn)組織炎癥、損傷修復(fù)和免疫消退[21-22]。

先天免疫和適應(yīng)性免疫細(xì)胞均起源于骨髓的多能造血干細(xì)胞，有共同的生理發(fā)育基礎(chǔ)，且在功能上相輔相成、互相促進(jìn)，共同構(gòu)成了機(jī)體牢固的免疫防御體系[23]。因此，我們假設(shè)SARS-CoV-2感染導(dǎo)致的先天免疫基因改變可能與免疫細(xì)胞豐度相關(guān)。本研究通過生物信息學(xué)分析，鑒別出COVID-19患者7個DEIIGs，基因功能主要富集于STAT受體信號通路、淋巴細(xì)胞活化的正向調(diào)控和細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號通路3個生物學(xué)過程；同時，對免疫細(xì)胞豐度的估計(jì)結(jié)果顯示，COVID-19患者外周血幼稚CD4+T細(xì)胞、Th1和Tcm豐度降低，而Tr1和nTreg豐度升高，一方面反映了外周免疫細(xì)胞的耗竭，另一方面也反映出了強(qiáng)烈的免疫抑制。這些結(jié)果與已報道的COVID-19患者干擾素水平下降、淋巴細(xì)胞減少以及促炎因子分泌增多的臨床參數(shù)改變相關(guān)[19,24-27]，且與Huang等[28]的研究發(fā)現(xiàn)有一致性。而KEGG功能富集到了癌癥信號通路，其中IFI27是COVID-19與癌癥中被鑒別到的共性DEG[28-29]，表明SARS-CoV-2感染造成的免疫改變可能與癌癥引起的免疫反應(yīng)有一致性。此外，Liang等[30]研究結(jié)果也顯示，相較于非癌癥患者，癌癥患者感染COVID-19的風(fēng)險更高，且預(yù)后更差，暗示了COVID-19與癌癥的內(nèi)部聯(lián)系，而這種關(guān)聯(lián)可能來源于免疫改變。

研究表明，PPARG與抑制促炎反應(yīng)有關(guān)[31]，而IGHG1的高表達(dá)能夠促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[32]。此外，BIRC5和IFI27也被發(fā)現(xiàn)在多種癌癥中高表達(dá)，能夠抑制凋亡并促進(jìn)細(xì)胞增殖[33-34]，且與病毒感染有關(guān)[35-36]。本研究發(fā)現(xiàn)，PPARG、IGHG1表達(dá)與COVID-19患者外周血幼稚CD4+T細(xì)胞豐度呈負(fù)相關(guān)，可能參與了對幼稚CD4+T細(xì)胞的負(fù)向調(diào)控，抑制了幼稚CD4+T細(xì)胞的分化與增殖；而IGHG1、BIRC5和IFI27表達(dá)分別與Tr1、nTreg和Th1豐度呈正相關(guān)，可能與基因的正向調(diào)控有關(guān)，COVID-19引發(fā)的免疫紊亂導(dǎo)致了促炎與抗炎效應(yīng)分子的“風(fēng)暴”狀態(tài)。然而，具體的分子調(diào)控機(jī)制和因果關(guān)系仍有待進(jìn)一步探索和驗(yàn)證。

綜上所述，本研究鑒別出了COVID-19患者中差異表達(dá)的7個先天免疫基因，探究了其參與的主要生物學(xué)過程和代謝途徑，并揭示了先天免疫基因改變與免疫細(xì)胞豐度的關(guān)系，為進(jìn)一步研究SARS-CoV-2感染引發(fā)的免疫分子機(jī)制提供生物信息學(xué)證據(jù)和實(shí)驗(yàn)方向。