郗延如，劉元新，馮娜，谷禎，孫俊紅，曹潔，靳茜茜，杜秋香

山西醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，山西 太原 030001

損傷時(shí)間推斷一直是法醫(yī)學(xué)工作中的重點(diǎn)和難點(diǎn)。目前研究已證實(shí)，多種mRNA 在損傷修復(fù)中呈時(shí)序性變化，可出現(xiàn)表達(dá)增強(qiáng)、表達(dá)降低或表達(dá)沉默的模式，不同mRNA表達(dá)的時(shí)間順序和峰值也不相同[1-2]。機(jī)體死后，由于受到尸體保存溫度、細(xì)胞內(nèi)核酸酶活性變化等因素影響，部分mRNA 的降解與死亡時(shí)間（postmortem interval，PMI）呈一定規(guī)律性，機(jī)體死后保存溫度的升高也會(huì)加速mRNA 降解[3-6]。由此，利用mRNA 的表達(dá)推斷損傷時(shí)間可能會(huì)受到死亡時(shí)間及尸體保存溫度的影響。

本研究從高通量測(cè)序獲得的差異基因中篩選出與炎癥相關(guān)的非轉(zhuǎn)移性黑色素瘤糖蛋白B（glycoprotein non-metastatic melanoma protein B，Gpnmb），有研究[7-8]結(jié)果表明，該基因參與組織損傷后的炎癥反應(yīng)和纖維化與損傷修復(fù)過程密切聯(lián)系，在機(jī)體損傷后其表達(dá)升高。本研究擬采用實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）技術(shù)檢測(cè)不同損傷時(shí)間、死亡時(shí)間及死后保存溫度下大鼠骨骼肌中GpnmbmRNA 的表達(dá)量，探究GpnmbmRNA 表達(dá)與損傷時(shí)間、死亡時(shí)間及死后保存溫度的相關(guān)性，建立mRNA 表達(dá)與損傷時(shí)間的線性回歸模型，并在此基礎(chǔ)上研究GpnmbmRNA 在損傷時(shí)間推斷中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

TRIzol Reagent 購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司，Prime-ScriptTMRT Master Mix（Perfect Real Time）和Premix Ex TaqTM（Probe qPCR）購(gòu)自日本TaKaRa 公司。

2-16PK 型臺(tái)式冷凍離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Sigma 公司，Infinite?200 PRO Nano Quant 檢測(cè)儀購(gòu)自瑞士TECAN 公司，CFX384 TouchTM熒光定量PCR 檢測(cè)系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)BIO-RAD 公司。

1.2 大鼠骨骼肌挫傷模型的建立和檢材提取

由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供健康雄性成年SD 大鼠共147 只，6～8 周齡，體質(zhì)量為200～230 g，其中126 只為實(shí)驗(yàn)組，21 只為驗(yàn)證組。將實(shí)驗(yàn)組大鼠隨機(jī)分為損傷后0 h、4 h、8 h、12 h、16 h、20 h 和24 h組，每組18 只，使用3%戊巴比妥鈉溶液腹腔注射（0.13 mL/100 g）麻醉大鼠，去除其右后肢股四頭肌處毛發(fā)，將500 g 重力錘從高30 cm 處自由落體砸于大鼠右后肢股四頭肌處[9]。將大鼠按設(shè)置的時(shí)間點(diǎn)頸椎脫臼處死，在0 ℃、16 ℃、26 ℃ 3 個(gè)溫度下各保存6 只，于死后0 h、12 h、24 h 重復(fù)收集肌肉樣本（死后0 h 僅取材于其中一個(gè)溫度組）。每次取大鼠右后肢股四頭肌損傷處肌肉組織100 mg 置于液氮中，-80 ℃保存。驗(yàn)證組大鼠分組與處理方式同上，每個(gè)損傷組3 只大鼠，死后分別保存在0 ℃、16 ℃、26 ℃下并連續(xù)取材。

本研究已通過山西醫(yī)科大學(xué)的倫理審查（審批文號(hào)：2019LL095）。

1.3 總RNA 提取與RT-qPCR 檢測(cè)

使用TRIzol Reagent 提取總RNA，并使用Infinite?200 PRO Nano Quant 檢測(cè)儀測(cè)量總RNA 純度及濃度，D260/D280在1.8～2.0 可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將400 ng 總RNA 用PrimeScriptTMRT Master Mix（Perfect Real Time）反轉(zhuǎn)錄為cDNA。

按照Premix Ex TaqTM（Probe qPCR）試劑盒操作說明書配制反應(yīng)混合液，使用CFX384 TouchTM熒光定量PCR 檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行qPCR。反應(yīng)條件：95 ℃30 s，95 ℃ 5 s，62 ℃ 40 s，40 個(gè)循環(huán)。反應(yīng)體系為25 μL，包括：TaqDNA 聚合酶12.5 μL，目的基因和內(nèi)參基因的上下游引物及探針（各0.5 μL）共3 組，去離子水4 μL，cDNA 4 μL。5 倍濃度梯度稀釋cDNA，將其作為模板進(jìn)行qPCR，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)量?jī)?nèi)參基因Rpl13、Rpl32及目的基因Gpnmb的擴(kuò)增效率，擴(kuò)增效率在90%～110%范圍內(nèi)、相關(guān)系數(shù)在0.980 以上，可認(rèn)為體系穩(wěn)定、擴(kuò)增良好，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。各組取4 μL cDNA 樣本分別加入反應(yīng)體系，對(duì)內(nèi)參基因和目的基因進(jìn)行復(fù)合擴(kuò)增，利用2-ΔΔCt法[2]得到GpnmbmRNA 的相對(duì)表達(dá)量。內(nèi)參基因Rpl13、Rpl32[10]及目的基因Gpnmb的序列均來自GenBank（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/），利用Allele ID 6.0 軟件（北京天演融智軟件有限公司）進(jìn)行引物及探針設(shè)計(jì)，經(jīng)BLAST檢索確認(rèn)其特異性，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物及探針序列詳見表1。

表1 引物及探針序列Tab.1 Sequences of primers and probes

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 Gpnmb mRNA 的提取及表達(dá)

所有樣本均成功提取RNA，總RNA 的D260/D280值在1.8～2.0。5 倍濃度梯度稀釋cDNA 原液進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品制備，測(cè)得目的基因（Gpnmb）和內(nèi)參基因（Rpl13、Rpl32）的擴(kuò)增效率分別為107.4%、104.9%、104.2%，相關(guān)系數(shù)分別為0.996、0.996、0.999，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

單因素方差分析結(jié)果顯示：死亡時(shí)間組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；死后保存溫度組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；損傷時(shí)間組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），經(jīng)LSD 檢驗(yàn)，各損傷組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。如表2 所示，大鼠死后分別保存在0 ℃、16 ℃、26 ℃中0 h、12 h、24 h，GpnmbmRNA 在骨骼肌損傷后主要呈持續(xù)上調(diào)的表達(dá)模式。

表2 不同死亡時(shí)間、死后保存溫度下Gpnmb mRNA 隨損傷時(shí)間的表達(dá)Tab.2 The expression of Gpnmb mRNA varied with the injury time at different time of death and postmortem storage temperature （n=6，）

表2 不同死亡時(shí)間、死后保存溫度下Gpnmb mRNA 隨損傷時(shí)間的表達(dá)Tab.2 The expression of Gpnmb mRNA varied with the injury time at different time of death and postmortem storage temperature （n=6，）

注：各損傷組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.2 相關(guān)性及線性回歸模型的建立

損傷時(shí)間與GpnmbmRNA 相對(duì)表達(dá)量的Pearson相關(guān)系數(shù)為0.837，兩變量間呈高度正相關(guān)（P＜0.05）。死亡時(shí)間、死后保存溫度與GpnmbmRNA 相對(duì)表達(dá)量的Pearson 相關(guān)系數(shù)分別為0.055（P＞0.05）、0.008（P＞0.05），差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可認(rèn)為死亡時(shí)間、死后保存溫度兩變量與GpnmbmRNA 相對(duì)表達(dá)量基本不相關(guān)，可在模型中排除。

剔除死亡時(shí)間和死后保存溫度這兩個(gè)影響因素后，建立損傷時(shí)間（y）與GpnmbmRNA 相對(duì)表達(dá)量（x）的回歸模型為y=0.611x+4.489。該回歸模型經(jīng)方差檢驗(yàn)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（R2=0.701，F(xiàn)=685.774，P＜0.05）。

2.3 回代檢驗(yàn)

將驗(yàn)證組數(shù)據(jù)代入擬合的回歸方程，損傷時(shí)間預(yù)測(cè)值的均值與實(shí)際值最小相差0.63 h，最大相差4.82 h（圖1）。配對(duì)樣本t檢驗(yàn)結(jié)果顯示，損傷時(shí)間預(yù)測(cè)值和實(shí)際值之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），證明建立的回歸模型具有較好的預(yù)測(cè)能力，可用于損傷時(shí)間推斷。

圖1 回代檢驗(yàn)結(jié)果Fig.1 Results of back-substitution test

3 討論

機(jī)體損傷后局部的組織病理學(xué)、RNA 含量、蛋白水平、炎癥細(xì)胞等改變對(duì)推斷損傷時(shí)間均具有重要價(jià)值[11-12]。目前研究發(fā)現(xiàn)，多種mRNA 在機(jī)體損傷后呈時(shí)序性變化[2，13-14]，也有研究已證實(shí)機(jī)體死后多種mRNA 在生物酶作用下降解速率不同，且尸體所處環(huán)境溫度對(duì)降解速率影響很大[3，5，15-17]。由此可知，應(yīng)用mRNA 推斷生前損傷時(shí)間可能受到死亡時(shí)間和死后保存溫度影響。

研究[7-8，18-19]發(fā)現(xiàn)，Gpnmb基因在成骨細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等多種細(xì)胞中高度表達(dá)，是炎癥的負(fù)調(diào)節(jié)因子，對(duì)損傷有保護(hù)作用。正常情況下，Gpnmb基因在機(jī)體內(nèi)處于低水平表達(dá)；機(jī)體損傷后，Gpnmb的表達(dá)隨著骨髓源性巨噬細(xì)胞的極化和溶酶體應(yīng)激而增高，并通過IL-4/STAT6 通路促進(jìn)M2 型巨噬細(xì)胞的極化，發(fā)揮抑制免疫細(xì)胞活化、清除病原體、釋放抗感染物質(zhì)、維持纖維化和纖溶平衡的作用[7-8，20]。因此，Gpnmb基因的表達(dá)與組織損傷修復(fù)過程聯(lián)系緊密。由于Gpnmb表達(dá)在人類基因組及其他物種間具有同質(zhì)性，研究該指標(biāo)在動(dòng)物模型中的表達(dá)規(guī)律及作用能夠?yàn)槿梭w損傷時(shí)間推斷提供參考[21]。

本研究應(yīng)用RT-qPCR 技術(shù)探討大鼠骨骼肌GpnmbmRNA 表達(dá)隨損傷時(shí)間、死亡時(shí)間和死后保存溫度的變化規(guī)律，通過Pearson 相關(guān)系數(shù)評(píng)價(jià)死亡時(shí)間、死后保存溫度和損傷時(shí)間對(duì)GpnmbmRNA 表達(dá)的影響。結(jié)果表明，GpnmbmRNA 表達(dá)與死亡時(shí)間和死后保存溫度不相關(guān)。因此，利用GpnmbmRNA推斷損傷時(shí)間受到死亡時(shí)間或尸體保存溫度等死后因素的影響較小或基本無影響。在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，GpnmbmRNA 在骨骼肌損傷后呈持續(xù)上調(diào)的表達(dá)模式，與損傷時(shí)間呈線性關(guān)系，建立的回歸模型為y=0.611x+4.489，方差齊。通過回代檢驗(yàn)可知，外部驗(yàn)證預(yù)測(cè)值與實(shí)際值最小相差0.63 h，最大相差4.82 h，模型預(yù)測(cè)較準(zhǔn)確。因此，從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，GpnmbmRNA 表達(dá)量與損傷時(shí)間有很強(qiáng)的正相關(guān)性，即隨著損傷時(shí)間的延長(zhǎng)，GpnmbmRNA 的表達(dá)也隨之增高，并且在死后24 h 內(nèi)可以保持較高的穩(wěn)定性，降解速率也幾乎不受溫度變化的影響。

已有研究證實(shí)，CAPN5、VEGFA、HAF等多種mRNA 的表達(dá)隨死亡時(shí)間呈規(guī)律性變化[17，22]；當(dāng)溫度升高時(shí)，CDC25B、ACTB、GAPDH等mRNA 的穩(wěn)定性降低，且隨著死亡時(shí)間的延長(zhǎng)明顯降解[23-24]。但也有研究[23]報(bào)道，在不同溫度影響下，Rpl27、Copb1、Rbfox1等mRNA 在死后24 h 內(nèi)基本無變化，但這些研究均未考慮大鼠不同損傷時(shí)間對(duì)mRNA 的影響。本研究對(duì)3 種因素綜合考慮，將不同損傷時(shí)間的大鼠處死后在0 ℃、16 ℃和26 ℃ 3 個(gè)溫度下保存24 h，發(fā)現(xiàn)GpnmbmRNA 的表達(dá)幾乎不受死亡時(shí)間和死后保存溫度的影響，而僅與損傷時(shí)間相關(guān)，這一點(diǎn)極其有利于生前損傷時(shí)間推斷。該結(jié)果進(jìn)一步提示科研工作者在后期篩選用于損傷時(shí)間推斷的指標(biāo)時(shí)，應(yīng)盡量選取不受死亡時(shí)間和死后保存溫度干擾的指標(biāo)，從而簡(jiǎn)化損傷時(shí)間推斷的問題。

本研究采用線性回歸模型探索GpnmbmRNA 表達(dá)在損傷時(shí)間推斷中的應(yīng)用，但是此模型較簡(jiǎn)單，在數(shù)據(jù)信息的挖掘以及預(yù)測(cè)能力方面稍顯不足。因此，在后續(xù)的損傷時(shí)間推斷研究中，應(yīng)使用多基因聯(lián)合推斷損傷時(shí)間，采用機(jī)器學(xué)習(xí)算法等建立更為可靠的指標(biāo)評(píng)價(jià)體系，剔除其他對(duì)損傷時(shí)間推斷影響較大的指標(biāo)，篩查與損傷時(shí)間高度相關(guān)的mRNA 指標(biāo)，從而對(duì)損傷時(shí)間作出更為準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)。