何蘭娟,鄧淵,王燕,3,朱向東,3*

(1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué),蘭州 730101;2.甘肅省人民醫(yī)院,蘭州 730000;3.寧夏醫(yī)科大學(xué),銀川 750004)

潰瘍性結(jié)腸炎是一種病因尚不明確的慢性非特異性炎性腸病,且發(fā)病率逐年増長。 目前UC 的發(fā)病機(jī)制多認(rèn)為與免疫因素相關(guān)[1]。 固有免疫作為人體第一道機(jī)體防御感染性防線,它的啟動和實(shí)施主要依靠模式識別受體(pattern recognition receptors,PRRs) 識別病原體相關(guān)分子模式(pathogen associated molecular pattern,PAMP)。 而哺乳動物中的最典型的兩類PRRs 為TOLL 樣受體(Toll-like receptors,TLRs)和核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域受體( nucleotide-binding domain leucine-rich repeats,NLRs)[2]。

目前臨床多采用糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑等免疫療法,但是療效不穩(wěn)定,所以急需尋找一種新的特異性療法[3-4]。 近年來,中醫(yī)藥在治療UC 和緩解UC 癥狀等方面優(yōu)勢明顯[5]。 四神丸之名首載于《陳氏小兒痘疹方論》,臨床研究發(fā)現(xiàn)其對UC 具有良好的治療作用,本課題通過對比四神丸治療UC大鼠后結(jié)腸組織中的TLR4、NOD2 的表達(dá)變化,進(jìn)一步明確其治療UC 的機(jī)制,為進(jìn)一步開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物

6 ～ 8 月齡體重為(180 ± 20)g 的SPF 級Wistar大鼠40 只(雌雄各20 只),飼養(yǎng)于溫度21 ～ 25℃,相對濕度50% ～ 60%,光照晝夜交替各12 h 的環(huán)境中,飲水自由,普通飼料喂養(yǎng)。 實(shí)驗(yàn)用鼠購買和喂養(yǎng)均在甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心進(jìn)行【SCXK(甘)2020-0001】【SYXK(甘)2020-0009】。 本實(shí)驗(yàn)符合甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理會審查要求(2018-081)。

1.1.2 主要試劑與儀器

四神丸(補(bǔ)骨脂、肉豆蔻、五味子、吳茱萸)、柳氮磺胺嘧啶腸溶片均購自于蘭州惠仁堂大藥房,生產(chǎn) 批 號 分 別 為 20140502、 1412001、 20140812、20140822、09140703。 四神丸制備濃縮為1 g/mL 的藥液;柳氮磺胺嘧啶腸溶片研磨后制成濃度為0.025 g/mL 的藥液。 所有藥品均于4℃保存。

2,4,6-三硝基苯磺酸/TNBS(美國Sigma 公司,批號2508-19-2);PCR 試劑盒(Promega Corporation公司);PCR 引物(生工生物工程股份有限公司);Anti-TLR4 antibody、Anti-NOD2 antibody(abcam 公司,批號ab13556、ab124348);BCA 蛋白定量試劑盒(北京索萊寶科技有限公司,批號:1431401);DAB顯色試劑盒、SP 檢測試劑盒(中杉金橋生物技術(shù)有限公司,批號K156921A、15155A06)等。

iMark 酶標(biāo)儀、S1000TM型PCR 儀、凝膠成像儀、電泳儀電源、電泳槽(美國Bio-Rad 公司);7500 實(shí)時(shí)定量PCR 儀(美國ABI 公司);XS-212-202 雙目顯微鏡(日本奧林巴斯公司);冷凍離心機(jī)(中國上海天美生化儀器設(shè)備有限公司)等。

1.2 方法

1.2.1 造模及分組

將40 只SPF 級Wistar 大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、西藥組、四神丸組,每組10 只。 將大鼠喂養(yǎng)1 周后,除空白組外,用三硝基苯磺酸(TNBS)/乙醇溶液灌腸(100 mg/kg)緩慢注入結(jié)腸部位制備UC大鼠模型[6]。

1.2.2 給藥與取材

給藥劑量按照人與大鼠體表系數(shù)折算法計(jì)算[7],空白組和模型組以等體積生理鹽水灌胃,柳氮磺胺嘧啶組用SASP 溶液0.36 g/(kg·d)灌胃治療,中藥組用四神丸5 g/(kg·d)灌胃治療。 共計(jì)干預(yù)21 d。 治療結(jié)束后,取動脈血及結(jié)腸組織備用。

1.2.3 肉眼觀察大鼠結(jié)腸粘膜損傷及進(jìn)行損傷評分

將大鼠處死后取結(jié)腸病變部分,洗凈后觀察大鼠結(jié)腸粘膜損傷情況,并參考Wallace ＆ Keenan 標(biāo)準(zhǔn)[8]進(jìn)行評分(見表1)。

表1 結(jié)腸粘膜損傷評分表Table 1 Colonic mucosal injury score

1.2.4 HE 染色法觀察大鼠結(jié)腸病理組織變化

采用蘇木素-伊紅染色法染色,將結(jié)腸組織玻片放置在顯微鏡下觀察大鼠結(jié)腸病理學(xué)改變,并拍照分析。

1.2.5 RT-qPCR 法檢測大鼠結(jié)腸組織中TLR4、NOD2 mRNA 的表達(dá)

采用TRIzol 法提取RNA 后,按照Go Taq 2-Step RT-qPCR System 試劑盒說明書進(jìn)行操作,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。 運(yùn)用PCR 儀進(jìn)行擴(kuò)增,具體配置比例按照Reverse Transcription System 試劑盒說明進(jìn)行。 采用ΔCt 法計(jì)算基因的相對表達(dá)量,TLR4、NOD2 引物信息見表2。

表2 引物信息Table 2 Information of primers

1.2.6 SP 免疫組化法檢測大鼠結(jié)腸組織中TLR4、NOD2 蛋白的表達(dá)

將切片放入二甲苯及乙醇溶液中脫蠟水化,滅活內(nèi)源性過氧化物酶后進(jìn)行抗原修復(fù),滴加封閉用正常山羊血清工作液阻斷非特異性反應(yīng),加入一抗TLR4(1 ∶200),NOD2(1 ∶400),再滴加生物素標(biāo)記山羊抗兔/小鼠IgE 及滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液,最后DAB 顯色、復(fù)染、脫水透明封片分析其平均光密度值。

1.2.7 Western Blot 檢測TLR4、NOD2 蛋白的表達(dá)

蛋白提取后,電泳跑膠轉(zhuǎn)膜封閉后,加入一抗TLR4 ( 1 ∶ 500), NOD2 ( 1 ∶ 2000), β-actin(1 ∶1000),37℃孵育30 min,4℃過夜;加入二抗(1 ∶5000)。 曝光后進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié)果采用SPSS 19.0 軟件處理,數(shù)據(jù)均以平均值± 標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表達(dá),多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析,P＜ 0.05 表示組間比較具有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 大鼠結(jié)腸粘膜損傷情況

空白組大鼠結(jié)腸粘膜光滑,未見充血、潰瘍等情況;模型組大鼠結(jié)腸可見不同程度粘膜充血,部分可見水腫糜爛潰瘍,腸壁增厚;柳氮磺胺嘧啶組和中藥組大鼠結(jié)腸可有不同程度恢復(fù),輕度充血水腫,基本無糜爛及潰瘍面。 模型組結(jié)腸組織損傷評分較空白組明顯升高(P＜ 0.01),柳氮磺胺嘧啶組和四神丸組結(jié)腸組織損傷評分較模型組明顯降低(P＜ 0.05,P＜ 0.01)(見表3)。

表3 各組癥狀積分及結(jié)腸肉眼評分表(±s,n = 10)Table 3 Symptom score and macroscopic colon score of each group(±s,n = 10)

表3 各組癥狀積分及結(jié)腸肉眼評分表(±s,n = 10)Table 3 Symptom score and macroscopic colon score of each group(±s,n = 10)

注:與空白組相比,△P ＜ 0.01;與模型組相比,*P ＜ 0.01,與柳氮磺嘧啶組相比,▲P ＜ 0.05。 (下表同)Note. Compared with the blank group, △P ＜ 0.01. Compared with the model group, *P ＜ 0.01. Compared with the SASP group,▲P ＜ 0.05.(The same in the following tables)

組別 劑量(g/kg) 結(jié)腸粘膜損傷評分Groups Dose (g/kg) Colonic mucosal injury score空白組Blank group 0.00 0.30 ± 0.48模型組Model group 0.00 2.50 ± 1.08△柳氮黃嘧啶組SASP group 0.36 1.50 ± 0.85▲四神丸組Sishen pills group 5.00 1.30 ± 0.95*

2.2 大鼠結(jié)腸病理形態(tài)學(xué)觀察

空白組大鼠結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)清晰無異常;模型組結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)被破壞,可見大量炎性細(xì)胞浸潤并伴有潰瘍;柳氮磺胺嘧啶組和四神丸組結(jié)腸粘膜逐步恢復(fù)正常結(jié)構(gòu),炎性細(xì)胞浸潤情況較模型組減輕,可見腸壁增厚及肉芽組織增生(見圖1)。

2.3 對大鼠結(jié)腸組織TLR4、NOD2 mRNA 的影響

模型組大鼠結(jié)腸組織中TLR4、NOD2 mRNA 表達(dá)水平較空白組明顯上升(P＜ 0.01);柳氮磺胺嘧啶組和四神丸組結(jié)腸組織中TLR4、NOD2 mRNA 表達(dá)水平較模型組明顯降低(P＜ 0.05,P＜ 0.01)(見表4)。

表4 各組大鼠結(jié)腸組織中TLR4、NOD2 mRNA 的表達(dá)(±s,n = 10)Table 4 Expression of TLR4 and NOD2 mRNA in colon tissue of rats in each group(±s,n = 10)

表4 各組大鼠結(jié)腸組織中TLR4、NOD2 mRNA 的表達(dá)(±s,n = 10)Table 4 Expression of TLR4 and NOD2 mRNA in colon tissue of rats in each group(±s,n = 10)

組別 劑量(g/kg) Toll 樣受體4 核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域蛋白2 Groups Dose(g/kg) TLR4 NOD2空白組Blank group 0.00 1.00 ± 0.00 1.00 ± 0.00模型組Model group 0.00 1.69 ± 0.13△ 1.55 ± 0.21△柳氮黃嘧啶組SASP group 0.36 1.24 ± 0.99▲ 1.37 ± 0.80▲四神丸組Sishen pills group 5.00 1.33 ± 0.28* 1.21 ± 0.62*

2.4 對大鼠結(jié)腸組織TLR4、NOD2 蛋白定位的影響

TLR4 和NOD2 在空白組中基本不表達(dá),在模型組中的黏膜上層和固有層中表達(dá)明顯增多,經(jīng)治療后,表達(dá)明顯降低。 模型組結(jié)腸組織中TLR4、NOD2蛋白表達(dá)水平較空白組明顯升高(P＜ 0.05);氮磺胺嘧啶組和四神丸組結(jié)腸組織中TLR4、NOD2 蛋白表達(dá)水平較模型組明顯下降(P＜ 0.05,P＜ 0.01)(見圖2,表5)。

表5 各組大鼠結(jié)腸組織中TLR4、NOD2 蛋白表達(dá)(±s,n = 10)Table 5 Expression of TLR4 and NOD2 protein in colon tissue of rats in each group(±s,n = 10)

表5 各組大鼠結(jié)腸組織中TLR4、NOD2 蛋白表達(dá)(±s,n = 10)Table 5 Expression of TLR4 and NOD2 protein in colon tissue of rats in each group(±s,n = 10)

組別 劑量(g/kg) Toll 樣受體4 核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域蛋白2 Groups Dose (g/kg) TLR4 NOD2空白組Blank group 0.00 0.315 ± 0.039 0.291 ± 0.006模型組Model group 0.00 0.344 ± 0.010△ 0.411 ± 0.005△柳氮黃嘧啶組SASP group 0.36 0.324 ± 0.030▲ 0.311 ± 0.003▲四神丸組Sishen pills group 5.00 0.310 ± 0.006* 0.370 ± 0.010*

2.5 對UC 大鼠結(jié)腸組織TLR4 與NOD2 蛋白表達(dá)的影響

與空白組比較,模型組大鼠結(jié)腸組織中TLR4、NOD2 蛋白表達(dá)水平明顯上升(P＜ 0.01);氮磺胺嘧啶組和四神丸組大鼠結(jié)腸組織中TLR4、NOD2 蛋白表達(dá)水平較模型組明顯下降(P＜ 0.01)(見圖3,表6)。

表6 各組大鼠結(jié)腸組織中TLR4、NOD2 蛋白的相對表達(dá)量 (±s,n = 10)Table 6 Relative expression of TLR4 and NOD2 proteins in colon of rats in each group(±s,n = 10)

表6 各組大鼠結(jié)腸組織中TLR4、NOD2 蛋白的相對表達(dá)量 (±s,n = 10)Table 6 Relative expression of TLR4 and NOD2 proteins in colon of rats in each group(±s,n = 10)

組別 劑量(g/kg) Toll 樣受體4 核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域蛋白2 Groups Dose(g/kg) TLR4 NOD2空白組Blank group 0.00 0.459 ± 0.079 0.643 ± 0.237模型組Model group 0.00 0.920 ± 0.032△ 1.045 ± 0.186△柳氮黃嘧啶組SASP group 0.36 0.808 ± 0.077▲0.859 ± 0.107▲四神丸組Sishen pills group 5.00 0.751 ± 0.049* 0.825 ± 0.029*

3 討論

UC 屬于中醫(yī)學(xué)中“泄瀉”的范疇,若先天稟賦不足,則會導(dǎo)致腎陰陽之虧虛,繼而導(dǎo)致脾失濡養(yǎng),脾腎虧虛最終運(yùn)化無能導(dǎo)致泄瀉,所以UC 的發(fā)病多與脾腎密切相關(guān),而脾腎陽虛又進(jìn)一步助長了濕氣的產(chǎn)生,因此“陽虛濕盛”為UC 發(fā)生的重要病機(jī)。四神丸由肉豆蔻、五味子、補(bǔ)骨脂、吳茱萸、生姜、大棗組成,適用于由脾腎虛寒所致的腸失固攝之證。諸藥相配,則脾腎溫則運(yùn)化復(fù),大腸固而泄可止。

TLR4 作為人類首個(gè)發(fā)現(xiàn)的TLR 相關(guān)蛋白,廣泛存在于人體的各類細(xì)胞中,是參與免疫炎癥反應(yīng)的重要因子[9],TLR 與內(nèi)源性配體結(jié)合后觸發(fā)炎癥,產(chǎn)生免疫應(yīng)答。 NF-κB 是位于TLR4 的下游信號通路,大量的研究顯示TLR4/NF-κB 信號通路與抗炎免疫機(jī)制密切相關(guān),在炎癥發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用[10]。 近年來,相關(guān)研究在腸粘膜上皮細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)TLR4 的存在,并證明其在減輕腸道損傷方面具有重要意義[11]。

NOD2 作為一種細(xì)胞內(nèi)模式識別受體,通過與其配體MDP 相結(jié)合,主要存在于單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等[12]。 正常情況下,NOD2 通過NF-κB信號通路激活其下游的各種炎癥介質(zhì),從而介導(dǎo)機(jī)體的炎癥反應(yīng)[13]。 有研究顯示NOD2 在識別和殺滅細(xì)菌功能方面有密切的聯(lián)系,提示NOD2 可能還有直接殺菌的作用[14]。 另外,有研究顯示,NOD2基因突變可以導(dǎo)致腸道屏障受損,使得腸道殺菌能力降低, 引起致病菌侵入并導(dǎo)致相關(guān)炎癥反應(yīng)[15-16]。

因此,Toll 樣受體和NOD 樣受體作為啟動固有免疫,激活免疫應(yīng)答的重要因子,在免疫反應(yīng)中有著至關(guān)重要的作用。 本研究結(jié)果顯示,模型組中TLR4 和NOD2 含量明顯增高,經(jīng)四神丸治療后,TLR4 和NOD2 含量明顯降低,提示四神丸可以提高大鼠的免疫功能,抑制炎癥反應(yīng),修復(fù)大鼠腸道屏障,達(dá)到治療UC 的目的。

參 考 文 獻(xiàn)(References)

[ 1] Liu ZJ, Yadav PK, Su JL, et al. Potential role of TH17 cells in the pathogenesis of inflammatory bowel disease [J]. World J Gastroenterol, 2009, 15(46): 5784-5788.

[ 2] 饒振華, 謝小梅. NODs 蛋白及其與TLRs 相互調(diào)控在機(jī)體抗病原真菌感染中的作用 [J]. 中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志,2012, 32(3): 281-285.Rao ZH, Xie XM. The role of NODs proteins and their interaction with TLRs in the body’s resistance to fungal infection[J]. Chin J Microbiol Immunol, 2012, 32(3): 281-285.

[ 3] 冉志華, 童錦祿. 炎癥性腸病診斷與治療的共識意見(2018年, 北京)克羅恩病部分解讀 [J]. 中華消化雜志, 2018, 38(5): 315-317.Ran ZH, Tong JL. Interpretation of the consensus on diagnosis and management of inflammatory bowel disease(Beijing, 2018)from the perspective of diagnosis of Crohn’s disease [J]. Chin J Dig, 2018, 38(5): 315-317.

[ 4] Guo BJ, Bian ZX, Qiu HC, et al. Biological and clinical implications of herbal medicine and natural products for the treatment of inflammatory bowel disease [J]. Ann N Y Acad Sci, 2017, 1401(1): 37-48.

[ 5] 顧思臻, 薛艷, 張玉麗, 等. 口服中藥復(fù)方治療潰瘍性結(jié)腸炎臨床療效Meta 分析 [J]. 中國中西醫(yī)結(jié)合消化雜志,2018, 26(12): 981-986.Gu SZ, Xue Y, Zhang YL, et al. Meta-analysis of the efficacy of oral traditional chinese medicine in the treatment of ulcerative colitis [J]. Chin J Integr Tradit West Med Dig, 2018, 26(12):981-986.

[ 6] 梁勇, 顏麗萍, 蘇林, 等. 枯草桿菌二聯(lián)活菌對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠的作用及機(jī)制 [J]. 中國老年學(xué)雜志, 2017, 37(1):27-29.Liang Y, Yan LP, Su L, et al. Effect and mechanism ofBacillus subtilison rats with ulcerative colitis [J]. Chin J Gerontol,2017, 37(1): 27-29.

[ 7] 賴慧敏, 黃敏聰, 樓招歡, 等.天臺烏藥對TNBS 誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎模型大鼠的抗炎作用研究 [J]. 中國比較醫(yī)學(xué)雜志, 2021, 31(2): 37-44.Lai HM, Huang MC, Lou ZH, et al. The effect of Tiantai Radix Linderae on a rat model of ulcerative colitis induced by TNBS[J]. Chin J Comp Med, 2021, 31(2): 37-44.

[ 8] Wallace JL, Keenan CM. An orally active inhibitor of leukotriene synthesis accelerates healing in a rat model of colitis [J]. Am J Physiol, 1990, 258(4): G527-G534.

[ 9] 郭曉強(qiáng). Toll 受體的發(fā)現(xiàn)及其意義 [J]. 生物學(xué)教學(xué), 2012,37(3): 59-60.Guo XQ. Discovery of toll like receptor and its significance [J].Biol Teach, 2012, 37(3): 59-60.

[10] 王娜, 張雪梅, 陳立杰. TLR4 信號通路與炎癥相關(guān)性疾病[J]. 中國實(shí)驗(yàn)診斷學(xué), 2015, 19(5): 857-860.Wang N, Zhang XM, Chen LJ. TLR4 signaling pathway and inflammation related diseases [J]. Chin J Lab Diagn, 2015, 19(5): 857-860.

[11] 于志堅(jiān). 潰瘍性結(jié)腸炎菌群變化對腸上皮細(xì)胞TLRs 表達(dá)影響 [D]. 烏魯木齊: 新疆醫(yī)科大學(xué); 2016.Yu ZJ. Effect of bacterial flora of ulcerative colitis on the expression of TLRs in intestinal epithelial cells [D]. Urumqi:Xinjiang Medical University; 2016.

[12] 高其宏, 芮景. 細(xì)胞內(nèi)模式識別受體NOD2 蛋白的研究進(jìn)展[J]. 放射免疫學(xué)雜志, 2008, 21(5): 432-434.Gao QH, Rui J. Research progress of intracellular pattern recognition receptor NOD2 protein [J]. J Radioimmunol, 2008,21(5): 432-434.

[13] Inohara N, Ogura Y, Chen FF, et al. Human nod1 confers responsiveness to bacterial lipopoly-saccharides [J]. Biol Chem,2001, 276(4): 2551-2554.

[14] Hismatsu T, Suzuki M, Reinecker HC, et al. CARD15/NOD2 functions as an antibacterial factor in human intestinal epithelial cells [J]. Gastroenterology, 2003, 124(4): 993-1000.

[15] Kim YG, Shaw MH, Warner N, et al. Cutting edge: Crohn’s disease-associatedNod2mutationlimitsproductionof proinflammatory cytokines to protect the host fromEnterococcus faecalis-induced lethality [J]. J Immunol, 2011, 187(6): 2849-2852.

[16] Ferreira CM, Vieira AT, Vinolo MAR, et al. The central role of the gut microbiota in chronic inflammatory diseases [J]. J Immunol Res, 2014, 2014: 1-12.