曹家全，王景燕，高海明，王 波，吳佳奇

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院，四川 瀘州 646000)

軟骨損傷(cartilage damage)是創(chuàng)傷骨科十分常見的疾病。由于其再生能力差的生理特性，以及缺乏神經(jīng)支配，當(dāng)軟骨表面受損后疼痛感不明顯，使得患者未能得到及時(shí)的診斷和有效的治療，導(dǎo)致?lián)p傷進(jìn)行性加重，繼而會(huì)出現(xiàn)關(guān)節(jié)變形甚至功能障礙等一系列并發(fā)癥。但軟骨組織工程技術(shù)的出現(xiàn)為修復(fù)軟骨和軟骨缺損帶來新突破[1]。組織工程(tissue engineering)是近年來正在興起的一門新的學(xué)科，屬于生物高技術(shù)范疇。此概念最早是在1987年美國科學(xué)基金會(huì)在華盛頓舉辦的生物工程小組會(huì)上提出，1988年正式被命名定義。組織工程技術(shù)的研究應(yīng)具備以下三個(gè)主要條件：(1)足夠數(shù)量且具備多向分化潛能的種子細(xì)胞；(2)合適的生物支架載體；(3)調(diào)節(jié)種子細(xì)胞增殖并維持其表型等特征的生長因子。

1 種子細(xì)胞

種子細(xì)胞是組織工程學(xué)中的第一個(gè)核心要素，也是組織工程學(xué)發(fā)展的瓶頸[2]。種子細(xì)胞可以分為非干細(xì)胞和干細(xì)胞兩大類[3]。前者主要包括：成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、軟骨細(xì)胞。后者主要包括：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)、脂肪干細(xì)胞(adipose stem cells，ADSCs)、神經(jīng)干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞等。在上述種子細(xì)胞中，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的研究最為成熟，已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于基礎(chǔ)研究[4]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞最早由Friedenstein等[5]在骨髓中發(fā)現(xiàn)。大量研究顯示[6]，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞被認(rèn)為是多功能干細(xì)胞，可以誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞、肝臟細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞，甚至心肌細(xì)胞。由于具有多向分化，自我更新，免疫調(diào)節(jié)和其他作用的潛力，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞已成為基因治療，組織工程，細(xì)胞替代治療和再生醫(yī)學(xué)的種子細(xì)胞重要來源[7]。由于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的提取、分離及純化過程較為復(fù)雜，存在細(xì)胞被感染、老化、數(shù)量不足等缺點(diǎn)，因此來源受到一定的限制。脂肪干細(xì)胞存在于脂肪組織中,是具有多向分化潛能的成體干細(xì)胞[8]；在一定條件下，也有向骨、軟骨、內(nèi)皮細(xì)胞及脂肪細(xì)胞等多向分化潛能，且具有取材容易、來源廣泛、供應(yīng)量充足、供區(qū)創(chuàng)傷小、免疫調(diào)節(jié)能力強(qiáng)等一系列骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞沒有的優(yōu)勢[9]。因此，脂肪干細(xì)胞也可以作為骨組織工程理想的種子細(xì)胞來源。但其成骨能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)不如骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，在骨組織工程中不作為種子細(xì)胞首選[10]。

通常情況下，軟骨細(xì)胞被當(dāng)做軟骨組織修復(fù)的最佳種子細(xì)胞選擇，但實(shí)際上，軟骨細(xì)胞的來源和取材均有限，取材后容易造成供區(qū)功能障礙；此外，細(xì)胞分離過程較為復(fù)雜，可能造成不可逆地?fù)p傷，在體外進(jìn)行培養(yǎng)增殖過程中容易喪失軟骨細(xì)胞特有的表型[11-12]。

2 合適支架

選擇合適的材料是軟骨組織重建的關(guān)鍵。目前常用的軟骨組織工程支架材料主要有天然高分子材料(比如藻酸鹽、殼聚糖、膠原、明膠、纖維蛋白膠、天然脫細(xì)胞基質(zhì)材料等)和人工合成材料(比如聚乳酸(polylactic acid，PLA)、聚羥基乙酸(polyglycolic acid，PGA)、聚乳酸-羥基乙酸共聚物 (polylactic acid-glycolic acid copolymer，PLGA)、聚己酸內(nèi)酯(polycaprolactone，PCL)等)[13]。然而，作為修復(fù)軟骨缺損的金標(biāo)準(zhǔn)，自體移植物具有更好的成骨性，有較好的骨誘導(dǎo)性和骨傳導(dǎo)性[14]。盡管，同種異體移植物和異體移植物具有一定的成骨能力，但具有包括降解速度慢、材料穩(wěn)定性差、免疫排斥等缺點(diǎn)[15]。當(dāng)前，經(jīng)過特殊處理的自體或同種異體骨具有較好的生物強(qiáng)度和機(jī)械強(qiáng)度(例如生物相容性和生物降解性)，能降低供體部位發(fā)病率或病原體傳播風(fēng)險(xiǎn)，是一種天然、綠色和安全的材料[16-17]。因此，同種異體骨支架成為軟骨組織工程較理想的選擇，也成為當(dāng)前研究員的研究熱點(diǎn)。

理想的骨組織工程支架應(yīng)緊密模仿天然的骨骼環(huán)境。支架材料的選擇是組織工程技術(shù)最核心問題，它不僅作為細(xì)胞的載體，而且對(duì)細(xì)胞的黏附、增殖、分化和表型的維持具有十分重要作用[18]。用于骨組織工程的理想支架應(yīng)滿足以下要求[19-20]：(1) 具有良好的界面親和力，有利于種子細(xì)胞黏附、生長及分化；(2)具有穩(wěn)定且足夠的三維空間結(jié)構(gòu)，有利于組織生長、物質(zhì)移植和血管形成；(3)具有一定的生物力學(xué)特性和良好的生物可降解性，在缺損部位能夠提供一定的力學(xué)強(qiáng)度，維持重建組織的形態(tài)，且易于降解；(4)具有良好的生物相容性，不引發(fā)炎癥反應(yīng)以及較低的免疫原性，能夠較好的和受體相結(jié)合，確保修復(fù)組織的連續(xù)性和穩(wěn)定性；(5)應(yīng)具有調(diào)節(jié)生物活性因子的釋放；(6)支架應(yīng)易于制備成各種想要的形狀和尺寸。由于組織來源的支架和天然組織的結(jié)構(gòu)和組成十分相似。因此，組織來源的支架在生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中具有廣闊的前景。然而，自體組織衍生的支架也具有許多移植的缺點(diǎn)，因?yàn)槭斋@自體移植物限于可用的供體部位并且需要二次手術(shù)，因此對(duì)身體也會(huì)造成額外的損害[21]。

3 生長因子

生長因子已經(jīng)被證實(shí)在組織工程技術(shù)中有十分重要的作用，尤其是在軟骨修復(fù)方面得到了大量的驗(yàn)證。生長因子是指具有調(diào)控細(xì)胞生長、發(fā)育的一類生物活性物質(zhì)，它們通過自分泌或旁分泌方式調(diào)節(jié)各種細(xì)胞的增殖和分化[22]。目前，骨組織工程中常用的生長因子包括：轉(zhuǎn)化生長因子 (transforming growth factor, TGF)、成纖維細(xì)胞生長因子(fibroblast growth factor，F(xiàn)GF)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic proteins，BMPs)、富血小板血漿(platelet rich Plasma，PRP)、富血小板纖維蛋白(platelet rich fibrin，PRF)等，大量研究表明[23]生長因子不僅可以促進(jìn)細(xì)胞的生長、增殖及分化，而且多種生長因子協(xié)同作用可以有效地誘導(dǎo)干細(xì)胞向軟骨分化并維持軟骨細(xì)胞表型。

轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)是一種多肽類生長因子，可根據(jù)其組織結(jié)構(gòu)的不同分為TGF-α和TGF-β兩種類型。它們能有效地促進(jìn)細(xì)胞的生長、增殖及分化，是干細(xì)胞向軟骨分化的關(guān)鍵因子。在軟骨組織工程中TGF-β1和TGF-β3的應(yīng)用較為廣泛，但其中TGF-β1可顯著增加軟骨相關(guān)的基因表達(dá)。Worster等[24]對(duì)BMSCs體外培養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中加入TGF-β1可以誘導(dǎo)BMSCs定向分化為軟骨細(xì)胞，其II型膠原(COLⅡ)的表達(dá)與 TGF-β1的劑量呈正相關(guān)，5～10 ng/mL的TGF-β1，可有效地促進(jìn)BMSCs向軟骨方向的分化。而TGF-β3主要對(duì)BMSCs向軟骨分化起調(diào)節(jié)作用，其參與了軟骨分化中的細(xì)胞聚集、增殖和分化階段；鄭東等[25]通過特定方式從大鼠胚胎組織中獲取TGF-β3的基因片段并轉(zhuǎn)染至大鼠來源的ADSCs中相應(yīng)的DNA片段(重組質(zhì)粒)中，將轉(zhuǎn)染后的ADSCs在特定的環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng),分別于第7、14、21天進(jìn)行免疫組化染色，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組的COLⅡ、Aggrecan、TIMP的表達(dá)明顯增加，表明了TGF-β3有促進(jìn)ADSCs向軟骨細(xì)胞分化和軟骨基質(zhì)的能力。艾力麥爾旦·艾尼瓦爾等人[26]在一系列體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，濃度在10～100 μg/L范圍內(nèi)的TGF-β3可有效促進(jìn)兔成骨細(xì)胞的增殖和成骨能力,其中TGF-β3的質(zhì)量濃度為10 μg/L時(shí)，Ⅰ型膠原蛋白、Runx-2、骨鈣素基因的表達(dá)最明顯。

成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)由垂體和下丘腦分泌的多肽。包括堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)和酸性成纖維細(xì)胞生長因子(aFGF)兩種，能促進(jìn)成纖維細(xì)胞有絲分裂、中胚層細(xì)胞的生長，還可刺激血管形成，在創(chuàng)傷愈合及骨軟骨缺損修復(fù)和再生中發(fā)揮重要作用。目前，F(xiàn)GF在現(xiàn)代臨床醫(yī)學(xué)、外科手術(shù)及醫(yī)學(xué)美容中發(fā)揮著不可估量的巨大作用[27]。此外，bFGF也常用于軟骨組織工程，其中FGF2和FGF18與關(guān)節(jié)軟骨的穩(wěn)態(tài)維持密切相關(guān)[28]。戶小偉等[29]研究發(fā)現(xiàn)，bFGF能促進(jìn)BMSCs向成骨細(xì)胞分化，并呈時(shí)間依賴性；其最佳作用濃度為50 ng/mL。bFCF可刺激成纖維母細(xì)胞的生成，是目前發(fā)現(xiàn)的最有效的血管生長因子之一，能促進(jìn)骨、軟骨、神經(jīng)和軟組織修復(fù)[30]?？杉ぐl(fā)促進(jìn)BMSCs向脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞分化的潛能，具有體內(nèi)、外誘導(dǎo)成骨和成血管作用，因此可以促進(jìn)骨修復(fù)。周琦琪等[31]研究發(fā)現(xiàn)，bFGF能明顯增加BMSCs的增殖速度。雖然，多個(gè)實(shí)驗(yàn)研究表明[32]，bFCF有明顯促進(jìn)BMSCs向軟骨分化的潛能，但過程十分復(fù)雜，仍然是臨床上一個(gè)難點(diǎn)，具體機(jī)制及臨床效果仍需進(jìn)一步研究，以闡明體內(nèi)和體外軟骨再生的最佳策略。

骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs)是在1963年由美國的Marshall R.Urist教授發(fā)現(xiàn)的一種分泌性的多功能蛋白，對(duì)于骨和軟骨組織的生長具有重要作用。目前為止，已被發(fā)現(xiàn)的骨形態(tài)發(fā)生蛋白至少有20種，其中骨形態(tài)發(fā)生蛋2,4,6,7和9研究最為廣泛[33]。在一定條件能夠誘導(dǎo)形成軟骨、肌腱、韌帶等組織結(jié)構(gòu)，甚至能參與相應(yīng)神經(jīng)及內(nèi)臟組織的修復(fù)工程[34]。在骨科領(lǐng)域中，骨形態(tài)發(fā)生蛋白的臨床應(yīng)用主要在治療新鮮骨折、骨缺損、骨不連、脊柱融合及股骨頭缺血性壞死等5個(gè)方面[35]。阮世強(qiáng)等[36]通過BMP2基因過表達(dá)的方式刺激脂肪干細(xì)胞，同時(shí)結(jié)合Mosaicplasty技術(shù)可顯著促進(jìn)軟骨缺損修復(fù)，即轉(zhuǎn)染BMP2對(duì)骨軟骨的缺損有更佳的臨床修復(fù)效果。Kemiss等[37]運(yùn)用BMP6成功地誘導(dǎo)小鼠脂肪干細(xì)胞分化成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞，表明BMP6有促進(jìn)脂肪干細(xì)胞向成骨和成軟骨分化的潛能。其中，BMP9作為骨形態(tài)發(fā)生蛋白家族的關(guān)鍵分子,具有極強(qiáng)的促進(jìn)干細(xì)胞分化與骨組織再生的能力[38]。BMP9主要通過BMP9-SMAD信號(hào)通路和BMP9-MAPK信號(hào)通路來實(shí)現(xiàn)對(duì)干細(xì)胞分化的調(diào)控作用[39]。BMPs具有較高的安全性和有效性，在骨與軟骨工程中具有較高的臨床價(jià)值，也是當(dāng)今骨科研究的熱點(diǎn)之一，其過程較為復(fù)雜，有待進(jìn)一步更加深入研究。

近年來，富血小板血漿(PRP)和富血小板纖維蛋白(PRF)也廣泛應(yīng)用在軟骨組織工程方面，其含有大量的生長因子，如血小板衍生生長因子(PDGF)，轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)，類胰島素生長因子(IGF)，表皮生長因子(EGF)，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)等，可有效的促進(jìn)骨折愈合、軟骨細(xì)胞增殖及軟骨細(xì)胞外基質(zhì)合成[40-41]。

4 結(jié)論

綜上所述，組織工程應(yīng)具備三個(gè)基本要素：較強(qiáng)增殖能力和多向分化潛能的種子細(xì)胞，生物相容性良好的細(xì)胞支架及促進(jìn)細(xì)胞增殖分化的細(xì)胞因子，其中種子細(xì)胞和生物支架是最為重要的因素，是構(gòu)建組織工程生物替代物獲得成功的前提條件。然而在臨床工作中，不易找到合適的替代物，導(dǎo)致骨軟骨組織工程技術(shù)的發(fā)展緩慢，且患者的治療效果很難達(dá)到滿意的效果。隨著材料科學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)的發(fā)展和創(chuàng)新，骨組織工程技術(shù)為軟骨、軟骨下骨損傷的再生和修復(fù)帶來了新的希望。本文總結(jié)近幾年來國內(nèi)外骨組織工程技術(shù)的研究進(jìn)展，為軟骨及軟骨下骨的重建和修復(fù)的基礎(chǔ)研究及臨床應(yīng)用提供可靠的依據(jù)。