張法楠， 劉傳志， 李柏志， 李鴻睿， 侯 玥

(1. 長春理工大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院， 長春 130022； 2. 吉林大學(xué) 藥學(xué)院， 長春 130021)

過氧化氫(H2O2)是需氧生物中常見的天然代謝產(chǎn)物[1], 該化合物一直被認為是氧化代謝的有害副產(chǎn)物[2]. 近年來， H2O2和相關(guān)活性氧(reactive oxygen species， ROS)參與動、 植物生理功能的研究受到人們廣泛關(guān)注[1]. H2O2還在許多(病理)生理條件下產(chǎn)生自由基ROS， 并參與體內(nèi)氧化還原過程的調(diào)節(jié)[3]. 目前， H2O2的研究涉及許多生物過程的前沿， 如細胞增殖和分化、 組織修復(fù)、 炎癥、 晝夜節(jié)律的中心氧化還原信號傳導(dǎo)分子和老化[4]等.

對H2O2代謝和信號傳導(dǎo)的觀察， 要求具有高靈敏的可靠測量[5]， 但目前測定H2O2的方法均非常耗時[6-7]. 比色試劑盒法用辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)催化H2O2， 以3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺(3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine， TMB)為底物改變吸光度值定量H2O2[8]. 雖然HRP具有高度的特異性， 但檢測的靈敏度仍不能滿足需要.

畢赤酵母是一種廣泛使用的重組蛋白生產(chǎn)宿主， 畢赤酵母前期以甘油為碳源， 當(dāng)畢赤酵母生長達到預(yù)定指標(biāo)時， 可將甘油耗盡， 便進入以甲酵作為唯一碳源的蛋白表達階段. 因此， 實驗中及時掌握甘油耗盡點， 可為添加甲醇進行蛋白表達提供準確信息[9-12]. 目前的甘油檢測方法是將甘油-3-磷酸氧化酶(glycerol 3-phosphate oxidase, GPO)等物質(zhì)的量氧化成甘油-3-磷酸和H2O2， 再利用HRP將 H2O2分解成H2O和O-， 導(dǎo)致色原氧化變色， 通過顏色變化計算H2O2濃度.

表面增強Raman光譜(surface-enhanced Raman scattering， SERS)廣泛應(yīng)用于超靈敏的生物測定平臺, 如測量微生物、 特異性抗體、 適體、 肽和核酸等[13-20]. Li等[21]研究了SERS基于Au 納米粒子及靶向肽的修飾探針， 該探針創(chuàng)建了一個金-硒界面， 與線粒體中H2O2反應(yīng)并定位, 該探針在生物條件下對豐富的硫醇表現(xiàn)出良好的耐受性， 并且在活細胞中監(jiān)測線粒體 H2O2的性能優(yōu)越， 實現(xiàn)線粒體 H2O2的原位定量， 并獲得其真實的氧化應(yīng)激下時間動態(tài)變化； Jiang等[22]研究了一種基于沸石咪唑酯骨架-8(ZIF-8) 的SERS傳感器， 通過將ZIF-8與活性金納米粒子(AuNPs)結(jié)合作為響應(yīng)探針， 檢測活細胞釋放的H2O2， 由于SERS優(yōu)越的指紋識別和ZIF對H2O2的高效富集和選擇性響應(yīng)， 該方法對H2O2檢測表現(xiàn)出較高的抗干擾能力， 檢測限低至0.357 nmol/L， 由于AuNPs和ZIF的成功整合提高了催化活性， 響應(yīng)時間可縮短至1 min， 證明了SERS傳感器在快速檢測H2O2方面的有效性； Cheng等[23]構(gòu)建了一種新型硼酸(BA)納米探針對H2O2含量進行定量表征， 其中將金納米棒修飾的對硫醇苯硼酸(4-MPBA)報告分子(AuNRs)用于Raman信號增強. 結(jié)果表明， 合成的AuNRs/4-MPBA/BA 納米探針在H2O2含量的測量靈敏度方面具有明顯優(yōu)勢, 對應(yīng)的線性范圍和檢出限為分別為0.5～2×103μmol/L和0.15 μmol/L, 回收率和相對標(biāo)準偏差分別約為96%和6%.

TMB底物氧化可產(chǎn)生具有強烈SERS活性的產(chǎn)物TMB2+. HRP催化H2O2的反應(yīng)中， 可將SERS惰性的發(fā)色反應(yīng)物TMB氧化成SERS活性產(chǎn)物TMB2+. TMB2+的SERS信號隨H2O2濃度增加在一定范圍內(nèi)呈線性增加[24]. 本文利用納米金(AuNP)可增強Raman信號的特征[25]， 通過將納米金粒子(AuNP， 60 nm)水溶液引入樣品中， 使用SERS方法定量檢測不同濃度的H2O2， 根據(jù)文獻[24]確定在1 338,1 605 cm-1處的Raman峰是TMB2+的SERS特征峰. 采用SERS基于HRP催化H2O2氧化TMB的反應(yīng)及AuNP的Raman增強信號作用， 實現(xiàn)H2O2的微量定量分析. 根據(jù)酵母發(fā)酵中甘油可等物質(zhì)的量氧化成甘油酸和H2O2的原理， 通過檢測H2O2濃度對酵母培養(yǎng)液中甘油濃度的微量變化進行了定量分析， 并與商品試劑進行比較. 結(jié)果表明， 甘油檢出限LOD=2.75 μmol/L, 酵母培養(yǎng)液中甘油消耗的速度與酵母增值呈正相關(guān). 微量的甘油分析可及時掌握甘油耗盡點， 提高了檢測即時甘油的靈敏度和效率， 為蛋白誘導(dǎo)表達提供準確信息.

1 實 驗

1.1 儀器與試劑

IX71型Raman顯微鏡(RM， 日本OLYMPUS公司)； ONLAB-EU2000型分光光度計(上海昂拉儀器有限公司)； ISO Planesct 320型激光發(fā)生器和冷卻電荷耦合器(-70 ℃， 瑞典Cobolt公司， 功率30 mW)； Tecnai G2 Spirt Biotwin型透射電子顯微鏡(美國FEI公司)； bioflo 310型發(fā)酵罐(7.5 L, 美國NBS公司). 3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB, 上海滬試化工公司)； 辣根過氧化物酶(HRP, 日本TOYOBO公司)； 納米金(AuNP， 60 nm, 蘇州桓球科技公司)； 畢赤酵母(吉林大學(xué)藥學(xué)院現(xiàn)代生物學(xué)教研室)； 甘油檢測試劑盒(愛爾蘭Megazyme公司)； 甘油-3-磷酸氧化酶(GPO， 美國Sigma公司)； TMB儲存液(湖州英創(chuàng)生物科技有限公司);φ=30%的H2O2、 檸檬酸和磷酸氫二鈉(上海滬試化工公司)； 0.5 mol/L H2SO4和10 mmol/L磷酸鹽緩沖液(廈門英科新創(chuàng)科技有限公司); 其他試劑均為國產(chǎn)分析純試劑.

上罐種子培養(yǎng)液組成： YPD培養(yǎng)基， 每升培養(yǎng)液中含φ=0.5%的甘油，φ=2%的胰化蛋白胨，φ=1%的酵母提取物. 上罐發(fā)酵培養(yǎng)液組成：φ=85%的H3PO46.67 mL, CaSO4·2H2O 0.23 g, K2SO44.55 g, MgSO4·7H2O 3.72 g, KOH 1.03 g, 甘油 10 g, 加入雙蒸餾水至1 L， 高壓滅菌. 實驗用水均為雙蒸餾水.

1.2 H2O2檢測方法建立及應(yīng)用

1.2.1 H2O2標(biāo)準液制備

委托吉林省正恒檢測有限公司， 先將φ=30% H2O2用高錳酸鉀標(biāo)定， 再稀釋成濃度為88，44，22，11，5.5，2.75，1.37 μmol/L的溶液， 2～8 ℃儲存?zhèn)溆?

1.2.2 TMB顯色液配制

取25 mmol/L TMB儲存液0.125 mL， 0.1 mol/L檸檬酸2.5 mL， 0.2 mol/L磷酸氫二鈉2.5 mL， 雙蒸水5 mL， 混合， 于2～8 ℃避光儲存?zhèn)溆?

1.2.3 過氧化物酶(HRP)試劑配制

用pH=7.4的10 mmol/L磷酸鹽緩沖液將HRP配制成100 U/L的溶液(其中U定義為每分鐘轉(zhuǎn)化1 μmol底物需要的酶量)， 于2～8 ℃保存?zhèn)溆?

1.2.4 H2O2的ELISA檢測法

分別取88，44，22，11，5.5，2.75，1.37 μmol/L H2O2各200 μL， 然后加入TMB顯色液50 μL， 100 U/L HRP 20 μL， 于37 ℃反應(yīng)20 min， 各孔加入0.5 mol/L H2SO450 μL. 用分光光度計于400～600 nm分別掃描測量各濃度H2O2的吸光度(Abs)值.

1.2.5 H2O2的SERS檢測方法建立

分別取88，44，22，11，5.5，2.75，1.37 μmol/L H2O2各200 μL， 然后加入TMB顯色液50 μL， 100 U/L的HRP 20 μL， 于37 ℃反應(yīng)20 min， 各孔加入0.5 mol/L H2SO450 μL和AuNP(60 nm)50 μL.

在H2O2測量過程中， 分別對H2O2+TMB+HRP， H2O2+TMB+HRP+H2SO4和H2O2+TMB+HRP+H2SO4+AuNP在波長1 300～1 800 cm-1內(nèi)進行SERS掃描. 同時采用透射電子顯微鏡對AuNP的均一程度進行觀察.

檢測在反射模式下進行， 使用633 nm激發(fā)激光(激光功率為5%)， 1 800線/mm光柵和冷卻的電荷耦合器件(-70 ℃). 10倍物鏡發(fā)出激光束并收集反向散射光， 以5 s的積分時間進行測量. 在每個SERS區(qū)域的10個位置進行測量， 并對數(shù)據(jù)取平均值. 使用WiRE 3.2(雷尼紹軟件)進行背景校正和曲線擬合. 在進行曲線擬合前， 先通過六階多項式擬合將光譜減去背景.

將濃度為88，44，22，11，5.5，2.75，1.37 μmol/L 的H2O2標(biāo)準液分別加入TMB，HRP，H2SO4和AuNP中， 在波長1 300～1 800 cm-1內(nèi)進行SERS掃描檢測， 每個樣品分別檢測10次， 數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 19.0統(tǒng)計軟件分析. 根據(jù)實驗數(shù)據(jù)計算SERS檢測方法的重復(fù)性(CV)； 根據(jù)不同濃度H2O2的Raman信號強度確定該方法的檢測限(LOD)及線性范圍； 將2.75，5.5 μmol/L的H2O2進行加標(biāo)， 使其理論背景值分別達到5.5，11.0 μmol/L， 進行加標(biāo)回收率(%)實驗.

1.2.6 發(fā)酵液中甘油的SERS定量分析

實驗采用SERS檢測方法對不同發(fā)酵時間發(fā)酵液中甘油濃度的變化進行定量分析. 采用7.5 L發(fā)酵罐, 酵母上罐前進行滅菌， 冷卻至30 ℃時在上罐發(fā)酵培養(yǎng)液中按5%的體積分數(shù)投入菌液， 轉(zhuǎn)速600 r/min， 通氣量10 L/min， 調(diào)節(jié)pH=5.5, 培養(yǎng)12 h. 分別在0，6，12 h取樣檢測甘油濃度, 觀察氧溶(dissolved oxygen， DO)值和OD600值變化. SERS檢測樣品中GPO和 HRP分別為1.0，10 U/mg.

1.2.7 發(fā)酵液中SERS分析H2O2的干擾實驗

酵母發(fā)酵培養(yǎng)液由5.67 g H3PO4, 0.23 g CaSO4·2H2O, 4.55 g K2SO4, 3.72 g MgSO4·7H2O, 1.03 g KOH和10 g甘油組成. 預(yù)先將培養(yǎng)液制備成原液、 體積比為1∶1和1∶2的溶液， 采用SERS檢測方法對3種不同濃度培養(yǎng)液中的H2O2進行平行3次檢測. 觀察在培養(yǎng)液中各物質(zhì)變化對H2O2檢測的影響.

2 結(jié)果與討論

2.1 H2O2的比色檢測(ELISA法)

在H2O2存在的情況下, HRP可將無色的底物分子TMB氧化成藍色氧化物TMB2+(圖1(A)). 加入強無機酸(如H2SO4)可終止反應(yīng)， 產(chǎn)生黃色的TMB2+(圖1(B))， 可見低pH值條件有利于形成雙電子產(chǎn)物. 通過分光光度計對電荷轉(zhuǎn)移復(fù)合物和TMB2+進行定量可得到一種方便的檢測方法. 圖2為TMB2+的氧化產(chǎn)物在不同濃度H2O2中的顯色效果. 圖3為不同濃度H2O2檢測的線性關(guān)系. 由圖3可見， 隨著H2O2濃度的降低， 450 nm處的吸光度降低， 檢出限LOD=5.5 μmol/L.

圖1 TMB氧化反應(yīng)原理(A)和TMB氧化后的顏色變化(B)

圖2 不同濃度H2O2顯色的可見光譜分析

圖3 不同濃度H2O2檢測的線性關(guān)系

2.2 H2O2的SERS光譜分析

SERS檢測中常采用金或銀納米顆粒作為Raman信號增強子. 金屬納米顆?？蓪?dǎo)致平均光散射增強104～106倍[25-26]. 這種增強的電磁場由納米粒子表面電子激發(fā)所致， 被稱為局部表面等離振子共振(LSPR). LSPR是由納米粒子的電子響應(yīng)于入射光的振蕩導(dǎo)致電子波共振狀態(tài). LSPR在LSPR峰值的波長處產(chǎn)生強烈的納米粒子吸收和散射， 可提高SERS測定的靈敏度[27-28].

AuNP和納米銀(AgNP)均具有較強的Raman信號增強作用. 由于氧化還原反應(yīng)易導(dǎo)致AgNP氧化， 其穩(wěn)定性較差， 因此本文選擇AuNP作為Raman信號增強子. 由于不同AuNP尺寸的增強作用、 粒子的均勻程度間存在差異， 經(jīng)實驗對比后， 采用蘇州桓球科技公司生產(chǎn)的60 nm AuNP作為Raman信號增強子， 電鏡照片如圖4所示.

圖4 60 nm AgNP電鏡照片

分別將AuNP，H2O2+TMB+HRP，H2O2+TMB+HRP+H2SO4和H2O2+TMB+HRP+H2SO4+AuNP進行分組檢測， 在波長1 300～1 800 cm-1內(nèi)進行SERS掃描， 結(jié)果如圖5所示. 各組中只有H2O2+TMB+HRP+H2SO4+AuNP組在1 605 cm-1具有Raman強度信號改變， 顯示其特異性峰值.

圖5 過氧化物酶催化H2O2至TMB氧化反應(yīng)的SERS光譜

2.3 H2O2的SERS定量分析

分別向濃度為88，44，22，11，5.5，2.75,1.37 μmol/L 的H2O2標(biāo)準液中加入TMB，HRP，H2SO4和AuNP， 在波長1 300～1 800 cm-1內(nèi)進行SERS掃描檢測， 每個樣品分別檢測10次， 取平均值， 結(jié)果如圖6所示. 由圖6可見， 隨著H2O2濃度的降低， 1 605 cm-1處的Raman強度逐漸降低. 因為H2O2濃度為1.37 μmol/L時Raman信號重復(fù)檢測中具有較大差異， 所以將檢出限確定為LOD=2.75 μmol/L. 當(dāng)H2O2濃度為2.75～22 μmol/L時， 其與Raman信號強度的自然對數(shù)具有線性關(guān)系，R2=0.995， 檢測的線性曲線如圖7所示.

圖6 不同濃度H2O2的SERS定量分析

圖7 不同濃度的H2O2與Raman強度自然對數(shù)的線性關(guān)系

SERS定量分析H2O2數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 19.0統(tǒng)計軟件分析， 其平均CV=5.38%， 平均回收率=96.05%， 結(jié)果列于表1. 實驗表明， SERS方法比ELISA方法檢測H2O2濃度的LOD值降低一倍， 且靈敏度更高[29-31].

表1 SERS定量分析H2O2濃度的精密度(n=10)

2.4 發(fā)酵液中甘油的SERS 定量分析

實驗利用酵母發(fā)酵液中甘油在GPO和HRP的作用下等物質(zhì)的量氧化成甘油酸和H2O2的原理， 通過檢測H2O2濃度， 對酵母培養(yǎng)液中甘油濃度的微量變化進行定量分析. 實驗采用SERS檢測H2O2的方法對0，6，12 h培養(yǎng)液中的甘油濃度進行測量， 同時對比培養(yǎng)期間的DO和OD600值. 結(jié)果如圖8所示. 由圖8可見： 隨著培養(yǎng)時間的增加， 酵母持續(xù)繁殖， 甘油逐漸耗盡， OD600值增高； DO值在對數(shù)生長期下降明顯， 至對數(shù)生長期末期出現(xiàn)最低值， 而在發(fā)酵后期， 由于菌體衰老， 呼吸強度減弱， 因此DO值逐漸上升， 符合酵母培養(yǎng)的生長規(guī)律. 表明SERS檢測甘油的方法可在酵母培養(yǎng)過程中快速、 準確監(jiān)測培養(yǎng)液中甘油的消耗情況.

圖8 不同發(fā)酵時間發(fā)酵液中甘油濃度的SERS定量分析(A)， DO值(B)和OD600值(C)變化

2.5 發(fā)酵液中SERS法檢測H2O2的干擾實驗

因酵母的生長需求， 通常酵母培養(yǎng)液中會含有多種無機鹽和甘油. 實驗通過在不同濃度培養(yǎng)液中添加5.5，11.0 μmol/L H2O2， 觀察培養(yǎng)液成分變化對甘油檢測的干擾程度， 結(jié)果列于表2. 由表2可見， 不同濃度培養(yǎng)液中的各種無機鹽和甘油濃度變化對檢測無明顯干擾作用.

表2 不同濃度培養(yǎng)液中H2O2的SERS檢測結(jié)果(n=3)

綜上所述， 本文設(shè)計了一種H2O2定量分析方法. 通過利用過氧化物酶活性， 在H2O2存在下催化底物TMB的反應(yīng)， 生成最終產(chǎn)物TMB2+， 在Raman增強分子AuNP的共同作用下， 獲得較敏感的SERS信號， 實現(xiàn)了H2O2定量分析. 實驗觀察到TMB2+的SERS檢測信號的自然對數(shù)， 在H2O2濃度為2.75～22 μmol/L內(nèi)呈線性增加， 檢出限LOD=2.75 μmol/L，R2=0.995， 平均CV=5.38%， 平均回收率為96.05%. 通過對發(fā)酵液中甘油的SERS定量分析， 表明該方法具有較高的靈敏度、 精密度和準確性， 在較短時間內(nèi)實現(xiàn)了對H2O2的定量分析.