王娜 宋霞

對于非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）患者來說，近些年來，除了手術、放化療傳統(tǒng)療法以外，以程序性死亡受體1（programmed cell death 1, PD-1）/程序性死亡配體1（programmed cell death ligand 1, PD-L1）免疫抑制劑為代表的免疫檢查點抑制劑（immune checkpoint inhibitors, ICIs）已經成為治療惡性腫瘤的一種最具前景的治療方案[1,2]。尤其對于大多數(shù)NSCLC患者來說，在確診時已有局部晚期疾病或遠處轉移，晚期患者的5年生存率不足20%，而免疫抑制劑的興起給NSCLC免疫療法的實現(xiàn)帶來新的臨床獲益，同時也帶來了嚴峻的挑戰(zhàn)[2-4]。作為一種新型的惡性腫瘤治療方法，在一定程度上彌補了傳統(tǒng)治療方式的不足，是充滿前景的惡性腫瘤治療手段。然而，只有一小部分患者獲得了長期的臨床益處[5]。研究[1]表明，外泌體PD-L1（exosomal PD-L1, exoPD-L1）正在成為一種非侵入性和容易獲得的生物標志物，相比較組織細胞膜PD-L1來說，有著明顯的優(yōu)勢。研究[4]發(fā)現(xiàn)exoPD-L1在免疫抑制和腫瘤進展中起著關鍵作用，可用于癌癥檢測的新生物標志物和肺癌的分子治療靶點以及患者的個體化治療，對肺癌的免疫治療具有重要意義。本文綜述了近幾年國內外有關exoPD-L1對NSCLC免疫治療反應的研究進展，并進行了小結。

1 外泌體的發(fā)生

不論是原核生物還是真核生物，幾乎所有細胞都會釋放細胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs）。根據(jù)其生物發(fā)生、細胞來源和生物學特性可分為三個亞類：微囊泡、凋亡體和外泌體[6]。外泌體是起源于核內體，由組織細胞分泌的直徑40 nm-160 nm脂質雙膜層結構的細胞外囊泡[6,7]。1981年，Trams[8]發(fā)現(xiàn)了外泌體，他在綿羊網(wǎng)織紅細胞體外培養(yǎng)上清液中發(fā)現(xiàn)了被雙層膜包圍的小囊泡。1987年，約翰斯通將這些細胞外小泡命名為Exosomes[9]。它始于細胞膜的內吞作用，內吞后形成早期內體（early-sorting endosome, ESE），成熟后形成晚期分選內體（late-sorting endosomes, ISE）。隨著內體的成熟，囊泡向內萌發(fā)，并在腔內釋放，在ISE中形成含有腔內囊泡的細胞內多囊泡體，這些晚期內小體也稱為多囊泡小體（multivesicular bodies, MVBs）[10,11]。大多數(shù)MVBs與溶酶體融合，進行內容物的降解和循環(huán)利用，少數(shù)MVBs的膜含有CD63、溶酶體膜蛋白LAMP1、LAMP2，可以與質膜融合，通過胞吐作用釋放到胞外，稱為外泌體。多泡體形成于質膜的連續(xù)內陷，因此可以與其他細胞內囊泡和細胞器相交，從而導致外泌體成分的多樣性，包括DNA、RNA、脂質、代謝物以及細胞溶質和細胞表面蛋白[6,11-13]。在腫瘤學領域，研究已經確定了膜PD-1/PD-L1作為多種癌癥類型的免疫治療有效性和腫瘤耐藥的生物標志物的潛在價值[13]。近年來，隨著蛋白質組學技術的普及，外泌體中蛋白質的組成和功能已被揭示，其在預測腫瘤發(fā)生、診斷和發(fā)展中的作用受到廣泛關注。有證據(jù)[14]表明，腫瘤細胞可以分泌表面攜帶PD-L1的外泌體，通過其載體（包括蛋白質、脂質和核酸）調節(jié)腫瘤微環(huán)境并促進癌癥進展，是近幾年腫瘤免疫治療的新熱點。

2 PD-L1

PD-L1又稱分化簇274CD274或B7同源體B7-h1，是由CD274基因編碼的一種I型跨膜蛋白[15]。它屬于B7配體家族，蛋白質結構也類似于該家族的其他成員，由約290個氨基酸組成，具有兩個免疫球蛋白樣胞外域，包括免疫球蛋白V樣和C樣胞外域，具有四個特定的N-糖基化、三個磷酸化位點、一個胞內結構域上的棕櫚?；稽cC272和一個泛素化位點K178[15]。1992年，東京大學的Tasuku Honjo和他的同事們[16]發(fā)現(xiàn)了PD-1是T細胞上表達的一種與細胞凋亡有關的膜蛋白，并提出PD-1產物可能有其自身的配體。其他幾項后續(xù)研究試圖揭示PD-1的分子相互作用模式，但直到1999年，一種類似的B7同系物，現(xiàn)在被稱為PD-L1，在體外被觀察到是人類T細胞反應的抑制物[17]。后來，有研究[15,18]發(fā)現(xiàn)PD-L1不僅在T細胞上，還廣泛表達在多種細胞上，主要在腫瘤細胞、巨噬細胞、單核細胞、自然殺傷（natural killer, NK）細胞、樹突狀細胞（dendritic cell, DC），也在大腦、角膜和視網(wǎng)膜等免疫特需部位表達。在正常生理條件下，PD-1/PD-L1信號通路的激活與維持免疫耐受、促進T細胞免疫穩(wěn)態(tài)、防止免疫介導的組織損傷密切相關[19]。在疾病狀態(tài)下，PD-L1與其受體PD-1相互作用，傳遞負信號，抑制T細胞介導的一系列細胞免疫反應，包括啟動、生長、增殖和凋亡以及功能成熟等過程[20,21]。研究[22]發(fā)現(xiàn)，在人類血液中，PD-L1存在三種主要形式，一種形式為表達在質膜PD-L1上，另一種為表達在分泌的細胞外泌體表面，或者作為循環(huán)的可溶性PD-L1（soluble PD-L1, sPD-L1）。

從生理上講，PD-1/PD-L1途徑的出現(xiàn)是因為需要控制表達抗原部位的炎癥程度，以保護正常組織免受損傷。幾乎所有活化的T細胞表面均顯著表達PD-1蛋白[23]。當T細胞識別靶細胞上主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex, MHC）抗原時，就會產生炎性細胞因子來啟動炎癥這一過程。某些細胞因子導致組織細胞表達PD-L1，抑制T細胞的激活從而導致免疫耐受，即使在可起作用的抗原存在的情況下，仍使免疫系統(tǒng)失去對啟動炎癥反應的控制[24]。在某些腫瘤中，最明顯的是在黑色素瘤中，這種保護機制通過PD-L1的過度表達而被破壞；結果發(fā)現(xiàn)，它繞過了對腫瘤的免疫反應的產生。PD-1/PD-L1抑制劑在藥理上阻止PD-1/PD-L1的相互作用，從而促進積極的免疫反應以殺死腫瘤。在腫瘤細胞和免疫細胞中PD-L1分子均有表達。據(jù)報道，與腎細胞癌和黑色素瘤相比，NSCLC中PD-L1的表達水平顯著升高[22]。一般來說，腫瘤細胞上顯著的PD-L1表達和高水平的活化T細胞與較高的應答率相關。腫瘤細胞中PD-L1的表達與患者對ICIs的反應有良好的相關性。此前的研究[25,26]證實，PD-L1的高表達水平與PD-1/PD-L1抑制劑治療后的無進展生存期（progression-free survival, PFS）和總生存期（overall survival, OS）呈正相關。

腫瘤細胞PD-L1在臨床上被認為是免疫治療反應的預測因子。PD-L1也是作為目前指南推薦等級量最高的肺癌免疫相關的生物標志物，是臨床應用最廣泛的預測性標志物。盡管腫瘤組織PD-L1是美國食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration, FDA）授權的指示劑，但僅憑腫瘤細胞表面PD-L1的表達模式不足以準確預測腫瘤對抗PD-1/PD-L1治療的反應。使用膜PD-L1存在諸如創(chuàng)傷性活組織檢查、腫瘤內PD-L1表達的異質性、無法進行動態(tài)觀察以及靈敏度有限等缺陷，它有其局限性，因此PD-1/PD-L1表達并非是抗PD-1/PD-L1治療療效的最佳預測標志物[27]。研究[27,28]表明，循環(huán)中的exoPD-L1正在成為一種非侵入性和容易獲得的生物標志物，并且是比組織和血漿中的sPD-L1更容易檢測和更可靠的代替性指標。

3 exoPD-L1在腫瘤微環(huán)境中的作用

在腫瘤微環(huán)境中，PD-1及其配體PD-L1通過誘導細胞凋亡和介導免疫逃逸在腫瘤進展和生存中發(fā)揮重要作用[28]。通常認為PD-L1在瘤床內與腫瘤浸潤性淋巴細胞（tumor-infiltrating lymphocyte, TIL）表面的PD-1相互作用。然而，PD-L1也存在于EVs表面，作為膜結合型PD-L1的替代品，腫瘤細胞產生的exoPD-L1在抗腫瘤免疫反應中也發(fā)揮著重要的調節(jié)作用，并且其PD-L1水平與腫瘤進展有關[27]。

Peinado等[28]研究發(fā)現(xiàn)B16-F10外泌體對骨髓（bone marrow, BM）細胞的作用使Lewis肺癌的原發(fā)腫瘤生長和轉移負荷增加了10倍，強調了腫瘤外泌體對BM細胞在調節(jié)腫瘤發(fā)展和轉移中的關鍵作用。有研究[29]發(fā)現(xiàn)從腫瘤細胞上清液和癌癥患者血漿中獲得的外泌體部分中分離出腫瘤來源的外泌體（tumor-derived exosomes, TEX），然后利用Western blot證實了各種免疫抑制分子的表達，包括死亡受體配體如FasL或TRAIL、檢查點受體配體如PD-L1、抑制性細胞因子如白介素10（interleukin-10, IL-10）和轉化生長因子β1（transforming growth factor β1, TGFβ1）以及前列腺素E2和參與腺苷途徑的胞外酶CD39和CD73等。癌癥患者中幾乎所有的循環(huán)T淋巴細胞都表達PD-1[30]。因此，它們通過攜帶FasL或PD-L1的膜形式的TEX導致細胞凋亡，并且發(fā)現(xiàn)這些凋亡誘導分子在TEX中的表達水平與凋亡頻率相關。其次，腫瘤微環(huán)境中游離形式的PD-L1除了exoPD-L1還有sPD-L1，而exoPD-L1與sPD-L1相比，其形式更穩(wěn)定，不易被蛋白水解酶水解，可更強烈地誘導T細胞凋亡。

外泌體可以進入血液和淋巴系統(tǒng)并在全身傳播，可以潛在地影響遠處部位的腫瘤生長。阻止exoPD-L1的釋放不僅會抑制局部腫瘤細胞的生長，還會同時或幾個月后阻止遠處腫瘤細胞。因此，激活局部淋巴結處的T細胞可產生持久的全身性免疫反應，不再受胞外體PD-L1分泌的影響，最終結果是延長了小鼠的存活期[31,32]。Yang等[31]探討了胞外體PD-L1是否具有與細胞表面PD-L1相似的抑制T細胞活性的功能。在Raji B細胞將抗原呈遞給Jurkat T細胞的情況下，體外通過白介素2（interleukin-2, IL-2）的分泌測量PD-L1功能來反映T細胞的激活，結果是在Raji B細胞中沒有外源性表達PD-L1的情況下，IL-2分泌量很高。然而，PC3細胞外PD-L1的引入重新抑制了IL-2的分泌，表明來自PC3細胞的exoPD-L1可以替代Raji B細胞上PD-L1的外源性表達[32]，可見exoPD-L1具有可以替代細胞PD-L1抑制T細胞激活的功能[31]。

Yang等[31]通過連續(xù)離心法從人乳腺癌細胞MDAMB-231231和表達PD-L1或PD-L1基因敲除PD-L1KO的4T1小鼠乳腺腫瘤細胞培養(yǎng)上清液中分離出外泌體。為了評估exoPD-L1在腫瘤微環(huán)境和體內腫瘤進展中的作用，測量了聯(lián)合注射exo-PD-L1Flag、exo-PD-L1KO或PBS的4T1-PD-L1KO細胞的腫瘤生長，結果表明4T1-PD-L1KO細胞中缺乏PD-L1導致腫瘤實質性退化；然而，exo-PD-L1Flag顯著恢復了4T1-PD-L1KO細胞的腫瘤生長。為了進一步探索exoPD-L1是否抑制CD3/CD28觸發(fā)的T細胞激活信號通路，研究者用植物血凝素（phytohaem agglutinin, PHA）處理外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell, PBMC）來產生T細胞母細胞，以誘導PD-1的表達，結果表明外泌體PD-L1以劑量依賴的方式顯著抑制CD3/CD28誘導的T細胞ERK磷酸化和核因子κB（nuclear factor kappa B, NF-κB）的激活以及PHA誘導的IL-2的分泌。其他癌細胞系研究如結腸癌RKO和肺癌HCC827的exoPD-L1也可以參與免疫檢查點途徑來阻斷T細胞的激活。這些數(shù)據(jù)支持exo-PD-L1可抑制T細胞激活，為癌癥中一種重要的新的免疫抑制機制[31]。

PD-L1系統(tǒng)性地抑制抗腫瘤免疫反應，其基因阻斷促進引流淋巴結中的T細胞活性，從而誘導系統(tǒng)性抗腫瘤免疫和記憶[32]。遺傳學上兩個重要的外泌體生物發(fā)生基因：Rab27a和nSMNase2，在外泌體生物發(fā)生和PD-L1分泌中起著關鍵作用[32]。從基因上阻止外泌體的生物發(fā)生或敲除PD-L1基因可以強烈促進T細胞的激活、增殖和殺傷能力來逆轉表型，而隨著外源exoPD-L1的引入，這種效應再次被逆轉[32]。這兩種基因各自表達的蛋白產物都代表了潛在的治療靶點，然而針對Rab27a和nSMNase2的小分子抑制劑雖然已經存在，但無法抑制癌細胞系中的外泌體釋放，還需要更多的研究針對這些目標探索更有效的小分子。

4 腫瘤細胞exoPD-L1對NSCLC免疫治療的作用

4.1 exoPD-L1作為潛在的生物標志物 外泌體積極參與癌癥的發(fā)展、轉移和耐藥，這使它們成為癌癥篩查、診斷和監(jiān)測的生物標志物[33]。近幾年，外泌體蛋白在診斷許多癌癥方面表現(xiàn)出非常高的敏感性和特異性。而exoPD-L1蛋白被人們研究較多，有研究[33]發(fā)現(xiàn)阻斷PD-1/PD-L1通路可以逆轉腫瘤微環(huán)境，誘導內源性抗腫瘤免疫反應。事實上，PD-1/PD-L1免疫療法已經在臨床試驗中顯示了對NSCLC患者的益處。

Liu等[34]開發(fā)了一種表面等離子體共振（surface plasmon resonance, SPR）生物傳感器，用于捕獲外泌體并表征用于癌癥診斷的外泌體蛋白。在收集的肺癌患者的血清樣本中觀察到exoPD-L1水平高于正常對照組，這表明exoPD-L1可能是肺癌診療的有效生物標志物。但應該指出的是，exoPD-L1作為診斷生物標志物的效用需要在大型患者隊列、具有其他肺癌組織學特征的患者（如鱗狀NSCLC、小細胞肺癌）以及疾病早期階段（如I期）的患者中進一步驗證。

Yang等[35]收集了51例晚期NSCLC患者的配對組織標本和血液標本，檢測晚期NSCLC患者ICIs治療2個月后血液中PD-L1表達的動態(tài)變化，包括PD-L1 mRNA、exoPD-L1蛋白和sPD-L1的變化。在40例晚期NSCLC患者中，PD-L1 mRNA變化倍數(shù)≥2.04的患者具有更好的PFS、OS和最佳總體療效（best of response, BOR）。此外，在一組21例晚期NSCLC患者中，發(fā)現(xiàn)exoPD-L1≥1.86的倍數(shù)變化與更好的療效和OS相關，而sPD-L1的動態(tài)變化與療效和OS無關。這表明ICIs治療早期PD-L1 mRNA和/或exoPD-L1表達升高可作為晚期NSCLC患者療效和OS的陽性生物標志物。此外，PD-L1 mRNA和exoPD-L1的組合可以篩選更好的患者，以獲得ICIs治療的潛在益處。

進一步的研究[35,36]表明，PD-L1陽性外泌體中含有的miR-21有可能成為區(qū)分NSCLC患者和健康對照人員之間差異的生物標志物。Yang等[37]用免疫芯片檢測了人血清中含EGFR或PD-L1外泌體的miR-21和甲狀腺轉錄因子-1（thyriod transcription factor-1, ヰF-1）mRNA的表達，獲得了區(qū)分正常對照人員和NSCLC患者的絕對敏感性和特異性。在A549EGFR陽性外泌體中，miR-21和ヰF-1的mRNA水平分別是BEAS-2B細胞的1.6倍和2.8倍。同時，來自A549細胞的PD-L1陽性外泌體的miR-21和TTF-1 mRNA水平分別是BEAS-2B細胞的5.3倍和5.9倍。這些結果表明，PD-L1陽性外泌體miR-21和TTF-1 mRNA具有比EGFR陽性外泌體更好的腫瘤識別性能。這提示EGFR陽性和PD-L1陽性外泌體miR-21和ヰF-1 mRNA是區(qū)分NSCLC患者和健康對照人員的有效血清生物標志物。在胞外體攜帶的各種類型的標志物中，RNA特別是microRNAs已被證明是在癌癥篩查、診斷和預后方面有前景的新生物標志物[38]。

4.2 exoPD-L1阻斷有效抑制腫瘤進展 眾所周知，PD-1/PD-L1阻斷可以激活T細胞，但對于exoPD-L1在抗PD-1/PD-L1治療有效率相對較低中的作用知之甚少。新的證據(jù)表明，TEX有助于腫瘤的發(fā)生，并調節(jié)腫瘤的生長、血管生成、免疫調節(jié)、轉移和耐藥。因此它們是新的和有效的癌癥液體活檢的生物標志物。exoPD-L1在許多腫瘤包括膠質母細胞瘤、頭頸癌、乳腺癌、肺癌等中表達[39-42]。有研究[40]發(fā)現(xiàn)癌細胞來源的外泌體表達PD-L1，并且這些外泌體可以支持肺癌的腫瘤進展，并且循環(huán)exoPD-L1在抗PD-1/PD-L1阻斷治療中發(fā)揮重要作用。

Ricklefs等[39]篩選85例初診為NSCLC的患者和27名健康體檢者為研究對象，分析exoPD-L1、sPD-L1、PD-L1免疫組化特征與臨床病理特征的相關性。結果顯示，NSCLC患者，特別是晚期患者，相比健康對照組，exoPD-L1水平更高。此外，在NSCLC患者中，exoPD-L1含量高與腫瘤大小、陽性淋巴結狀態(tài)、遠處轉移和腫瘤原發(fā)灶-淋巴結-轉移（tumor-node-metastasis, TNM）分期有關。而NSCLC患者血清sPD-L1水平與健康體檢者無明顯差異，與腫瘤大小（＞2.5 cm）外的其他臨床病理特征均無相關性（P＞0.05）?？傊?，exoPD-L1與NSCLC疾病進展相關，包括腫瘤大小、淋巴結狀態(tài)、轉移和TNM分期。

Kim等[40]檢測了PD-L1陽性外泌體處理后CD8+T細胞的增殖和凋亡情況。CD8+T細胞在CD3/CD28刺激下增殖，但外泌體處理不影響其增殖，然而，外泌體治療確實以劑量依賴的方式減少了CD8+T細胞的總數(shù)。與這些結果一致的是，用外泌體處理細胞顯著誘導了CD8+T細胞的凋亡，當用PD-L1陰性外泌體處理細胞時，CD8+T細胞的凋亡率降低，表明PD-L1陽性外泌體通過PD-1/PD-L1的相互作用促進CD8+T細胞的凋亡[41]。此外，從NSCLC患者血液中分離的外泌體上存在PD-L1，PD-L1陽性的外泌體通過抑制細胞因子和誘導CD8+T細胞的凋亡在腫瘤免疫逃逸中發(fā)揮重要作用[42]。

Del Re等[43]研究首次證明了在抗PD-1抗體治療過程中exoPD-L1表達的變化，對患有局部晚期或轉移性黑色素瘤或NSCLC的患者給予尼伏魯單抗或培溴利珠單抗治療2個月后檢測PD-L1外泌體mRNA水平。結果顯示，在治療有效的患者中，血漿來源的外泌體中的PD-L1水平顯著降低，而在疾病進展的患者中，PD-L1水平上升，而在疾病穩(wěn)定患者中沒有觀察到明顯的變化。這項研究表明，exoPD-L1與治療反應顯著相關。

用抗PD-1受體阻斷抗體預處理膠質母細胞瘤EV幾乎逆轉了T細胞的抑制并阻止了腫瘤的進展，而抗PD-1抗體可逆轉這些作用并阻止腫瘤進展。抗PD-1抗體可逆轉外泌體介導的膠質母細胞瘤中T細胞活化的阻斷，表明這些抗PD-1抗體與exoPD-L1競爭結合PD-1 T細胞[39]。有研究[19]還發(fā)現(xiàn)轉移性黑色素瘤來源的外泌體上的PD-L1抑制CD8+T細胞的激活，促進腫瘤生長，這些作用可以被抗PD-1抗體治療阻斷。令人驚訝的是，盡管細胞表面的PD-L1很低或不存在，但exoPD-L1可能是由其親代腫瘤細胞高度分泌的，這些細胞對抗PD-L1治療具有耐藥性[32]?？傊琫xoPD-L1在免疫抑制和耐藥方面起著關鍵作用。在NSCLC患者和黑色素瘤患者中，也發(fā)現(xiàn)胞外PD-L1 mRNA水平與抗PD-1 ICIs Nivolumab和Pembrolizumab的反應相關[38]。這些發(fā)現(xiàn)表明，exoPD-L1代表著一個尚未探索的治療靶點，消除外泌體可能是抗PD-1/PD-L1抗體增強的可行且必要的伴隨療法[44,45]。

5 小結

自2014年Pembrolizumab首次獲批用于治療晚期或不可切除的黑色素瘤以來，已有七種靶向PD-1或PD-L1的抗體獲FDA批準用于治療實體瘤或血液腫瘤疾?。馨土觯?。這些ICIs大大提高了許多晚期惡性腫瘤患者的生存率，但并非全部。從一種癌癥到另一種癌癥的臨床反應差異很大，反應的持久性也因患者而異。展望未來，在抗PD-1/PD-L1免疫檢查點治療過程中，不僅要考慮細胞表面PD-L1，還要考慮exoPD-L1[46]。阻斷外泌體釋放或抑制腫瘤微環(huán)境中外泌體介導的細胞串擾可能抑制腫瘤微環(huán)境有利因素的發(fā)展，這不失為一種新的肺癌免疫治療方法?？傊琫xoPD-L1作為生物標志物提供了理論依據(jù)，但需要進一步擴展，使外泌體的液體活檢成為可能。未來更需要專門針對exoPD-L1蛋白開展研究，探索ICIs和exoPD-L1抑制劑的聯(lián)合作用，以開發(fā)針對肺癌細胞免疫逃逸的新策略，并加強肺癌免疫治療的效果，為NSCLC患者免疫治療突破瓶頸探索新的機遇。