江笑丹 蔣真盛

(國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局專利局專利審查協(xié)作江蘇中心，江蘇 蘇州 215163)

親代傳給子代的遺傳物質(zhì)叫作種質(zhì)(germplasm)，具有種質(zhì)并能繁殖的生物體叫作種質(zhì)資源(germplasmresource)[1]。種質(zhì)資源是物種進(jìn)化、遺傳學(xué)研究及植物育種的物質(zhì)基礎(chǔ)。

種質(zhì)資源保存的方式有2種：原生境保存和非原生境保存，原生境保存是在原始生態(tài)條件下保存，可以保持高水平的遺傳完整性；非原生境保存是種質(zhì)保存于該植物原生態(tài)生長(zhǎng)地意外的地方，通過采集種子和植株部分在人工控制條件下保存種質(zhì)。種質(zhì)資源保存的方法包括種植保存(就地保存、遷地保存)、貯藏保存(又稱種子保存，包括短、中、長(zhǎng)期庫(kù))、離體保存(保存的材料種類多樣，有愈傷組織、懸浮細(xì)胞、幼芽生長(zhǎng)點(diǎn)、花粉、花藥、體細(xì)胞、原生質(zhì)體、幼胚、組織塊等)、基因文庫(kù)保存(通過重組DNA技術(shù)將植物DNA插入質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增)、利用保存(育成品種或育種中間材料)等[2，3]。

本文主要圍繞最常見、有效，操作簡(jiǎn)便，又便于種質(zhì)資源運(yùn)輸和交流的種子保存和離體試管保存2種方法展開。旨在為今后種質(zhì)資源的進(jìn)一步研究和應(yīng)用提供基礎(chǔ)。

1 種子的保存方式

1.1 種子低溫保存

種子被譽(yù)為農(nóng)業(yè)的“芯片”，種業(yè)是保障糧食安全的源頭。種子的保存方式一般有常溫和低溫2種，低溫保存不同的溫度所對(duì)應(yīng)的保存時(shí)間也不同，如，4℃的中期庫(kù)種子壽命一般為5～10a，-18℃的長(zhǎng)期庫(kù)種子壽命可達(dá)到20a以上。然而，上述方法仍然無(wú)法做到永久保存，20a后需要對(duì)種子庫(kù)進(jìn)行更新。為了進(jìn)一步延長(zhǎng)保存時(shí)間，人們考慮進(jìn)一步降低保存溫度，采用液氮保存植物種子。申請(qǐng)人為長(zhǎng)沙湘資生物科技有限公司的公開專利CN107691432A公開了一種白花蛇舌草種子的超低溫保存方法，首先用培養(yǎng)液培育，隨后轉(zhuǎn)入凍存管，加入抗凍液，采用梯度降溫以-1℃·min-1的速率降至指定溫度后投入液氮罐。所述培養(yǎng)液和抗凍液組分類似，均由MS培養(yǎng)液(最初為煙草細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)計(jì)，含豐富的無(wú)機(jī)鹽、氨基酸和維生素)和DMSO、甘油等凍存保護(hù)劑組成。上述凍存程序和保存液組成適用于多種不同科屬的植物種子，如雞血藤(豆科)、桔梗(桔?？?、千金子(禾本科)、羌活(傘形科)、天南星(天南星科)、川貝母(百合科)、白及(蘭科)、馬比木(茶茱萸科)、光皮樹(山茱萸科)、黃精(百合科)、白蘞(葡萄科)、威靈仙(毛茛科)、七葉一枝花(百合科)、山蒼子(樟科)等。

近年來，科研人員致力于對(duì)保存液配方的調(diào)整，以期提高種子解凍后的發(fā)芽率。申請(qǐng)人為中禾生物種業(yè)集團(tuán)有限公司的公開專利CN109892323A公開了一種玉米種子超低溫保存方法。該方法先采用PEG4000和甘油混合液對(duì)種子進(jìn)行預(yù)處理，隨后置于羥丙甲纖維素(HPMC)和氯化鈉的混合溶液中進(jìn)行凍存。HPMC分子量86000，屬于高聚物。采用含高聚物的保存液保存植物種質(zhì)是本領(lǐng)域的常規(guī)手段。高聚物、低聚物和小分子化合物作為冷凍保護(hù)劑時(shí)起到的作用不同。小分子化合物易與水分子通過氫鍵結(jié)合，穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，從而降低冰點(diǎn)。低聚物能夠誘導(dǎo)質(zhì)壁分離，在細(xì)胞壁和細(xì)胞膜之間形成緩沖層，減輕冰晶生長(zhǎng)對(duì)原生質(zhì)體的機(jī)械壓力。高聚物雖然不能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，但是能夠結(jié)合水分子，降低細(xì)胞外自由水的含量，減少胞外冰晶的形成，從而起到冷凍保護(hù)的作用。結(jié)合上述凍存保護(hù)劑的保護(hù)機(jī)制，科研人員在確定保存液配方時(shí)，通常會(huì)將幾種不同類型的保護(hù)劑混合使用，從而起到多層次保護(hù)的目的。

對(duì)于種子低溫保存而言，保存液組分影響保存效果，如保存期限、種子萌發(fā)率等;降溫程序也與種子能否恢復(fù)活力息息相關(guān)。申請(qǐng)人為中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所海南分所的公開專利CN108684657A公開了一種降香種子超低溫保存方法。降香為常用的中藥品種，具有化瘀止血、理氣止痛的作用?；礊槎箍浦参锝迪闾礃涓珊透母稍镄静摹Ｖ饕植加诤Ｄ习咨?、東方、樂東、三亞等地，屬于頑拗性種子。降香因木材珍貴，成年植株幾乎被砍伐殆盡，近年來有些樹樁都被連根拔起，供作藥用或工藝美術(shù)用。因此，降香已是瀕危物種，亟需開發(fā)合理的資源保護(hù)方法。上述專利中采用如下梯度降溫的方法：先在室溫下用裝載液處理，取出后轉(zhuǎn)入玻璃化保護(hù)劑，分別以5～8℃、0～-2℃、-5～-8℃3個(gè)溫度節(jié)點(diǎn)進(jìn)行降溫，最后投入液氮保存。凍存前種子的含水量為12.5%～13.5%。上述方法解決了現(xiàn)有技術(shù)中部分降香種子經(jīng)超低溫保存后芽不能健康成苗的問題。

1.2 頑拗性種子

然而，并不是所有種子均適合超低溫保存。1973年，Roberts根據(jù)種子的貯藏行為，把種子分為正常性種子和頑拗性種子2類。頑拗性種子主要存在于2類植物中，水生草本植物，如菱、茭白等；具有大粒種子的多年生木本植物，如椰子、芒果、荔枝等熱帶植物以及板栗等溫?zé)釒е参?。由于頑拗性種子的不耐脫水性，成熟脫落時(shí)代謝相對(duì)活躍，脫離母體后的生長(zhǎng)狀態(tài)不斷變化，因此種子采收后要采用嚴(yán)格的保存機(jī)制來維持其活力。短期的貯存方法有吸漲貯藏或水浸貯藏、部分脫水室溫貯藏、氣調(diào)法等。對(duì)于小粒的頑拗性種子，通常能夠?qū)崿F(xiàn)液氮下的超低溫貯藏，因?yàn)樵擃惙N子容易實(shí)現(xiàn)快速脫水的過程；而對(duì)于大粒的頑拗性種子，通常不適合在-196℃下保存，因?yàn)樵擃惙N子不易實(shí)現(xiàn)快速脫水，而緩慢脫水和降溫對(duì)種子是致命的[4]。申請(qǐng)人為肇慶學(xué)院的公開專利CN109362716A公開了一種柑橘砧木種子復(fù)合型保藏劑，所述柑橘砧木種子即為頑拗性種子。上述發(fā)明采用鉀鹽型高分子吸水樹脂與海藻酸鈉、殺菌劑相結(jié)合作為保藏劑，實(shí)現(xiàn)了柑橘砧木種子在3～5℃低溫條件下的全年儲(chǔ)藏，并保證了種子的高萌發(fā)率。上述發(fā)明中吸水樹脂能夠使得種子處在相對(duì)干燥的外環(huán)境中，結(jié)合殺菌劑的使用，使種子不易發(fā)霉變質(zhì)。但是種子的含水量仍然處在較高的水平，若進(jìn)行0℃以下的冷凍，仍然會(huì)因?yàn)楸p傷導(dǎo)致種子失活無(wú)法萌發(fā)。因此，申請(qǐng)人選擇在3～5℃的低溫環(huán)境下儲(chǔ)藏。上述保藏劑的選擇為頑拗性種子的低溫保存提供了一種新的思路。此外，海藻酸鈉的選擇是申請(qǐng)人從人工種子的制備方法中獲得的啟示。1978年英國(guó)科學(xué)家Murashige首次提出人工種子的概念，人工種子生產(chǎn)不受季節(jié)限制，易保存和運(yùn)輸，可保持優(yōu)良性狀，拯救珍稀和藥用物種，因此一直是研究熱點(diǎn)。在人工種子的生產(chǎn)過程中，羧甲基纖維素等凝膠劑以及殼聚糖等抑菌劑被用作人工種皮。人工種子的貯藏方法包括低溫抑制法、液體石蠟法、干燥法等[5]?？梢姡诮窈箝_發(fā)頑拗性種子保存方法的過程中，借鑒人工種子的保存技術(shù)，如包埋技術(shù)，不失為一種有效的選擇。

1.3 其他種子

除了頑拗型種子外，海草由于其生長(zhǎng)環(huán)境的特殊性，種子的保存液也與一般植物不同。申請(qǐng)人為中國(guó)科學(xué)院海洋研究所的公開專利CN107593687A公開了一種川蔓草種子保存的方法。通過將川蔓草種子果皮腐爛后洗凈，浸泡在滅菌高鹽人工海水中，于0℃低溫避光保存。川蔓草具有重要的生態(tài)價(jià)值，是越冬食草候鳥和底棲無(wú)脊椎動(dòng)物的重要食物資源，并且能夠改變河口海岸帶棲息地的水質(zhì)質(zhì)量。然而，川蔓草幼苗由于無(wú)法抵御夏季的干燥和冬季的寒冷，成苗率很低。而上述專利中的保存方法解決了川蔓草種子的長(zhǎng)期保存問題，為川蔓草資源保護(hù)工作提供了技術(shù)支持。從頑拗性種子和海草的保存液設(shè)計(jì)過程中可以看出，結(jié)合植物的自然生長(zhǎng)環(huán)境以及種子對(duì)惡劣環(huán)境的耐受能力是選擇保存液組分的重要原則。

2 花粉的保存

花粉包含有其物種的所有基因類型，具有豐富的遺傳多樣性，是種質(zhì)保存和交換的重要材料。但是一般情況下，花粉壽命很短，這給授粉帶來了極大困難。采用低溫或超低溫保存的方法能夠大大延長(zhǎng)花粉的保存時(shí)間，避免病蟲害的引入，為種質(zhì)交換提供方便?；ǚ叟c種子類似，對(duì)凍存前的含水量有一定的要求，如，銀杏花粉的含水量低于12.7%時(shí)，凍存于液氮中仍能存活，花粉含水量高于20%時(shí)，萌發(fā)率與生活力均顯著下降。但是也有對(duì)水量要求不高的植物，如芍藥、梅花多個(gè)品種的花粉超低溫保存時(shí)無(wú)需任何脫水處理[6]。申請(qǐng)人為廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所的公開專利CN110249800A公開了一種苦瓜花粉的收集和保存方法。其發(fā)明點(diǎn)在于，收集開花前1d的花蕾，人工干燥使花藥開裂，過篩除雜后在4℃或-80℃條件下保存。上述方法保存的花粉相比于開花后收集的花粉萌發(fā)率顯著提高。申請(qǐng)人為山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所的公開專利CN108651444A公開了一種蝴蝶蘭花粉保存及育種方法，根據(jù)花粉的使用需求，不同的保存期限對(duì)應(yīng)不同的保存溫度，1～7d內(nèi)使用的在18～25℃下暫存，8～60d內(nèi)使用的放置在4℃的冰箱內(nèi)保存，60d后使用的保存在-20℃的冷凍室內(nèi)。蝴蝶蘭為觀賞花卉，為了繁育出更多外形性狀的品種，需要進(jìn)行雜交處理。上述專利克服了現(xiàn)有技術(shù)中蝴蝶蘭雜交工作效率不高、雜交后需要去除母本花粉團(tuán)造成花粉浪費(fèi)、對(duì)于部分花期不遇的品種無(wú)法進(jìn)行雜交等缺點(diǎn)。上述專利中，主要目的是起到對(duì)花粉的轉(zhuǎn)移作用，所保存的花粉多在當(dāng)年當(dāng)季使用，因此，僅采用室溫保存和常規(guī)低溫保存。

一些植物的花粉并不適合采用常規(guī)的低溫保存方法。例如，羅漢果花粉壽命自然條件下僅1～2d，家用冰箱貯藏也不超過5d。現(xiàn)有技術(shù)中，羅漢果生產(chǎn)上一般100株雌株配置3～5株雄株，由于氣候變化等影響，有時(shí)會(huì)遇到雌、雄株不同時(shí)開花或雄株開花量不滿足授粉需求的問題。因此，需要有雄株花粉儲(chǔ)備才能滿足生產(chǎn)需要。申請(qǐng)人為桂林吉福思羅漢果有限公司的公開專利CN109362718A公開了一種羅漢果花粉超低溫貯藏的方法，將羅漢果花粉常溫下用硅膠或無(wú)水氯化鈣干燥24～72h，直至花粉含水量為10%～40%，裝入凍存管密封后，轉(zhuǎn)入-86℃超低溫冰箱或-196℃液氮中貯藏。上述方法克服了羅漢果花粉短缺以及常規(guī)方法貯存期限短的問題，噻唑藍(lán)染色顯示，超低溫保存的花粉解凍后人工授粉的結(jié)實(shí)率顯著高于家用冰箱(-18～20℃)保存的花粉。

3 植物莖尖和芽的保存

植物莖尖和芽的保存通常需要預(yù)培養(yǎng)，如果只使用凍存保護(hù)劑，不能保證細(xì)胞或組織具有較高的存活率，許多莖尖分生組織即便使用凍存保護(hù)劑，細(xì)胞或組織也不能存活。預(yù)培養(yǎng)的目的是增加細(xì)胞分裂與分化的同步化,減少細(xì)胞內(nèi)自由水的含量,使細(xì)胞能經(jīng)受低溫脅迫。如，在B5培養(yǎng)基中附加5%DMSO、5%葡萄糖，在4℃預(yù)培養(yǎng)2d，可提高白花三葉草莖尖分生組織的存活率。此外，低溫鍛煉也是保證凍存效果的有效方法，可激活植物體內(nèi)的抗寒機(jī)制。如，經(jīng)-30～-50℃低溫訓(xùn)練的蘋果枝條，其葉芽在液氮中保存2a仍可存活[7]。預(yù)培養(yǎng)和低溫鍛煉均可視作正式冷凍條件的預(yù)適應(yīng)，即相比于正式冷凍條件更為溫和的脫水條件和溫度。莖尖處理的降溫方法有慢凍法、快凍法、玻璃化法、包裹/脫水法、包裹/玻璃化法等多種，上述方法各有利弊，需要研究人員結(jié)合實(shí)際的設(shè)備條件、凍存材料的數(shù)量、凍存保護(hù)劑的毒性作用等因素進(jìn)行針對(duì)性地選擇。中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所的專利CN109221094A公開了一種香蕉離體莖尖超低溫保存方法。將香蕉苗置于蔗糖培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)2d，隨后剝?nèi)∏o尖，經(jīng)裝載液裝載后，利用玻璃化溶液PVS2于0℃下處理50min(相當(dāng)于低溫訓(xùn)練)，在液氮中蘸一下后迅速裝入盛滿液氮的冷凍管，浸入液氮保存。所述方法克服了現(xiàn)有技術(shù)采用田間保存結(jié)合離體試管苗保存，人力、物力、財(cái)力耗費(fèi)大的缺陷。

4 新動(dòng)態(tài)

目前，種質(zhì)資源保存方法主要著眼于新機(jī)制方面的研究、精細(xì)化保存等方法。如，申請(qǐng)人為上海交通大學(xué)的專利CN109619094A公開了一種百子蓮SK3脫水素蛋白在降低細(xì)胞脅迫傷害及改善超低溫保存效果中的應(yīng)用。上述方法跳出了傳統(tǒng)的超低溫保存手段從減少冰晶生成的角度進(jìn)行改進(jìn)的思路，轉(zhuǎn)而以種質(zhì)資源超低溫保存過程中可能遭遇的ROS氧化脅迫為切入點(diǎn)，尋找具有更優(yōu)保護(hù)效果的抗氧化劑。解決了現(xiàn)有技術(shù)中種質(zhì)資源超低溫保存后生長(zhǎng)率恢復(fù)不佳的問題。沈陽(yáng)藥科大學(xué)的專利CN114128437A、CN114128438A中公開適合苦參、石柱參的保存方法，從中可以得出只有對(duì)具體種子種質(zhì)資源的條件進(jìn)行優(yōu)化研究，建立良種種源基地，才能提高具體種質(zhì)資源的質(zhì)量。種質(zhì)資源精細(xì)化保存是建立良種種質(zhì)資源庫(kù)的關(guān)鍵。另外，對(duì)于離體資源的保存，筆者認(rèn)為可以從低溫保護(hù)劑出發(fā)，將領(lǐng)域內(nèi)新低溫保護(hù)劑如納米碳點(diǎn)、微米顆粒、液體金屬等用于保存種質(zhì)資源，以期提高復(fù)蘇率。

5 總結(jié)與期望

本文主要種子、花粉、莖尖、芽等不同類型的種質(zhì)資源的保存方法進(jìn)行歸納。普通種子和頑拗性種子均可采用投入液氮的方式保存，區(qū)別在于，凍存前的干燥過程普通種子能夠干燥至較低的含水量，而頑拗性種子由于不耐干燥，凍存前的含水量較高，如何避免冰晶對(duì)種子的損傷是需要主要考慮的問題。因此，對(duì)于降溫程序的調(diào)節(jié)(如快速冷凍)以及凍存保護(hù)劑的選擇顯得尤為重要?；ǚ圩鳛榉N質(zhì)資源凍存時(shí)不必準(zhǔn)備凍存保護(hù)液，只需干燥后冷凍即可，操作簡(jiǎn)便，且體積小便于跨區(qū)域種質(zhì)資源的運(yùn)輸與交流。莖尖和芽相對(duì)而言生理狀態(tài)更為脆弱，通常需要預(yù)培養(yǎng)和低溫鍛煉才能夠獲得理想的保存效果。

習(xí)總書記強(qiáng)調(diào)，只有用自己的手攥緊中國(guó)種子，才能端穩(wěn)中國(guó)飯碗，才能實(shí)現(xiàn)糧食安全。我們應(yīng)該加大對(duì)種子自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的保護(hù)，加大自主創(chuàng)新。盡管現(xiàn)有技術(shù)已經(jīng)提供了豐富的種質(zhì)資源保存方法，然而，目前針對(duì)瀕危、珍稀植物的保存仍然是逐一嘗試，效率較低。未來可以共建共享平臺(tái)，在共享庫(kù)中錄入植物共性數(shù)據(jù)，經(jīng)過大數(shù)據(jù)分析，生成優(yōu)選的保存方案，實(shí)現(xiàn)高效保存。另外，需盡快完善種質(zhì)質(zhì)量評(píng)估體系和相關(guān)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，合理布局，構(gòu)建良種種質(zhì)資源庫(kù)。