韓忠明，孫 卓，王 妍，張福軍，馬峰敏，羅秋菊，楊利民*

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院/省部共建生態(tài)恢復(fù)和生態(tài)系統(tǒng)管理國家重點實驗室培育基地，長春 130118； 2.集安市太王鎮(zhèn)林業(yè)工作站，集安 134200；3.吉林查干湖國家級自然保護(hù)區(qū)管理局，松原 131111）

防風(fēng)Saposhnikovia divaricata（Turcz.）Schisck.為傘形科防風(fēng)屬植物，以未抽花莖植株的干燥根入藥。味辛、微甘、性溫，具有止痙、祛風(fēng)解表、勝濕止痛的功效[1]。防風(fēng)作為新型冠狀病毒診療方案推薦中成藥“防風(fēng)通圣丸”等中成藥的重要原料，同時也是我國傳統(tǒng)的出口藥材，具有廣闊的應(yīng)用前景和可觀的經(jīng)濟(jì)價值。隨著防風(fēng)用量不斷增加，并出口韓國、日本及東南亞各國，導(dǎo)致野生資源銳減，價格逐年上漲，為此，防風(fēng)的栽培面積逐漸擴(kuò)大，主要集中在東北和內(nèi)蒙古等地區(qū)，其中吉林省白城地區(qū)防風(fēng)的栽培面積占全國面積的60%以上，但隨著栽培面積的不斷擴(kuò)大，防風(fēng)根腐病逐年加重，發(fā)病范圍逐漸擴(kuò)大，造成防風(fēng)大面積減產(chǎn)。木賊鐮刀菌是引起防風(fēng)根腐病的主要病原菌，通過入侵根部成為優(yōu)勢種，并破壞維管束組織來減少根部內(nèi)生真菌的聯(lián)合[2]。防風(fēng)根腐病發(fā)病初期根部產(chǎn)生褐色腐爛病斑，發(fā)病后期，染病根莖部有黑褐色、水漬狀、長條形的腐爛病斑。地上部分葉片變黃、細(xì)小，最后整株枯死[3]，已成為嚴(yán)重危害防風(fēng)根莖類中藥材的主要病害之一。目前，對于防風(fēng)根腐病主要采用惡霉靈、多菌靈、50%托布津等[3]化學(xué)農(nóng)藥進(jìn)行防治。然而長期使用化學(xué)農(nóng)藥不僅容易導(dǎo)致農(nóng)藥殘留[4]，還會形成病害抗藥性[5]、破壞生態(tài)平衡[6]、造成環(huán)境污染并且對人類身體健康構(gòu)成威脅[7]。而生物防治具有綠色安全無污染等特點，為此，生防菌的開發(fā)與應(yīng)用成為了植物病害合理化防控的研究熱點[8]。

藥用植物根際微生物作為寶貴的微生物資源，在植物病害生物防治方面越來越引起研究者們的關(guān)注。根際微生物種類豐富，可通過競爭、寄生、拮抗等作用方式抑制病原菌生長，提高植物防御酶活性、分泌促生長物質(zhì)等促進(jìn)植物生長。近年來，利用根際微生物防治中藥材土傳病害研究已取得部分進(jìn)展，杜用璽[9]從丹參根際土壤中分離出對丹參根腐病具有拮抗效果菌株SMRA-220，且可產(chǎn)生IAA，促進(jìn)丹參生物量的積累。高芬等[10]從黃芪根圍土中分離出一株對黃芪根腐病具有較強拮抗效果的萎縮芽胞桿菌。目前，從防風(fēng)分離得到病原菌主要有防風(fēng)殼狀孢、獨活白粉菌和旱芹葉點霉等[11]，而關(guān)于防風(fēng)根際土壤生防菌的分離和鑒定鮮有報道，因此從防風(fēng)根際土壤中分離篩選對根腐病具有較高防治效果的生防菌株，并用于防治防風(fēng)根腐病具有重要的理論和意義和實際指導(dǎo)意義。本研究以防風(fēng)根際土壤為研究材料，分離獲得一株對木賊鐮刀菌具有較強抑菌活性的拮抗菌株，并對其進(jìn)行了形態(tài)、顯微特征和ITS基因序列鑒定，并對此拮抗真菌的抑菌機理及在土壤中的定殖和對防風(fēng)的防病效果進(jìn)行了初步研究。為防治防風(fēng)根腐病、提高防風(fēng)產(chǎn)量具有指導(dǎo)意義，同時為微生物農(nóng)藥的開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

防風(fēng)根際土壤采集于2020年7月從吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)藥用植物園（43°48′23″N，125°24′57″） 采集人工栽培健康的1年生防風(fēng)植株的根際土壤，采用五點取樣法結(jié)合抖落法，采集健康防風(fēng)植株根際土壤（距離主根及須根根軸表面0～3 mm土壤），裝于無菌自封袋中，放入4 ℃ 冰箱內(nèi)保存，備用。

木賊鐮刀菌Fusarium equiseti、尖孢鐮刀菌F.oxysporum、腐皮鐮刀菌F.solani、細(xì)極鏈格孢Alternaria tenuissima、鵝掌楸鏈格孢A.liriodendra、毀滅柱孢菌Cylindrocarpon destructans、立枯絲核菌Rhizoctonia solani、灰葡萄孢Botrytis cinerea、惡疫霉Phytophthora cactorum、核盤菌Sclerotinia sclerotiorum均由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理實驗室提供。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（Potato Dextrose Agar，PDA）：去皮馬鈴薯200 g，葡萄糖20.0 g，瓊脂17.0 g，去離子水1000 mL；馬鈴薯葡萄糖水（Potato Dextrose Broth，PDB）：去皮馬鈴薯200.0 g，葡萄糖20.0 g，去離子水1000 mL。

供試藥劑70%代森錳鋅可濕性粉劑（四川潤爾科技有限公司）、枯草芽胞桿菌可濕性粉劑（山東魯抗生物農(nóng)藥有限責(zé)任公司）、哈茨木霉可濕性粉劑（山東綠隴生物科技有限公司）、97%利福平（上海麥克林生化科技有限公司）、DNA提取試劑盒TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0（TaKaRa寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司）。

Nikon eclipse 50i 三目顯微鏡（尼康儀器有限公司）、THZ-702B全溫度振蕩培養(yǎng)箱（太倉市華美生化儀器廠）、PTC-300光照培養(yǎng)箱（上海三騰儀器有限公司）、DYY-8C電泳儀（北京六一生物科技有限公司）、Applied Biosystems ProFlex PCR儀（賽默飛世爾科技有限公司）、Multifug1 X1R高速冷凍離心機（賽默飛世爾科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 拮抗真菌的分離純化 采用稀釋培養(yǎng)法分離土壤中的真菌，將防風(fēng)根際土風(fēng)干后過 20目篩，稱取10 g放入裝有90 mL 無菌生理鹽水的錐形瓶中充分震蕩搖勻，依次以10倍梯度稀釋得到各濃度土壤稀釋液。分別取10-3、10-4和10-5的稀釋液200 μL涂布于PDA培養(yǎng)基平板中，在25 ℃倒置暗培養(yǎng)3 d，挑取培養(yǎng)基上形態(tài)各異的單菌落進(jìn)行分離純化，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 拮抗菌株的篩選 以木賊鐮刀菌為靶標(biāo)菌，對分離出的真菌采用兩點對峙法進(jìn)行篩選。用打孔器分別在純化好的根際真菌與病原菌邊緣打孔，得到直徑為8 mm的菌餅。將病原菌菌餅接入直徑為90 mm的PDA培養(yǎng)皿中央，在距病原菌菌餅25 mm的兩個對稱點接入根際真菌菌餅，以只接木賊鐮刀菌為對照，重復(fù)3次。置于25 ℃黑暗下倒置培養(yǎng)7 d，計算每株菌株的抑菌率。抑菌率（%）=[（對照菌落直徑－處理菌落直徑）/對照菌落直徑]×100%

1.2.3 拮抗菌株的鑒定 選取已純化的待測菌株用打孔器打取8 mm菌餅接種于PDA培養(yǎng)基中央，25 ℃暗培養(yǎng) 14 d，觀察菌落形態(tài)、菌落直徑、孢子大小、形態(tài)和著生方式的特征等，并參照《真菌鑒定手冊》[12]對于病原菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)的鑒定。

采用TaKaRa DNA提取試劑盒提取菌株MR-47的基因組總DNA。采用真菌通用引物ITS1（5′-TCCGTA GGTGAACCTGCGG-3′）和 ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）對菌株 MR-47 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。反應(yīng)體系：Master Mix 12.5 μL、ITS1 1 μL、ITS4 1 μL、rDNA 2 μL、ddH2O 8.5 μL，擴(kuò)增程序為 94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)；72 ℃ 5 min[13]。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物交由上海生工進(jìn)行純化測序，測序結(jié)果在NCBI中進(jìn)行BLAST比對。通過MEGA 7.0軟件采用neighbor-joining法構(gòu)建菌株MR-47的系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 拮抗菌株發(fā)酵液對木賊鐮刀菌菌絲生長的影響 將待測菌株與木賊鐮刀菌在對峙培養(yǎng)下，挑取兩菌落相交部位菌絲制成玻片，于顯微鏡下觀察待測菌株與木賊鐮刀菌相互作用后病原菌菌絲形態(tài)特征。

1.2.5 拮抗菌株的抑菌譜 以立枯絲核菌、尖孢鐮刀菌、惡疫霉、灰葡萄孢等 10株病原真菌為靶標(biāo)菌，用平板對峙法對拮抗菌株進(jìn)行抑菌譜測定，將10種病原菌打取8 mm菌餅分別接種于PDA平板中央，待測菌株接種于距PDA中心25 mm的兩個對稱點中，培養(yǎng)7 d，計算抑菌率，抑制率（%）＝（對照菌落直徑－處理菌落直徑）/（對照菌落直徑－菌餅直徑）×100。

1.2.6 拮抗菌株的定殖 利用抗生素標(biāo)記法[14]標(biāo)記待測菌株，相繼在含有不同濃度利福平的 PDB培養(yǎng)基中對菌株MR-47進(jìn)行逐級誘導(dǎo)，使菌株可在含有抗利福平濃度達(dá)300 μg/mL的PDB培養(yǎng)基中穩(wěn)定生長的菌株MRRif-47，經(jīng)遺傳穩(wěn)定性后保存、備用。收集標(biāo)記菌株MRRif-47分生孢子（1×108CFU/mL）均勻拌土，每盆土300 g，倒入孢子懸液30 mL，3次重復(fù)。拌土結(jié)束后第7、14、21、28、35d分離土壤中的菌株MRRif-47。菌株MRRif-47的分離：采用梯度稀釋法同1.2.1，取梯度10-4濃度溶液200 μL涂布于含有300 μg/mL利福平的PDA培養(yǎng)皿中，3次重復(fù)，25 ℃培養(yǎng)3 d后統(tǒng)計每個培養(yǎng)皿中菌落數(shù)量，計算土壤中含菌量（CFU/g）。

1.2.7 菌株MR-47的盆栽防效試驗 挑選長勢一致的1年生健康防風(fēng)幼苗40株，每盆1株，采用針刺法于防風(fēng)莖基部劃傷約1 mm傷口，并以灌注方式沿植株莖基接種木賊鐮刀菌孢子懸液10 mL（孢子濃度為1×107CFU/mL）。試驗共設(shè)5個處理組，每組處理8次重復(fù)，各處理組獨立且完全隨機分布，具體為：（1）清水50 mL，對照；（2）70%代森錳鋅800倍液50 mL；（3）1×107CFU/mL枯草芽胞桿菌可濕性粉劑50 mL；（4）1×107CFU/mL哈茨木霉可濕性粉劑50 mL；（5）菌株MR-47孢子懸液1×107CFU/mL接種50 mL。接種30 d后調(diào)查防風(fēng)根腐病發(fā)病情況，計算病情指數(shù)與防效。

防風(fēng)根腐病病情分級標(biāo)準(zhǔn)：0級：健株，無病斑；1級：全株10 %以下的葉片發(fā)?。?級：全株11%～25%的葉片發(fā)??；5級：全株26%～50%的葉片發(fā)病；7級：全株51%～75%的葉片發(fā)??；9級：全株76%以上的葉片發(fā)病[15]。病情指數(shù)＝∑（各級病株數(shù)×各級代表值）/（調(diào)查總株數(shù)×最高級代表值）×100，防治效果（%）＝（對照病情指數(shù)－處理病情指數(shù)）/對照病情指數(shù)×100。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)采用DPS12.01軟件進(jìn)行差異顯著性檢驗，用Duncan's新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌株的分離和篩選

通過稀釋涂布法共分離到104株真菌菌株，將分離得到的菌株與木賊鐮刀菌做生長對峙實驗，篩選出29株對木賊鐮刀菌具有抑菌效果的拮抗菌株，菌株 MR-47對木賊鐮刀菌有較強抑菌效果，其抑菌率為69.26%（圖1）。因此，選定菌株MR-47進(jìn)行后續(xù)研究。

圖1 菌株MR-47對木賊鐮刀菌的抑菌效果Fig.1 The inhibitory effect of antagonistic strain MR-47 on F.equiseti

2.2 拮抗菌株的鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定 菌株在PDA中25 ℃暗培養(yǎng)14 d，菌落直徑為53～55 mm，菌絲密實、絨氈狀、無白邊，形成環(huán)狀輪紋，菌落正面淡粉色；背面有放射狀皺紋、呈橙褐色，有橙黃色分泌物滲入培養(yǎng)基中（圖2a）。菌絲無色，產(chǎn)孢瓶體自菌絲側(cè)生，不分枝、細(xì)長、近無色，長20～35 μm，基部寬1.5～3 μm，端部變窄，寬1～2.5 μm。分生孢子無色、近球形，直徑為3～6 μm（圖2-b）。根據(jù)菌落及顯微形態(tài)鑒定該菌株為枝頂孢屬。

圖2 菌株MR-47菌落及顯微形態(tài)特征Fig.2 Colony and morphological characteristics of strain MR-47

2.2.2 分子鑒定 菌株MR-47的ITS序列長度為476 bp，GenBank登錄號為OK287149.1。將該序列上傳至GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性比對，發(fā)現(xiàn)菌株MR-47與桃色頂孢霉Acremonium persicinum（KT315412.1）的相似度達(dá)99.77%。選擇相似性較高的菌株ITS序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）。結(jié)合形態(tài)特征及分子生物學(xué)鑒定結(jié)果最終確定菌株MR-47為桃色頂孢霉Acremonium persicinum。

圖3 菌株MR-47基于18S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 The phylogenetic tree of strain MR-47 based on 18S rDNA sequence

2.3 拮抗菌株對木賊鐮刀菌菌絲的影響

在光學(xué)顯微鏡下，對照菌絲光滑順直、粗細(xì)均勻（圖4a）；與MR-47對峙生長的病原菌菌絲形成縊縮（圖4b）、膨大、扭曲畸形、粗細(xì)不均（圖4c）等現(xiàn)象，說明MR-47可通過產(chǎn)生代謝產(chǎn)物抑制病原菌生長。

圖4 菌株MR-47對木賊鐮刀菌菌絲生長的影響Fig.4 Antibacterial effect of strain MR-47 on hypha growth of F.equiseti

2.4 拮抗菌株的抑菌譜

菌株MR-47對10種病原真菌均具有較強抑菌作用，其中對惡疫霉與毀滅柱孢菌的抑制作用最強，達(dá)到70%以上，分別為72.22%與74.07%。對立枯絲核菌的抑菌效果較弱，僅40.74%。表明拮抗菌株MR-47具有較強的廣譜抑菌能力（表1）。

表1 菌株MR-47對10種病原真菌抑制效果Table 1 Inhibitory effect of strain MR-47 on 10 pathogenic fungi

2.5 拮抗菌株在土壤中定殖能力

經(jīng)抗利福平誘導(dǎo)之后，待測菌株MR-47經(jīng)傳代培養(yǎng)10代，仍可在含有300 μg/mL利福平的PDA中穩(wěn)定生長，標(biāo)號為MRRif-47。土壤定殖試驗周期為35 d，未接種標(biāo)記菌株的供試土壤經(jīng)檢測，其所含微生物無法在含有300 μg/mL利福平的PDA平板生長，由此說明，該濃度下的抗生素選擇培養(yǎng)基可用于MRRif-47菌株的有效回收。如圖5所示，土壤中菌株MRRif-47接種第21 d含菌量最低，為5.57×106CFU/g土，而第28 d含菌量最大，達(dá)到8.38×106CFU/g土；隨后菌株MRRif-47的土壤含菌量平緩下降，接種后35 d，其土壤含菌量仍可達(dá)到6.13×106CFU/g。結(jié)果表明，菌株MR-47具有較好土壤定殖能力。

圖5 標(biāo)記菌株MRRif-47在土壤中的定殖量Fig.5 Colonization of MRRif-47 in the soil of S.divaricata

2.6 拮抗菌株盆栽防病效果

菌株MR-47對防風(fēng)根腐病的盆栽防控效果如表2所示，與對照相比，菌株MR-47、農(nóng)藥代森錳鋅、枯草芽胞桿菌及哈茨木霉，對防風(fēng)根腐病發(fā)病率和發(fā)病程度均表現(xiàn)出了不同程度的抑制作用。經(jīng) MR-47孢子懸液處理的防風(fēng)根腐病病情指數(shù)為16.00，相對防效達(dá)75.05 %，相較于代森錳鋅（61.54%）、枯草芽胞桿菌（49.99%）及哈慈木霉（51.89%）處理，具有顯著差異（P＜0.05）。由此說明，菌株MR-47對防風(fēng)根腐病具有顯著防治效果。

表2 菌株MR-47對盆栽防風(fēng)根腐病防效Table 2 Control effect of strain MR-47 on root rot of S.divaricata

3 討論

中藥材是農(nóng)業(yè)發(fā)展的重要產(chǎn)業(yè)之一，目前我國大力支持以中藥材為基礎(chǔ)的中醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)協(xié)同發(fā)展的振興之路。隨著中藥材種植業(yè)的發(fā)展，農(nóng)藥殘留問題受到廣泛關(guān)注[16]。土壤中微生物資源豐富，是拮抗菌篩選的重要來源，本研究從防風(fēng)根際土中分離出 104株根際真菌，并篩選出一株對木賊鐮刀菌抑菌效果達(dá)69.26%的菌株MR-47，根據(jù)對菌落形態(tài)觀察、結(jié)合ITS序列分析和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，最終鑒定菌株MR-47為桃色頂孢霉A.persicinum。

桃色頂孢霉A.persicinum是一株廣泛分布于土壤與海洋中的真菌[17]。目前，關(guān)于桃色頂孢霉的研究較少，主要集中于次生代謝產(chǎn)物的研究，并從中分離出多種環(huán)肽化合物[18]。如Ikuko等[19]從中分離出一種具有較強殺菌能力的螯合鋁離子的環(huán)狀六肽化合物ASP2397。Mohammadian等[20]研究發(fā)現(xiàn)A.persicinum對Zn和Cu具有較強積累能力，可應(yīng)用于土壤修復(fù)。此外，董雪梅等[21]研究發(fā)現(xiàn)頂孢霉菌可明顯抑制玉米圓斑病菌菌絲生長及孢子萌發(fā)。本研究表明，桃色頂孢霉MR-47對尖孢鐮刀菌、腐皮鐮刀菌等常見病原真菌具有較強的拮抗作用，表現(xiàn)了良好的廣譜抑菌能力。MR-47與木賊鐮刀菌共培養(yǎng)時，病原菌菌絲出現(xiàn)膨大、縊縮、扭曲等畸形現(xiàn)象，嚴(yán)重影響木賊鐮刀菌菌絲的正常生長。由此推測，桃色頂孢霉MR-47可能通過產(chǎn)生具有抑菌作用的胞外產(chǎn)物，實現(xiàn)其對防風(fēng)根腐病致病菌木賊鐮刀菌的生長抑制。但桃色頂孢霉 MR-47產(chǎn)生抑菌效應(yīng)的具體物質(zhì)尚不明確，仍需開展后續(xù)工作挖掘研究。

國內(nèi)外許多研究表明，生防菌的定殖能力是影響其生防效果的重要因素[22]。因此，生防菌在植物體內(nèi)和根際土壤中的定殖能力成為評定其是否具有產(chǎn)業(yè)化前景的一個重要指標(biāo)。焦蓉等[23]對生防菌YN201728在煙草內(nèi)的定殖規(guī)律及防病機制的研究中表明，生防菌密度的定殖規(guī)律為根表土＞根際土＞根＞莖＞葉，在煙草葉片中內(nèi)生菌的定殖量與防效呈正相關(guān)。目前，本研究對菌株MR-47土壤中的定殖能力進(jìn)行評價，發(fā)現(xiàn)菌株MR-47定殖于土壤中35 d后，在土壤中仍可達(dá)到較高活菌數(shù)，達(dá)到6.13×106CFU/g。對防風(fēng)根腐病具有較強防治效果，其防效可達(dá) 75.05%，對照組枯草芽胞桿菌與哈茨木霉的防效分別為49.99%、51.89%。綜上所述，分離篩選自防風(fēng)根際土壤的桃色頂孢霉 MR-47在防風(fēng)生態(tài)友好型病害防控方面具有開發(fā)及應(yīng)用潛力。