徐冰南 金亞彬 徐麗南

(1.佛山市第一人民醫(yī)院腫瘤婦科，廣東 佛山 528000；2.廣東省中山醫(yī)科大學附屬第六醫(yī)院生殖中心，廣東 廣州 510000)

宮頸癌作為常見的婦科惡性腫瘤給女性的健康與生命造成了極大的危害。有調(diào)查資料顯示[1]，我國每年新發(fā)宮頸癌病例約占全球的1/5，且每年死于宮頸癌的病例占全球的10%左右。盡管近年來宮頸癌的發(fā)病率和死亡率有所下降，但該病有年輕化趨勢，且針對該病的防治形勢仍十分嚴峻[2]。順鉑是宮頸癌常用的化療藥物，可抑制脫氧核糖核酸(DNA)的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，減少細胞增殖，但宮頸癌使用順鉑化療易產(chǎn)生耐藥性[3]。因此如何增強宮頸癌順鉑化療的敏感性已成為研究的重點。叉頭盒蛋白M1(FOXM1)屬于Fox轉(zhuǎn)錄因子家族成員，與細胞增殖密切相關(guān)，且還可參與細胞凋亡與分化等[4]。既往研究表明[5-7]，F(xiàn)OXM1可參與多種惡性腫瘤的發(fā)生，包括肺癌、宮頸癌等，另外FOXM1表達上調(diào)可激活下游的細胞周期蛋白B1(Cyclin B1)、細胞分裂周期因子25B(CDC25B)、存活蛋白(Survivin)，抑制p21，參與患者的病情進展導致預(yù)后不良。另有研究顯示[8]，F(xiàn)OXM1表達下調(diào)可增強人喉癌細胞株Hep-2順鉑化療的敏感性，促進細胞凋亡。但FOXM1是否會影響人宮頸癌耐藥細胞株Hela/DDP順鉑化療的敏感性及其可能的機制尚不清楚?；诖?，本研究展開體外細胞實驗，設(shè)計FOXM1表達上調(diào)、下調(diào)及對照組，并增加空白組和抑制劑組，探討上述問題，旨在為增強宮頸癌順鉑化療敏感性提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 人宮頸癌耐藥細胞株Hela/DDP(購自美國ATCC細胞庫，貨號：FB06008)。

1.1.2 主要藥品與試劑 含有正義FOXM1 互補的脫氧核糖核酸(cDNA)的真核質(zhì)粒、空真核質(zhì)粒、干擾FOXM1基因表達的重組、空載重組質(zhì)粒構(gòu)建和載體鑒定均委托寶生物(大連)公司完成；脂質(zhì)體Lipofectamine2000(美國Invitrogen公司)；改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)高糖培養(yǎng)液(美國Gibco公司)；洛斯維·帕克紀念研究所(RPMI)1640培養(yǎng)液(美國Gibco公司)；順鉑(美國Sigma公司)；硫鏈絲菌肽(江蘇艾康生物醫(yī)藥研發(fā)有限公司)；Trizol試劑(美國Invitrogen公司)；FOXM1、Cyclin B1、CDC25B、Survivin、p21及β-actin引物均委托深圳晶美生物工程有限公司合成；二喹啉甲酸(BCA)法蛋白定量試劑盒(美國Thermo公司)；鼠抗人FOXM1、Cyclin B1、CDC25B、Survivin、p21單克隆抗體(一抗)，兔抗鼠FOXM1、Cyclin B1、CDC25B、Survivin、p21多克隆抗體(二抗，辣根過氧化物酶標記)(美國Santa Cruz公司)；細胞增殖抑制率噻唑藍(MTT)法試劑盒(上海歌凡生物科技有限公司)；二甲基亞砜(DMSO)(江蘇永健化工有限公司)；Binding Buffer(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司)；膜聯(lián)蛋白-V異硫氰基熒光素(Annexin-V FITC)(美國Sigma公司)；碘化丙啶(PI)(美國Sigma公司)。

1.1.3 儀器 MCO-18AIC型CO2培養(yǎng)箱(日本Sanyo公司)；7900-Fast型聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)儀(美國ABI公司)；Compact XS型電泳儀(德國Biometra公司)；Trans-Blot?TurboTM型轉(zhuǎn)膜儀(美國Bio Rad公司)；iBright FL1000型成像掃描儀(Odyssey)(美國Thermo Fisher公司)；XDS-18型倒置顯微鏡(重慶光電儀器有限公司)；TDZ5-BP型醫(yī)用離心機(長沙湘銳離心機有限公司)；CytoFLEX型流式細胞儀(美國Thermo Fisher公司)。

1.2 方法

1.2.1 質(zhì)粒與載體的構(gòu)建 構(gòu)建含有正義FOXM1 cDNA的真核表達載體(質(zhì)粒正義鏈：5′-AUCUU GAGAUCUAG-3′，反義鏈：5′-CGUAGAUUCUAGA GAC-3′)、空質(zhì)粒的真核表達載體(質(zhì)粒正義鏈：5′-AGGGGUCUCUAA-3′，反義鏈：5′-CUGGGUAUAU ACGAU-3′)、干擾FOXM1基因表達的重組載體(質(zhì)粒正義鏈：5′-UCGUAUAGCUUAUAGGA-3′，反義鏈：5′-AUCUAGGAUCUGAGAGCA-3′)和空載載體(質(zhì)粒正義鏈：5′-AGUUACGATAGCTUAGC-3′，反義鏈：5′-AGATTCUATAUCUATAC-3′)，轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體Lipofectamine2000。

1.2.2 細胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染和分組 人宮頸癌耐藥細胞株Hela/DDP以DMEM高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)，含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素，培養(yǎng)至對數(shù)生長期，條件：37℃、5%CO2培養(yǎng)箱。取上述細胞接種至6孔板，每孔2.0×105個細胞。次日，按照轉(zhuǎn)染試劑說明書分別將100 nmol/L的載體加入細胞進行轉(zhuǎn)染，利用嘌呤霉素篩選轉(zhuǎn)染成功的細胞，并分別記為過表達組(含有正義FOXM1 cDNA的真核表達質(zhì)粒與干擾FOXM1基因表達的重組質(zhì)粒分別上調(diào))、過表達對照組(轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的真核表達載體)、沉默組(抑制FOXM1表達)、沉默對照組(空載載體)。另設(shè)置空白組(無轉(zhuǎn)染、未添加抑制劑、無特殊干預(yù)的細胞)和抑制劑組(添加FOXM1抑制劑培養(yǎng)的人宮頸癌細胞株Hela/DDP)?？瞻捉M和抑制劑組僅加入RPMI1640培養(yǎng)液。每組5個復(fù)孔，均加入順鉑使其終濃度為100 ng/mL，抑制劑組另加入FOXM1特異性抑制劑硫鏈絲菌肽使其終濃度為2 μmol/L，培養(yǎng)48 h。

1.2.3 FOXM1基因干擾的驗證 ①采用實時逆轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR(RT-qPCR)法檢測各組細胞FOXM1 信使核糖核酸(mRNA)表達：取各組細胞采用Trizol試劑提取總RNA，鑒定并反轉(zhuǎn)錄，將獲取的cDNA作為模板進行擴增反應(yīng)。FOXM1引物序列：正向5′-TAGAGCTTAGAGCTAG-3′，反向5′-CTGATAGGCTATAGCTAGC-3′，預(yù)計擴增產(chǎn)物長度240 bp；持家基因β-actin引物序列：正向5′-AGGCTAGAGCTAGACA-3′，反向5′-CTGAGAGCTTAGAGCTAGAGC-3′，預(yù)計擴增產(chǎn)物長度196 bp。反應(yīng)流程：94℃(60 s)，40個循環(huán)：72℃(90 s)、54℃(30 s)，最后72℃(5 min)。計算2-△△Ct。②采用蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western Blot)檢測各組FOXM1蛋白表達：各組分別加入細胞裂解液，收集總蛋白，BCA法定量。100℃煮5 min使蛋白變性，配置十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠，上樣量50 μL/孔。電泳參數(shù)：濃縮膠電泳恒定電壓60 V，分離膠電泳恒定電壓100 V，直至溴酚藍跑至膠底部。濕轉(zhuǎn)膜，100 mA、90 min。封閉1 h后加入一抗稀釋液(稀釋倍數(shù)：1∶1000)，4℃孵育過夜；洗膜3次、10 min/次，加入二抗稀釋液(稀釋倍數(shù)：1∶2000)，室溫孵育1 h，再次洗膜。暗室曝光顯影，利用成像掃描儀掃描，系統(tǒng)軟件計算目的蛋白條帶累計光密度值與內(nèi)參的比值。

1.2.4 細胞形態(tài)學觀察 于倒置顯微鏡下觀察各組培養(yǎng)48 h后的細胞形態(tài)學變化。

1.2.5 細胞增殖抑制率檢測 采用MTT法，每孔加入MTT溶液25 μL，濃度5 g/L，避光孵育4 h。加入DMSO繼續(xù)孵育4 h，150 μL/孔。震蕩10 min，測定各孔在490 nm處的光密度值，該實驗另設(shè)置無干預(yù)組，即僅常規(guī)培養(yǎng)的人宮頸癌耐藥細胞株Hela/DDP，增殖抑制率=1-(觀察組光密度值/無干預(yù)組光密度值)[9]。

1.2.6 細胞凋亡率檢測 采用流式細胞儀雙染法，取各組細胞磷酸鹽緩沖液洗滌，胰酶消化，并以細胞上清液終止消化。1000 r/min(離心半徑10 cm)離心5 min，以500 μL Binding Buffer重懸細胞，加入5 mL Annexin-V FITC混勻，再加入5 mL PI混勻，室溫避光。20 min后上機檢測，計算早期凋亡和晚期凋亡細胞占比總和記作細胞凋亡率[10]。

1.2.7 FOXM1下游相關(guān)mRNA表達檢測 采用RT-qPCR法，具體操作同上，其中Cyclin B1引物序列：正向5′-ATCGGTATAGGTATAGCGTAG-3′，反向5′-CGGTATAGGAGGCTAGAGCTAG-3′，預(yù)計擴增產(chǎn)物長度286 bp；CDC25B引物序列：正向5′-CGTATAGGCTATAGC-3′，反向5′-AGAGCTTGA GAGCTGA-3′，預(yù)計擴增產(chǎn)物長度162 bp；Survivin引物序列：正向5′-CGGTAAGGCTATAG-3′，反向5′-AGAGCTTAGAGCTG-3′，預(yù)計擴增產(chǎn)物長度152 bp；p21引物序列：正向5′-AGAGTCTGAGAGCTA GAG-3′，反向5′-CGAGTATAGCGTATAGCTAA-3′，預(yù)計擴增產(chǎn)物長度218 bp。

1.2.8 FOXM1下游相關(guān)蛋白表達檢測 采用Western Blot法，具體操作同上，其中一抗稀釋倍數(shù)：1∶1000、1∶1000、1∶2000、1∶1000；二抗稀釋倍數(shù)：1∶2000、1∶2000、1∶5000、1∶2000。

2 結(jié)果

2.1 FOXM1基因干擾驗證結(jié)果 與空白組比較，沉默組和抑制劑組FOXM1 mRNA及蛋白表達均下降(P<0.05)，過表達組上述指標均升高(P<0.05)；空白組、過表達對照組和沉默對照組FOXM1 mRNA及蛋白表達比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；沉默組和抑制劑組FOXM1 mRNA及蛋白表達比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

2.2 細胞形態(tài)學改變觀察 空白組、沉默對照組、過表達對照組細胞均貼壁生長、狀態(tài)良好、呈片狀、緊密連接，且細胞飽滿，大小和形態(tài)均勻；過表達組細胞呈貼壁生長、狀態(tài)理想，連接致密，且細胞數(shù)量多；沉默組和抑制劑組細胞密度下降、體積不均、形態(tài)不一、輪廓不清，細胞間空隙加大、部分細胞呈懸浮狀態(tài)，且二者可見細胞大量皺縮的細胞，且細胞碎片增多，見圖1。

表1 各組FOXM1 mRNA及蛋白表達比較

圖1 各組細胞形態(tài)學改變(倒置顯微鏡，200×，刻度尺：100 μm)

2.3 各組細胞增殖抑制率比較 與空白組比較，沉默組和抑制劑組增殖抑制率均升高(P<0.05)，過表達組增殖抑制率下降(P<0.05)；空白組、過表達對照組和沉默對照組增殖抑制率比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；沉默組和抑制劑組增殖抑制率比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2。

表2 各組細胞增殖抑制率比較

2.4 各組細胞凋亡率比較 與空白組比較，沉默組和抑制劑組凋亡率均升高(P<0.05)，過表達組凋亡率下降(P<0.05)；空白組、過表達對照組和沉默對照組凋亡率比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；沉默組和抑制劑組凋亡率比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表3、圖2。

表3 各組細胞凋亡率比較

2.5 各組細胞Cyclin B1、CDC25B、Survivin、p21 mRNA表達比較 與空白組比較，沉默組和抑制劑組Cyclin B1、CDC25B、Survivin mRNA表達均下降(P<0.05)，過表達組上述指標均升高(P<0.05)；與空白組比較，沉默組和抑制劑組p21 mRNA表達均升高(P<0.05)，過表達組上述指標下降(P<0.05)；空白組、過表達對照組和沉默對照組Cyclin B1、CDC25B、Survivin、p21 mRNA表達比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，沉默組和抑制劑組比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表4。

表4 各組Cyclin B1、CDC25B、Survivin、p21 mRNA表達比較

2.6 各組細胞Cyclin B1、CDC25B、Survivin、p21蛋白表達比較 與空白組比較，沉默組和抑制劑組Cyclin B1、CDC25B、Survivin蛋白表達均下降(P<0.05)，過表達組上述指標均升高(P<0.05)；與空白組比較，沉默組和抑制劑組p21蛋白表達均升高(P<0.05)，過表達組上述指標下降(P<0.05)；空白組、過表達對照組和沉默對照組Cyclin B1、CDC25B、Survivin、p21蛋白表達比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，沉默組和抑制劑組比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表5、圖3。

表5 各組Cyclin B1、CDC25B、Survivin、p21蛋白表達比較

圖3 Western Blot檢測各組Cyclin B1、CDC25B、Survivin、p21蛋白表達

3 討論

順鉑在宮頸癌治療中應(yīng)用廣泛，可作為化療藥物、放療增敏劑發(fā)揮雙重作用[11]。有報道顯示[12]，宮頸癌患者采用順鉑化療的緩解率可達25%，且該藥物在宮頸癌治療中占據(jù)著重要的地位。然而順鉑副作用大，且長期應(yīng)用易產(chǎn)生耐藥性。據(jù)吳少敏等[13]報道，宮頸癌患者采用順鉑單藥化療的耐藥率為32.35%，提示順鉑化療耐藥也是宮頸癌治療中的重要難題。而目前人們關(guān)于宮頸癌順鉑化療耐藥的原因及機制認識尚淺，如何有效提高其敏感性仍需重點研究。

FOXM1屬于增殖特異性因子，與細胞增殖活性、侵襲轉(zhuǎn)移能力及新血管生成等均有關(guān)，當其表達水平上調(diào)不僅可通過上述途徑促進腫瘤發(fā)生和進展，還可激活參與腫瘤發(fā)生和進展的多種因子，如基質(zhì)金屬蛋白酶-2等。關(guān)于FOXM1表達與惡性腫瘤化療敏感性的相關(guān)性既往也有相關(guān)報道證實[14]，提示FOXM1蛋白陽性表達是惡性腫瘤化療耐藥的危險因素，也說明可嘗試將其作為惡性腫瘤治療的新靶點，使用FOXM1抑制劑以增強患者化療的敏感性。但此類研究目前仍處于實驗階段，尚未應(yīng)用于臨床。本研究結(jié)果顯示，沉默組和抑制劑組FOXM1基因與蛋白表達水平均較空白組下降，過表達組則均升高，證實干擾FOXM1表達的載體構(gòu)建成功。本研究中利用空白組評價過表達組、沉默組的基因干擾效率，了解干擾FOXM1基因表達對此類細胞的具體作用及分子機制，同時可利用過表達對照組、沉默對照組排除陽性干擾，避免結(jié)果偏倚。本研究以脂質(zhì)體LiperfactimineTM2000為載體，可確保轉(zhuǎn)染效率；將上述載體分別于人宮頸癌耐藥細胞株Hela/DDP共培養(yǎng)可保證成功干擾FOXM1表達。此外，本研究設(shè)置抑制劑組，主要是因為硫鏈絲菌肽是FOXM1特異性抑制劑[15]，設(shè)置該組可驗證沉默組增強順鉑化療敏感性的作用。FOXM1主要是通過影響細胞周期進而影響細胞增殖活性的，而順鉑則是通過破壞DNA的復(fù)制與功能、干擾細胞周期進而殺滅癌細胞的，因此推測干擾FOXM1表達很可能能夠影響人宮頸癌耐藥細胞株Hela/DDP順鉑化療的敏感性。另外，本研究細胞形態(tài)學、增殖抑制率和凋亡率結(jié)果均證實上調(diào)FOXM1表達可降低人宮頸癌耐藥細胞株Hela/DDP順鉑化療的敏感性，而抑制FOXM1表達則可增強其順鉑化療的敏感性，與上述分析相符。

FOXM1可正反饋調(diào)節(jié)其下游的Cyclin B1、CDC25B、Survivin表達，負反饋調(diào)節(jié)其下游的p21表達，而各分子均是參與惡性腫瘤細胞周期進展的重要指標[16-17]。研究發(fā)現(xiàn)[18]，F(xiàn)OXM1表達上調(diào)可激活其靶基因Cyclin B1、CDC25B、Survivin等，并抑制p21等，進而在DNA合成前期末發(fā)揮作用，并持續(xù)整個DNA合成期、DNA合成后期、細胞分裂期等，而p21表達下調(diào)不僅可促進DNA合成前期向DNA合成期、DNA合成后期向細胞分裂期轉(zhuǎn)換，還可抑制細胞凋亡。FOXM1表達缺失則可阻滯細胞周期進展，且常導致有絲分裂紡錘體缺陷，可引發(fā)非整倍體及多倍體產(chǎn)生[19]。目前腫瘤學專家普遍認為[20-22]，F(xiàn)OXM1上調(diào)可通過DNA損傷修復(fù)、細胞增殖、細胞凋亡及組織穩(wěn)態(tài)等多種途徑參與實體瘤的形成，并且還可誘導惡性腫瘤細胞對鉑類化療藥物產(chǎn)生耐藥性，因此抑制FOXM1表達、阻斷該信號通路的轉(zhuǎn)導是增強鉑類化療藥物敏感性的新方案。由此可知，抑制FOXM1表達有助于增強惡性腫瘤細胞對鉑類化療藥物的敏感性，且與抑制Cyclin B1、CDC25B、Survivin表達，上調(diào)p21表達有關(guān)；而上調(diào)FOXM1表達則可增強惡性腫瘤細胞對鉑類化療藥物的耐藥性，且很可能與上調(diào)Cyclin B1、CDC25B、Survivin表達，下調(diào)p21表達有關(guān)。本研究結(jié)果中過表達組Cyclin B1、CDC25B、Survivin表達均較其余各組升高，p21表達則均較各組下降，且沉默組Cyclin B1、CDC25B、Survivin表達則顯著低于沉默對照組和空白組，p21表達顯著高于沉默對照組和空白組，研究結(jié)果與上述分析一致，提示干擾FOXM1可影響宮頸癌順鉑化療的敏感性，建議深入研究以服務(wù)于臨床。

4 結(jié)論

上調(diào)FOXM1表達可降低人宮頸癌耐藥細胞株Hela/DDP順鉑化療的敏感性，而抑制FOXM1表達可增強其敏感性，并且有助于促進細胞形態(tài)學改變，提高增殖抑制率和凋亡率，推測與調(diào)控FOXM1信號通路，正反饋調(diào)節(jié)Cyclin B1、CDC25B、Survivin表達，負反饋調(diào)節(jié)p21表達有關(guān)。但該結(jié)論應(yīng)用于臨床的策略及可行性仍需要進一步探討，應(yīng)作為后期研究的重點。