祝 晶，王 璐，何劼毅，漆欣筑

(貴州省食品藥品檢驗(yàn)所，貴州 貴陽(yáng) 550004)

0 引言

去甲斑蝥酸鈉是斑蝥素的衍生物之一，是由斑蝥素在堿性條件下制得斑蝥酸鈉后，去掉3，4位的2個(gè)甲基后得到的化合物。去甲斑蝥酸鈉腎毒性和對(duì)泌尿系統(tǒng)的刺激明顯減輕，而抗癌活性則顯著高于斑蝥素，此外還具有較好的升高白細(xì)胞及免疫調(diào)節(jié)的作用，對(duì)正常肝細(xì)胞有較好的保護(hù)作用[1]。研究發(fā)現(xiàn)，去甲斑蝥酸鈉對(duì)肝癌[2]，肺癌[3]，非小細(xì)胞癌[4]，鼻咽癌[5]療效確切，臨床已作為抗腫瘤的常規(guī)用藥。目前國(guó)內(nèi)其制劑有注射用去甲斑蝥酸鈉、去甲斑蝥酸鈉注射液及去甲斑蝥酸鈉氯化鈉注射液。

甘露醇(Mannitol)又稱(chēng)D-甘露糖醇，為白色結(jié)晶或結(jié)晶性粉末，分子式C6H14O6，分子量182.17。由于甘露醇穩(wěn)定性較好，且在人體內(nèi)代謝與體內(nèi)胰島素?zé)o關(guān)，不是口腔微生物作用的適合底物而不致齲齒，因而廣泛用于食品、醫(yī)藥行業(yè)。作為原料，甘露醇可用做脫水藥和滲透性利尿藥，其注射劑用于降低顱內(nèi)壓和眼內(nèi)壓，利尿，早期腎功能不全，腦水腫與青光眼及燒傷休克等并發(fā)的急性腎功能不全等[6]。作為藥用輔料，由于其具有抗粘性，可壓性，造料性較好，甘露醇常用于藥品片劑的填充劑、潤(rùn)滑劑，也在凍干制劑中用作保護(hù)劑，賦形劑，其制得的凍干粉針飽滿(mǎn)、疏松，常優(yōu)選于其他賦形劑如乳糖、蔗糖、葡萄糖等[7-9]。但甘露醇也有一些列不良反應(yīng)，多次靜脈注射甘露醇，不僅對(duì)于穿刺局部，而且對(duì)于鄰近的血管及其周?chē)M織也具有更明顯的損害作用，在接受靜脈輸液的病人中，大概率出現(xiàn)程度不同的靜脈炎[10]。其利尿作用增加腎臟能量需求, 同時(shí)增加了急性腎衰(ARF)發(fā)生的機(jī)率，嚴(yán)重者發(fā)展為尿毒癥[11]，還可能引起過(guò)敏性休克，致神經(jīng)系統(tǒng)，呼吸系統(tǒng)，循環(huán)系統(tǒng)受到損傷[12]。查閱相關(guān)文獻(xiàn)，甘露醇每次使用劑量不宜超過(guò)100 g，每天總量不宜超過(guò)300 g，每日尿量少于1 500 mL的患者要慎用[13]。

本次抽驗(yàn)涉及到2個(gè)廠家(廠家A，B)生產(chǎn)的注射用去甲斑蝥酸鈉3批次(A1、B1、B2)，執(zhí)行2個(gè)檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)[14-15]。經(jīng)調(diào)研，2個(gè)廠家生產(chǎn)的注射用去甲斑蝥酸鈉均選用甘露醇作為輔料，處方中甘露醇的使用比例不同(收集到B廠家的處方量，甘露醇加入量為95%)，且均未對(duì)甘露醇進(jìn)行含量控制。考慮甘露醇可能會(huì)帶來(lái)的不良反應(yīng)，因此，對(duì)各廠家樣品中所含的甘露醇進(jìn)行測(cè)定，有效控制注射用去甲斑蝥酸鈉中甘露醇的含量是十分有必要的。甘露醇屬于六元醇極性化合物，自身沒(méi)有紫外吸收，在常規(guī)的C18柱上幾乎無(wú)保留。查閱相關(guān)文獻(xiàn)，目前對(duì)于甘露醇定量分析的方法也多為高效液相色譜-示差折光檢測(cè)法(HPLC-RID)，色譜柱選用強(qiáng)離子鈣型交換柱，此方法專(zhuān)屬性較好，適用于復(fù)雜體系中甘露醇含量的測(cè)定，專(zhuān)屬性好，準(zhǔn)確度靈敏度高[16-17]。因此，本實(shí)驗(yàn)建立HPLC-RID法測(cè)定注射用去甲斑蝥酸鈉中甘露醇含量，并進(jìn)行方法學(xué)考察，為該品種的輔料用量控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

1.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

高效液相色譜儀(Ultimate 3000)，示差折光檢測(cè)器(Thermo SHOKO)；XS-205型電子分析天平(瑞士梅特勒公司)、超聲儀(型號(hào)：KQ-500DE，昆山市超聲儀器有限公司)、純水機(jī)(UPL-I-30EZ，四川優(yōu)普超純科技有限公司)；色譜柱：Carbomix Ca-NP10：8%(7.8 mm×300 mm，10 μm，柱號(hào)：251008-7830)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與試藥

甘露醇對(duì)照品(100533-201103，中檢院，98.5%)，自制超純水，注射用去甲斑蝥酸鈉3批次(A廠家1批次，編號(hào)A1；B廠家2批次，編號(hào)B1、B2)，規(guī)格：10 mg/瓶。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用磺化交聯(lián)的苯乙烯二乙烯基苯共聚物為填充劑的強(qiáng)離子鈣型交換柱，以水為流動(dòng)相，流速0.5 mL/min，柱溫80 ℃，示差折光檢測(cè)器，檢測(cè)溫度為55 ℃，測(cè)定效果良好。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備

精密稱(chēng)取甘露醇對(duì)照品50.0 mg，置10 mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備

精密稱(chēng)取樣品(編號(hào)B2)適量，置50 mL量瓶中，加適量水超聲溶解，稀釋成1 mL含甘露醇約5 mg的溶液，搖勻，即得。

2.2.3 陰性溶液的制備

按注射用去甲斑蝥酸鈉的處方制備不含甘露醇的陰性樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法同法制備，即得。

2.2.4 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

分別精密吸取上述對(duì)照品溶液，供試品溶液及陰性溶液，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖。陰性樣品未見(jiàn)吸收峰，無(wú)干擾。供試品中甘露醇峰的保留時(shí)間與對(duì)照品溶液中甘露醇峰的保留時(shí)間一致。甘露醇峰與相鄰峰的分離度達(dá)到要求，理論板數(shù)按甘露醇峰計(jì)不低于3 000，見(jiàn)圖1所示。

圖1 甘露醇對(duì)照品(A)、注射用去甲斑蝥酸鈉供試品(B)和陰性樣品(C)的HPLC-RID色譜圖

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系考察

分別精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下的甘露醇對(duì)照品溶液10 μL、15 μL、20 μL、25 μL、30 μL和50 μL(對(duì)應(yīng)分別含甘露醇0.049 36 mg、0.074 04 mg、0.098 70 mg、0.123 4 mg、0.148 1 mg和0.246 8 mg)注入高效液相色譜儀中，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖。并以對(duì)照品的量(mg)為橫坐標(biāo),峰面積的值為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。得回歸方程y=0.003 5x+0.000 3，r=0.999 9。結(jié)果表明甘露醇在0.049 36～0.246 8 mg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.3.2 精密度試驗(yàn)

精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下的甘露醇對(duì)照品溶液20 μL注入高效液相色譜儀，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，峰面積RSD為0.19%，說(shuō)明儀器精密度良好。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn)

按“2.2.2”項(xiàng)下的方法，平行制備6份供試品(編號(hào)1至6)，精密吸取樣品溶液20 μL注入高效液相色譜儀中，測(cè)定峰面積，計(jì)算甘露醇的含量(mg/g)，平均含量為954.20 mg/g，6份供試品含量的RSD為0.30%，重復(fù)性結(jié)果良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.3.3”項(xiàng)下的供試品1，在室溫下每0 h、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h和24 h，各精密吸取供試品溶液20 μL注入高效液相色譜儀中，測(cè)定峰面積，峰面積的RSD為0.35%。表明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.5 回收率試驗(yàn)

精密稱(chēng)取甘露醇對(duì)照品約500 mg，置50 mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品貯備液。精密稱(chēng)量本品適量(相當(dāng)于含甘露醇60 mg、 50 mg、40 mg)，分別置10 mL量瓶中，高濃度精密加入對(duì)照品貯備溶液6 mL、中濃度精密加入對(duì)照品貯備溶液5 mL、低濃度精密加入對(duì)照品貯備溶液4 mL，用水稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，即得高、中、低3個(gè)濃度供試品共9份，各精密吸取20 μL注入高效液相色譜儀中，測(cè)定峰面積，計(jì)算回收率為：98.47%、100.49%、99.72%、100.15%、99.27%、98.89%、98.84%、99.39%、98.82%，平均回收率為99.34%，RSD為0.68%，回收率結(jié)果良好。

2.3.6 檢出限與定量限的測(cè)定

精密稱(chēng)取甘露醇對(duì)照品適量，配成不同濃度樣品按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，得到甘露醇的檢出限為6.734 8 ng，定量限為20.204 3 ng。

2.4 樣品含量測(cè)定

按上述實(shí)驗(yàn)方法和色譜條件對(duì)3個(gè)批次的樣品進(jìn)行含量測(cè)定，A廠家的樣品A1平均含量為345.748 5 mg/g(裝量0.2 g)，B廠家的樣品B1，B2的含量分別為952.522 5 mg/g及954.189 6 mg/g(裝量0.3 g)。廠家B含量測(cè)定結(jié)果與處方量基本一致且批次間控制較好。雖未收集到廠家A的處方，但從結(jié)果可以看出，因處方和工藝不同，兩個(gè)廠家甘露醇的實(shí)測(cè)量有較大的差異。

3 結(jié)果與討論

1)注射用去甲斑蝥酸鈉中的輔料為氫氧化鈉和甘露醇，根據(jù)調(diào)研提示加入過(guò)量氫氧化鈉的目的是與去甲斑蝥素反應(yīng)生成目標(biāo)主藥去甲斑蝥素鈉，再加入鹽酸溶液或氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)配液罐中的pH值，所以去甲斑蝥素鈉的主要輔料是甘露醇。根據(jù)查閱文獻(xiàn)和藥典規(guī)定，建立注射用去甲斑蝥素鈉中甘露醇的檢驗(yàn)方法，目的在于對(duì)此類(lèi)藥品中的甘露醇進(jìn)行用量控制。

2)在試驗(yàn)中所檢測(cè)到的3批樣品，A1測(cè)定結(jié)果為345.748 5 mg/g，B1、B2測(cè)定結(jié)果為952.522 5 mg/g和954.189 6 mg/g，注射用去甲斑蝥酸鈉的每日最大使用劑量均為60 mg(6支)，按每日最大使用量計(jì)算按甘露醇的每日最大用量為0.4 g至2 g之間，甘露醇每次使用劑量不宜超過(guò)100 g，每天總量不宜超過(guò)300 g，2個(gè)廠家樣品中的甘露醇雖然沒(méi)有超過(guò)引起不良反應(yīng)的計(jì)量，但此產(chǎn)品的目標(biāo)使用者多為癌癥病人，其身體已經(jīng)非常虛弱，所以應(yīng)盡量減少藥物中的其他成分的不良反應(yīng)帶來(lái)的傷害。且各廠家的甘露醇用量存在較大差異，因此還是有必要對(duì)甘露醇進(jìn)行合理控制，完善注射用去甲斑蝥酸鈉的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，從而提高注射用去甲斑蝥酸鈉的整體質(zhì)量。

3)本實(shí)驗(yàn)建立了HPLC-RID方法，此方法專(zhuān)屬性強(qiáng)，準(zhǔn)確度較高，精密度及穩(wěn)定性良好，可用作注射用斑蝥酸鈉中輔料甘露醇的含量測(cè)定方法，為以后提高和完善注射用斑蝥酸鈉的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)提供參考。