晏婭蓉，高亞敏，廖 娟，周全惠，陰歡歡

（文山學(xué)院 三七醫(yī)藥學(xué)院，云南 文山 663000）

花椒（Zanthoxylum bungeanum Maxim.），其他名稱(chēng)還有大椒、檓和蜀椒等，主要化學(xué)成分有揮發(fā)油、酰胺和生物堿[1]。花椒是一種有價(jià)值的經(jīng)濟(jì)植物，我國(guó)資源豐富，是栽培、產(chǎn)量的第一大國(guó)[2]。把花椒作為一種中藥材治療疾病在我國(guó)很早就開(kāi)始了[3]。研究人員大多都是對(duì)花椒籽粒、果皮成分進(jìn)行探索[4-7]，而對(duì)花椒葉抑菌方面的研究和報(bào)道較少。

花椒種植中產(chǎn)量最大的副產(chǎn)物是花椒葉，花椒葉味辛、性熱和無(wú)毒，化學(xué)成分主要有生物堿、木脂素、酰胺和黃酮等[4]。近年很多文獻(xiàn)報(bào)道稱(chēng)，花椒葉中的黃酮具有降血脂、抗炎和抗病毒等作用[8]。而Chang 等[9]國(guó)外學(xué)者的研究報(bào)道證明花椒葉中的多酚物質(zhì)具有保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞及抗氧化作用。呂可等[10]采用花椒葉浸提液對(duì)土壤微生物進(jìn)行研究，結(jié)果顯示花椒葉浸提液讓根際的活性降低，對(duì)真菌根際活性減弱最多，細(xì)菌中等，放線(xiàn)菌最少。龔晉文等[11]對(duì)花椒葉提取物在不同條件下對(duì)3 種常見(jiàn)菌的抑菌作用進(jìn)行研究，結(jié)論為花椒葉提取物對(duì)3 種常見(jiàn)菌有明顯的抑菌效果。

引起食源性疾病的主要因素之一是食品中污染的病原細(xì)菌，在食物中常見(jiàn)的污染細(xì)菌是金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S.aureus）和大腸桿菌（Escherichia coli）[12]。在空氣、土壤、水及食具中金黃色葡萄球菌大量分布，人和動(dòng)物帶菌率極高[13]。能引起骨髓炎、心內(nèi)膜炎和壞死性筋膜炎等多種疾病[14]。我國(guó)每年的食物中毒事件大多由金黃色葡萄球菌引起[15]。最常見(jiàn)的病原細(xì)菌還有大腸桿菌，致病性是醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)學(xué)中常見(jiàn)的[16]。

本研究以花椒葉作為實(shí)驗(yàn)材料，探究不同方法提取花椒葉提取物在不同pH、溫度和濃度下對(duì)2 種常見(jiàn)菌的抑制作用，為花椒葉的科學(xué)研究和產(chǎn)品開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

花椒葉在文山學(xué)院校園內(nèi)花椒樹(shù)上采摘，品種為秦椒，保鮮儲(chǔ)存。大腸桿菌菌株ATCC25922（Escherichia coli）和金黃色葡萄球菌菌株ATCC6538（Staphylococcus aureus，S.aureus）于北京生物保藏中心購(gòu)買(mǎi)。

實(shí)驗(yàn)器材包括：DHP-9052 恒溫培養(yǎng)箱，廠(chǎng)家為上?！憧茖W(xué)儀器有限公司；Scout SE-SE602 F 天平，廠(chǎng)家為奧豪斯儀器有限公司；N-126（D）顯微鏡，廠(chǎng)家為寧波永新光學(xué)股份有限公司；LDZX-50L 高壓蒸汽滅菌鍋，廠(chǎng)家為上海申安醫(yī)療器械廠(chǎng)；TS-200B 恒溫?fù)u床，廠(chǎng)家為上海天呈實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司；TY-837打孔器，廠(chǎng)家為通用集團(tuán)國(guó)際有限公司；尼康數(shù)碼相機(jī)D7500。

試劑包括：75%酒精，級(jí)別為分析純，廠(chǎng)家為天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；蒸餾水，文山學(xué)院三七醫(yī)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供；LB 培養(yǎng)基（1 000 mL 蒸餾水），文山學(xué)院三七醫(yī)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供；10 g 胰蛋白胨，級(jí)別為生物試劑，廠(chǎng)家為北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；5 g酵母提取物，級(jí)別為實(shí)驗(yàn)試劑，廠(chǎng)家為天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；10 g NaCl，級(jí)別為分析純，廠(chǎng)家為天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；5 mol/L NaOH（氫氧化鈉），級(jí)別為分析純，廠(chǎng)家為天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；7 g 瓊脂，級(jí)別為生物試劑，廠(chǎng)家為北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 花椒葉提取物的制備

采摘新鮮花椒葉后研磨搗碎，采用過(guò)濾法、萃取法和蒸餾索式提取法制備花椒葉提取物。

1.2.2 培養(yǎng)基的制備

LB 培養(yǎng)基：根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要計(jì)算所需藥品量，分別稱(chēng)量，先將瓊脂加入蒸餾水加熱完全溶解，再根據(jù)培養(yǎng)基的成分在適量蒸餾水中加入酵母提取物、胰蛋白胨和NaCl，與已經(jīng)溶解的瓊脂混勻。用5 mol/L 的氫氧化鈉調(diào)節(jié)其pH 至7.0，用蒸餾水定容至目標(biāo)體積，定容后分裝，將適量培養(yǎng)基分別裝入250 mL 錐形瓶中，用棉塞和牛皮紙封裝，在101.2 kPa 的高壓下蒸汽滅菌30 min，培養(yǎng)皿亦進(jìn)行高壓蒸汽滅菌處理。

1.2.3 活化菌種與制備菌懸液

活化大腸桿菌和金黃色葡萄球菌，檢查是否有雜菌污染，在超凈工作臺(tái)中涂布，在培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)3 代，選取菌種活力最佳的菌，將活化的供試菌制備成菌懸液。

1.2.4 制備濾紙片與菌液涂布

使用打孔器打出圓形濾紙片，進(jìn)行滅菌，將濾紙片浸于花椒葉提取物中備用，接著進(jìn)行菌液涂布，將菌液加到培養(yǎng)基中，用涂布棒涂布均勻，置于恒溫箱一段時(shí)間后取出備用。

1.2.5 抑菌實(shí)驗(yàn)

在超凈工作臺(tái)上，先用不同方法制備的花椒葉提取物進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，把培養(yǎng)皿放入恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)觀(guān)察，查看抑菌圈的大小并測(cè)量其直徑，分別用抑制作用最好的方法獲得花椒葉提取物，在不同條件（溫度、濃度和pH）下觀(guān)察花椒葉提取物對(duì)2 種菌的抑制作用。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同方法獲得的花椒葉提取物對(duì)2 種菌的抑制作用

由表1 可知，不同方法提取花椒葉，蒸餾索式提取法得到的花椒葉提取物對(duì)金黃色葡萄球菌抑制作用最強(qiáng)，其次是過(guò)濾法，最后是萃取法。萃取法得到的花椒葉提取物對(duì)大腸桿菌抑制作用最好，其次是蒸餾索式提取法，最后是過(guò)濾法。用不同方法提取的花椒葉對(duì)2 種菌的抑制作用不同，初步分析可能是菌種的類(lèi)別差異所致，金黃色葡萄球菌是革蘭氏陽(yáng)性菌，大腸桿菌是革蘭氏陰性菌，2 者的形態(tài)、構(gòu)造和生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)條件不同，使得2 種菌對(duì)不同方法獲得的花椒提取物抑菌成分呈現(xiàn)明顯差別[17]。

表1 不同方法獲得的花椒葉提取物對(duì)2 種菌的抑制作用

2.2 花椒葉提取物在不同濃度下對(duì)2 種菌的抑制作用

由表2 可知，當(dāng)花椒葉提取物濃度（濃度用體積百分比表示）為0%時(shí)，對(duì)2 種菌基本無(wú)抑制效果，當(dāng)花椒葉提取物濃度為50%時(shí)，對(duì)2 種菌均有較為明顯的抑制效果，當(dāng)花椒葉提取物濃度為100%時(shí)，對(duì)2 種菌抑制作用最佳。隨著花椒提取物濃度的提升對(duì)2 種菌的抑制作用也隨之增強(qiáng)，可能原因是隨著花椒提取物濃度增加，起抑制作用的有效成分隨之增加，在其他條件一致，花椒提取物濃度增加的過(guò)程中，2 種菌的抑菌圈呈現(xiàn)逐漸增大的趨勢(shì)。此外，在花椒提取物濃度相同的條件下，對(duì)2 種菌的抑制程度出現(xiàn)細(xì)小差異，可能原因是革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌在菌體結(jié)構(gòu)、營(yíng)養(yǎng)方式等方面的不同，引起其對(duì)抑菌有效成分反應(yīng)不同[17]。

表2 花椒葉提取物在不同濃度下對(duì)2 種菌的抑制作用

2.3 花椒葉提取物在不同pH 下對(duì)2 種菌的抑制作用

由表3 可知，當(dāng)pH 為7 或大于7 時(shí)，花椒葉提取物對(duì)2 種菌的抑制作用明顯，當(dāng)pH 小于7 時(shí)，花椒葉提取物對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌基本無(wú)抑制作用，且對(duì)2 種菌的抑制作用差異不顯著?？赡茉蚴莗H 對(duì)培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的離子化程度起作用，進(jìn)一步導(dǎo)致菌體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，代謝反應(yīng)中酶的活性不同，從而使得2 種菌在不同pH 條件下對(duì)花椒葉提取物抑菌成分敏感程度呈現(xiàn)差異[17]。

表3 花椒葉提取物在不同pH 下對(duì)2 種菌的抑制作用

2.4 花椒葉提取物在不同溫度下對(duì)2 種菌的抑制作用

由表4 可知，溫度為20 ℃時(shí)，花椒葉提取物對(duì)2種菌的抑制作用明顯，溫度為15 ℃和25 ℃時(shí)，花椒葉提取物對(duì)2 種菌的抑制作用較明顯，且在3 個(gè)溫度下對(duì)2 種菌的抑制作用差別不顯著。初步分析導(dǎo)致不同的溫度對(duì)2 種菌的抑制作用不同，可能原因是不同的溫度下菌體的蛋白酶活性不同，同時(shí)溫度還影響菌體內(nèi)生物大分子的物理狀態(tài)，最終使得2 種菌對(duì)花椒提取物抑菌有效成分呈現(xiàn)不同的反應(yīng)，但溫度對(duì)2 種菌的抑制作用影響較小[17]。

表4 花椒葉提取物在不同溫度下對(duì)2 種菌的抑制作用

3 結(jié)論

本研究采用不同提取方法獲得花椒葉提取物，在不同條件下對(duì)2 種菌的抑制作用進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：采用蒸餾索式提取法獲得的花椒葉提取物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用最佳，采用萃取法獲得的花椒葉提取物對(duì)大腸桿菌的抑制作用最佳?；ń啡~提取物對(duì)2 種菌都有一定的抑制作用，對(duì)2 種菌來(lái)說(shuō)，提取物濃度越高抑制作用越明顯；溫度影響花椒提取物對(duì)2 種菌的抑制作用，但是影響較?。淮送?，pH 也影響花椒提取物對(duì)2 種菌的抑制作用，中性（pH=7.0）至偏堿性（pH=7.0～10.0）條件下，花椒提取物對(duì)2 種功的抑制作用明顯，而在酸性（pH=4.0～6.0）條件下幾乎無(wú)抑制作用。

通過(guò)實(shí)驗(yàn)獲得了因提取方法不同，pH、溫度和花椒葉提取物濃度不同，對(duì)2 種菌的抑菌作用差異的相應(yīng)數(shù)據(jù)。以期將花椒葉這一副產(chǎn)物變廢為寶，為新的抑菌藥品、天然防腐劑的研發(fā)提供理論參考，來(lái)促進(jìn)花椒葉產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，使花椒這一經(jīng)濟(jì)作物得到全面利用，擴(kuò)大花椒資源的經(jīng)濟(jì)效益[18]。