逯璐，蘇興海，馬世寶，張琳

(1.山東管理學院新興業(yè)態(tài)發(fā)展研究所，山東 濟南 250357；2.招遠市動物疫病預防控制中心，山東 招遠 265400；3.德州市陵城區(qū)畜牧獸醫(yī)服務中心，山東 德州 253599；4.山東省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所/山東省畜禽疫病防治與繁育重點實驗室，山東 濟南 250100)

鴨坦布蘇病毒(Duck Tembusu virus，DTMUV)是引起蛋鴨產(chǎn)蛋率驟降、肉鴨和育成鴨死亡的主要病原之一，給養(yǎng)鴨業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失[1，2]。以該病毒為病原的鴨坦布蘇病毒病于2010年流行于我國東南沿海，近年來已成為水禽養(yǎng)殖業(yè)常見且頻繁流行的疫病之一，也是必須監(jiān)測和防控的疫病之一[3]。目前對于該病的預防主要依靠商品化疫苗，但疫病仍頻繁出現(xiàn)，且呈地方性流行趨勢，表明DTMUV已在不同區(qū)域定殖并在不同選擇壓力下突變產(chǎn)生地方流行株[4]。鑒于病毒突變的加速和相應疫苗研發(fā)的滯后，對DTMUV的感染與致病機制進行深入研究，從中挖掘更為有效的抗病毒策略成為該病毒的研究重點。

緊密連接(tight junctions，TJ)是一種膜內(nèi)多蛋白復合體，廣泛存在于上皮細胞和內(nèi)皮細胞間，是封閉細胞間隙維持上皮屏障功能、調(diào)控細胞通透性控制內(nèi)外物質(zhì)進出的重要成分[5，6]。緊密連接蛋白主要由咬合蛋白(occludin)、閉合蛋白(claudins)、閉合小環(huán)蛋白(zonula occludens，ZOs)和連接黏附分子(junctional adhesion molecules，JAMs)組成，它們與細胞骨架蛋白將相鄰細胞連接起來構(gòu)成上皮屏障，以阻擋病原微生物的入侵，維持生理環(huán)境的穩(wěn)定[7]。但TJ蛋白也能夠被病毒“劫持”，成為感染細胞的“利器”。已有多篇報道顯示，病毒能夠使用TJ蛋白作為細胞受體感染靶細胞:occludin、claudin－1是丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HCV)入 侵 細 胞 的 共 受體[8，9]，而claudin－6和claudin－9不僅是該病毒的共受體，而且能夠介導病毒在細胞間的傳播[10，11]。claudin－1是登革熱病毒(Dengue virus，DENV)進入細胞的關鍵分子[12]；occludin是西尼羅河病毒(West Nile virus，WNV)突破血腦屏障引起神經(jīng)癥狀的關鍵蛋白[13]。此外，claudin家族蛋白還是日本乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)[14]、人免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus，HIV)[15，16]等病毒感染與擴散的重要分子。

DTMUV所在的黃病毒屬病毒具有高度相似的結(jié)構(gòu)組成，入侵細胞也采用類似的策略[17，18]，但功能性受體至今未能明確。HCV為黃病毒科丙肝病毒屬病毒，其細胞受體已明確，而與DTMUV進化關系最為密切的DENV、WNV、JEV同為黃病毒屬病毒，但功能性受體始終未能鑒定出來。occludin或claudin－1在上述病毒侵入細胞與擴散環(huán)節(jié)均起到了重要作用，但在DTMUV感染細胞過程中扮演怎樣的角色尚不清楚。本試驗利用DTMUV感染非洲綠猴腎(vero)細胞，采用熒光定量方法對occludin和claudin－1基因mRNA的表達量進行檢測和比較，以有助于明確兩蛋白分子在介導DTMUV入侵細胞中的作用，為后續(xù)功能受體的篩選、入侵機制以及抗病毒制劑的研究與開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

DTMUV(TCID50為10－6.5/0.1 mL)由山東省畜禽疫病防治與繁育重點實驗室分離鑒定并保存，非洲綠猴腎(vero)細胞由本實驗室保存。微量總RNA(病毒/細胞)提取試劑盒購自北京百邁客生物科技有限公司。One Step TB Green PrimeScript PLUS RT－PCR Kit(Perfect Real Time)、TB GreenPremix Ex Taq(Tli RNaseH Plus)熒光定量PCR試劑盒、M－MLV反轉(zhuǎn)錄酶購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗分組 試驗開展時間為2021年6—12月。分別設置試驗組和對照組，每組5瓶(25 cm2方瓶)細胞，置于37℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。待24 h細胞長成單層后，試驗組加入100TCID50的病毒液1 mL，置于細胞培養(yǎng)箱中孵育1 h，期間每30 min輕晃混勻一次，對照組以營養(yǎng)液替代病毒液進行相同操作。棄去細胞瓶中的液體，并用預冷的PBS輕輕洗2次，去除未吸附病毒。隨后在每個細胞瓶中加入9 mL含2%血清的MEM培養(yǎng)基，繼續(xù)進行培養(yǎng)，分別于12、24、48、72 h收集試驗組和對照組細胞及其上清，進行病毒載量和緊密連接蛋白相關基因表達量的熒光定量檢測。

1.2.2 熒光定量PCR引物的設計與合成 病毒載量的測定采用絕對熒光定量PCR方法，緊密連接蛋白相關基因表達量的檢測使用相對定量的方式?；驍U增引物經(jīng)oligo 6.0設計，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，序列見表1。

表1 熒光定量PCR引物

1.2.3 RNA的提取和cDNA的合成 采用微量總RNA(病毒/細胞)提取試劑盒分別提取細胞與培養(yǎng)液上清總RNA，RNA樣品經(jīng)DNaseⅠ消化后，使用隨機引物和M－MLV反轉(zhuǎn)錄酶進行cDNA鏈的合成。RNA與cDNA產(chǎn)物置于－80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 熒光定量PCR 測定DTMUV含量的絕對熒光定量PCR體系參照李海燕等[19]的方法。occludin、claudin－1和β－actin的引物首先進行特異性和有效性驗證，表達量的檢測反應總體系(20 μL):2×SYBRPremix Ex TaqⅡ10 μL，cDNA模板1 μL，上下游引物各1 μL(10 μmol/L)，雙蒸水補足20 μL。反應條件:95℃1 min；95℃15 s，63℃25 s，72℃30 s，共40個循環(huán)，每個循環(huán)收集熒光信號；95℃5 s，60℃1 min，進行溶解曲線分析。所有樣品的檢測均設置3個重復。為了證實擴增序列的準確性，將PCR產(chǎn)物純化后連接pMD18－T，并進行測序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所有基因檢測均重復3次，取平均值。病毒含量根據(jù)標準曲線計算獲得，兩緊密連接基因相對表達量用2－△△Ct法計算，β－actin為內(nèi)參，結(jié)果以變化倍數(shù)進行表示。應用GraphPad Prism 5的student’st－test分析原始數(shù)據(jù)，并進行差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 occludin和claudin－1熒光定量引物的驗證

利用反轉(zhuǎn)錄cDNA進行新設計熒光定量引物的驗證。結(jié)果如圖1所示，引物可以有效擴增目的基因，溶解曲線單一，表明引物的有效性和特異性良好，可以滿足定量檢測occludin、claudin－1和β－actinmRNA的要求。同時，回收擴增片段經(jīng)測序和比對證實了片段的準確性。

圖1 occludin(A)、claudin－1(B)和β－actin(C)熒光定量PCR的擴增及溶解曲線

2.2 vero細胞中的病毒含量

以100TCID50的DTMUV感染vero細胞，60 h左右細胞開始出現(xiàn)病變，而對照細胞正常。對感染后細胞上清中的病毒含量進行檢測，發(fā)現(xiàn)病毒可在細胞中有效復制，并在48 h達到峰值，之后開始緩慢下降，而對照組始終未檢測到病毒(圖2)。

圖2 細胞中的病毒含量

2.3 occludin基因的表達量

與對照組相比，occludin基因的表達量先上調(diào)后下調(diào)，12 h為表達峰值，而后逐漸降低，72 h僅為對照組的59%(圖3)。

圖3 occludin基因的表達量

2.4 claudin－1基因的表達量

與對照組相比，claudin－1基因的表達量也呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(圖4)。在感染前期，claudin－1claudin－1的表達量上調(diào)，至24 h達到峰值，而后開始下降，至72 h表達量下調(diào)，為對照組的76%。

圖4 claudin－1基因的表達量

3 討論與結(jié)論

病毒侵入宿主細胞是整個復制周期的首要環(huán)節(jié)，而受體是介導病毒吸附、內(nèi)吞以及膜融合等侵入過程的關鍵宿主因子[20，21]，它決定了易感宿主的范圍、組織嗜性和致病性。所以，對受體的研究成為了解病毒入侵機制以及開發(fā)抗病毒制劑的突破口。

DTMUV具有較為廣泛的宿主范圍，除了感染鴨、鵝等水禽和雞、麻雀等其他禽類外[22，23]，也可以感染哺乳動物[24]，亦有感染人類的報道，但并不表現(xiàn)出致病性[25]。病毒還具有廣泛的組織嗜性，除肝臟、脾臟、心臟等多臟器會發(fā)生較為明顯的病變外，還會出現(xiàn)嚴重的生殖系統(tǒng)病癥和典型的神經(jīng)癥狀[26，27]。在病毒的體外培養(yǎng)時，DTMUV在多種來源的細胞和禽胚均可增殖[28]。這些現(xiàn)象表明，DTMUV的細胞受體應該是多物種、多組織器官普遍存在且功能高度保守的蛋白分子。

前期通過細胞膜蛋白質(zhì)組的測定，發(fā)現(xiàn)了多種在DTMUV感染后表達量發(fā)生明顯變化的蛋白分子(結(jié)果另文發(fā)表)，occludin、claudin－1就是其中的兩個。兩者是緊密連接蛋白重要的組成部分，廣泛分布于各組織中，但含量存在差異，在免疫細胞豐富的組織中含量較少，而在免疫細胞較少的組織中含量較高，體現(xiàn)了它們在組織防御功能中的補償作用[6]。特別要指出的是，在正常情況下，緊密連接蛋白還是構(gòu)成血腦屏障的重要組分[29]。DTMUV感染病例多有神經(jīng)癥狀，病毒是如何突破血腦屏障的，一直未見報道。相關研究表明，在腦病發(fā)生時，occludin的表達量會發(fā)生顯著變化，已成為診斷腦病的重要生物指標[29]。occludin是否也被DTMUV作為細胞受體利用或者起到利于傳播的作用以突破血腦屏障，在后續(xù)研究中需要進行深入探討。

DENV－2感染人真皮微血管內(nèi)皮細胞后會激活整合素β3的上調(diào)表達，從而利于病毒的入胞[30]；感染的小腸上皮細胞和vero細胞中，隨著PEDV的復制，occludinmRNA的表達量顯著上調(diào)，兩者的結(jié)合及內(nèi)化是病毒進入細胞的關鍵[31]，類似的結(jié)果也出現(xiàn)在PRRSV與感染細胞(Mark145)的claudin－4相互作用中[32]。在本試驗中，DTMUV感染后的12～48 h，病毒含量明顯上升，而occludin和claudin－1也均為上調(diào)表達，表明病毒的感染激活了兩個基因的表達，提示在病毒感染細胞的過程中可能以受體或關鍵因子的身份參與了病毒入侵細胞的過程。而隨著病毒的進一步增殖，72 h細胞已出現(xiàn)明顯病變，occludin和claudin－1mRNA的表達量變?yōu)橄抡{(diào)表達，這應該與細胞發(fā)生損傷導致通透性改變以及隨病毒內(nèi)化的緊密連接蛋白被降解有關。至于兩分子與病毒粒子的結(jié)合機制及其在感染中的作用也是我們下一步的研究重點。