房文文，王海鳳，郭濤，姜艷芳，薛芳，張煥霞，陳峰，張士永

(山東省農(nóng)業(yè)科學院濕地農(nóng)業(yè)與生態(tài)研究所/山東省水稻工程技術研究中心，山東 濟南 250100)

水稻為世界上一半以上的人口提供主糧[1]，稻瘟病是水稻生產(chǎn)上最重要的病害[2]。由稻瘟病菌(Pyricularia oryzae)引發(fā)的稻瘟病在流行年份可使水稻減產(chǎn)40%～50%[3]。山東省自2013年以來，稻區(qū)多次發(fā)生稻瘟病，損失較大[4，5]。目前選育和利用抗瘟品種是防控稻瘟病最經(jīng)濟有效的措施[6]。由于田間稻瘟病菌小種類型多樣且易變異，導致一些抗性品種連續(xù)種植3～5年后抗性“喪失”，田間表現(xiàn)為感病[7]。

目前已鑒定的水稻抗稻瘟病基因有100多個，其中有35個已被克隆[8]。主效抗瘟基因Pita位于水稻第12條染色體的近著絲粒區(qū)域，Jia等[9]開發(fā)的YL155/YL87和YL183/YL87可用于Pita基因的鑒定?？?、感水稻的Pita基因只有一個堿基差異，抗病基因為G，感病基因為T，其編碼產(chǎn)物僅有一個氨基酸的差異，即第918位氨基酸由丙氨酸變異為絲氨酸[10]。Pizt基因位于水稻第6條染色體短臂端的Pi2/9基因簇內(nèi)，含有等位基因Pi2、Pi9、Piz、Pigm、Pi40、Pi50，是廣譜抗性基因；其中Pi2、Pi9、Pizt、Pigm已經(jīng)被克隆[11－13]，根據(jù)Pi2與Pizt的編碼產(chǎn)物在3個LRRs區(qū)域有8個氨基酸的差異[14]，開發(fā)出能夠區(qū)分各基因的特異SNP標記[15]。Pik基因位于水稻第11條染色體長臂近末端區(qū)域，Pik座位上包括5個 等 位 基 因，分 別 為Pik、Pikh、Pikm、Pikp、Piks[16，17]。Pik1和Pik2兩個基因的組合是表達Pik抗性所必需的，郭震華[18]、Luo[19]等開發(fā)了與Pik緊密連鎖的分子標記Pik2－C/T。

目前，DNA分子標記檢測是抗瘟基因鑒定的主要方法，包括SSR、InDel和SNP等分子標記，已經(jīng)廣泛應用于水稻育種研究。抗瘟基因的檢測方法主要有特異分子標記的檢測及已克隆基因測序分析[20]。高分辨率熔解曲線(high resolution melting，HRM)技術是一種新興的基因分型方法，能夠區(qū)分SNP、SSR及InDel等不同變異[21]，促進了抗性基因在水稻育種中的應用。此技術省略了凝膠電泳，減少了污染；PCR擴增后，無需其他步驟，僅需8～10 min即可讀取96個樣品數(shù)據(jù)，真正實現(xiàn)了快速高通量檢測。HRM技術具有高通量、準確性高、重復性好等優(yōu)點，已被廣泛應用于分子標記輔助育種[22]。本研究基于HRM技術，利用3個已知稻瘟病抗性基因的特異分子標記對水稻品種是否攜帶抗性基因進行檢測，以期為培育抗稻瘟品種及抗稻瘟品種布局奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

水稻品種及優(yōu)異種質(zhì)資源共64份；感病對照品種為麗江新團黑谷(LTH)。

試劑及儀器:十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)，購于生工生物工程(上海)股份有限公司；PCR試劑，北京全式金生物技術(TransGen Biotech)有限公司；EvaGreen qPCR核酸染料，美國Biotium公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。Nikon D90相機，尼康光學儀器(中國)有限公司；BCD－290W型立式冰箱，青島海爾股份有限公司；Eppendorf PCR儀，艾本德中國有限公司；羅氏LightCycler96實時熒光定量PCR儀，Roche公司。泥炭營養(yǎng)土，成分為挪威草炭、泥炭、珍珠巖及蛭石，壽光嘉恒基質(zhì)加工廠；尿素，純度≥46%，山東科達化肥有限公司。

1.2 序列分析

根據(jù)基因序列設計抗瘟基因引物，詳細信息見表1，引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 擴增Pita、Pizt和Pik2基因的引物序列

1.3 DNA提取、PCR擴增與HRM檢測

水稻DNA提取:采用CTAB法提取水稻品種(系)的基因組DNA。

Pita、Pizt基因采用兩步法進行PCR擴增。PCR反應體系(10 μL):2×EasyTaq?PCR Super-Mix 5 μL，基因組DNA 3 μL，正反向引物各0.2 μL(0.1 mmol/L)，20×Evagreen 0.125 μL，ddH2O 1.475 μL。PCR擴增程序:94℃預變性3 min；94℃變性10 s，57℃退火30 s，共40個循環(huán)。

Pik2基因采用多重巢式PCR擴增，包括兩輪擴增反應。第一輪PCR反應體系(10 μL):2×EasyTaq?PCR SuperMix 5 μL，基因組DNA 3 μL，正反向引物各0.3 μL(0.1 mmol/L)，ddH2O 1.4 μL。PCR擴增程序:94℃預變性5 min；94℃變性20 s，57℃退火20 s，72℃延伸10 s，共40個循環(huán)；最后72℃延伸10 s。擴增產(chǎn)物加200 μL ddH2O后取0.5 μL、2×EasyTaq?PCR SuperMix 4 μL、正反向引物各0.3 μL(0.1 mmol/L)、20×Evagreen 0.125 μL、ddH2O 4.775 μL用于第二輪PCR擴增。PCR擴增程序:94℃預變性2 min；94℃變性20 s，59℃退火20 s，72℃延伸10 s，共25個循環(huán)；最后72℃延伸10 s。

3個基因擴增完成后，熔解曲線分析程序為:95℃變性15 s；60℃退火15 s；以0.07℃/s的速率升溫，10次/℃采集熒光信號，至90℃保持1 s，采用軟件Light Cycler 96進行熔解曲線分析。

2 結果與分析

2.1 Pita基因在供試水稻品種(系)中的分布情況

圖1為Pita基因檢測結果，藍色曲線為感性基因pita，其堿基為T；紅色曲線為抗性基因Pita，其堿基為G。20份水稻品種中含有純合的抗性基因Pita，占供試品種的31.25 %；分別為15觀57、矮豐80、20觀83、19觀6、潤農(nóng)11、金粳818、津原89、泗稻17、錦稻109、鹽豐47、華粳113、揚粳3012－40、華粳9050、鹽糯1716、天隆4號、揚農(nóng)粳3142、香優(yōu)108、鹽粳252、緬甸稻、通化727。其余的44份為純合的pita。

2.2 Pizt基因在供試水稻品種(系)中的分布情況

圖2 為Pizt基因檢測結果，紅色曲線為抗性基因Pizt，藍色曲線不含有Pizt基因(為pizt或其他等位基因)。14份水稻品種中含有純合的抗性基因Pizt，占供試品種的21.88 %；分別為20Ta2－4、18T156、20觀56、矮豐80、19觀6、陽光900、臨稻26、臨稻29、潤農(nóng)11、蘇秀867、寧香粳9號、華粳113、圣稻735、揚粳3012－40。其余的50份不含有Pizt基因(為pizt或其他等位基因)。

2.3 Pik2基因在供試水稻品種(系)中的分布情況

圖3 為Pik2基因檢測結果，藍色曲線為感性基因Pik2，其堿基為T；紅色曲線為抗性基因Pik2，其堿基為G。27份水稻品種中含有純合的抗性基因Pik2，占供試品種的42.19%；分別為18RS15、20觀56、20觀83、19鑒21、臨稻10號、臨稻16號、潤農(nóng)11、潤農(nóng)303、金粳818、津原89、新豐2號、光燦1號、新科稻21、南粳9108、泗稻17、連粳13、寧香粳9號、圣稻735、華粳0098、華粳9050、鹽糯138、揚農(nóng)粳3142、香優(yōu)108、緬甸稻、繁70、通化727、許日本稻。其余37份為純合的pik2?？梢园l(fā)現(xiàn)，抗瘟基因Pik2在山東省分布較為廣泛。

圖3 Pik2基因的HRM分型

2.4 3個抗瘟基因在供試品種(系)中的分布

由表2可知，寧香粳9號、圣稻735、20觀56共3份種質(zhì)含有Pizt、Pik2兩基因，占供試品種的4.69%；矮豐80、19觀6、華粳113、揚粳3012－40共4份種質(zhì)含有Pita、Pizt兩基因，占供試品種的6.25%；20觀83、金粳818、泗稻17、津原89、華粳9050、揚農(nóng)粳3142、香優(yōu)108、緬甸稻、通化727共9份種質(zhì)含有Pita、Pik2兩基因，占供試品種的14.06%；潤農(nóng)11同時含有Pita、Pizt、Pik2三個基因。

表2 3個抗瘟基因的基因型分布檢測結果

3 討論與結論

抗稻瘟病育種一直是研究的熱點，目前分子標記輔助育種多采用常規(guī)PCR手段，需要通過凝膠電泳步驟，效率較低。本研究采用HRM技術鑒定了3個主效抗瘟基因在山東省水稻品種及種質(zhì)資源中的分布情況，能夠省略凝膠電泳等步驟，省時省力，高效準確，同時減少污染。本研究發(fā)現(xiàn)在64份材料中，含Pik2的品種有27個，占供試品種的42.19%；含Pita的品種有20個，占供試品種的31.25%；含Pizt的品種有14個，占供試品種的21.88%。含Pita和Pik2兩基因的品種有9個，含Pita和Pizt兩基因的品種有4個，含Pizt和Pik2兩基因的品種有3個，同時含有三個基因的品種有1個。由此可見，抗瘟基因Pik2在山東省分布較為廣泛。研究表明，不同地區(qū)水稻品種抗瘟基因頻率存在差異，如郭震華等[18]發(fā)現(xiàn)抗瘟基因Pik2在黑龍江省分布也較為廣泛，為32.9%，而楊林浩等[20]發(fā)現(xiàn)Pik在吉林省68個主栽品種中出現(xiàn)頻率為13.2%。

本研究所檢測的抗瘟基因偏少，下一步需基于已克隆的抗瘟序列信息及成功開發(fā)出的特異性分子標記，開發(fā)出更多抗瘟基因的SNP標記，進行多個基因檢測及抗瘟育種輔助選擇。另外，本研究僅采用分子標記檢測方法鑒定了抗瘟基因，下一步擬結合室內(nèi)人工接種方法，將抗瘟基因組合與抗病性評價進行對應，對于指導培育抗病品種具有重要意義。