冷喆 孫嫻莉 林慧 常曉彤 宋黃貝 黃煜

[摘要] 目的 探討E-鈣黏蛋白（E-CAD）、細(xì)胞角蛋白7（CK7）和胎盤(pán)特異性蛋白8（PLAC8）在不明原因稽留流產(chǎn)絨毛組織中的表達(dá)及其可能的意義。

方法 選取早孕期不明原因稽留流產(chǎn)病人20例（稽留流產(chǎn)組）、非計(jì)劃妊娠行人工流產(chǎn)的正常早孕女性20例（正常妊娠組）作為研究對(duì)象，采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）檢測(cè)絨毛組織中E-CAD、CK7及PLAC8的mRNA表達(dá)，Western Blot及免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)絨毛組織中E-CAD、CK7及PLAC8的蛋白表達(dá)。

結(jié)果 稽留流產(chǎn)組絨毛組織中E-CAD、CK7的mRNA和蛋白表達(dá)均明顯高于正常妊娠組（t=3.995～12.200，P<0.01），兩組PLAC8的mRNA和蛋白表達(dá)差異無(wú)顯著性（P>0.05）。E-CAD以及CK7的陽(yáng)性染色主要定位于滋養(yǎng)層細(xì)胞的細(xì)胞膜，PLAC8的陽(yáng)性染色主要定位于合體滋養(yǎng)層細(xì)胞的細(xì)胞核，稽留流產(chǎn)組絨毛組織中E-CAD、CK7的平均光密度值（AOD）明顯高于正常妊娠組（t=3.823、3.889，P<0.05），兩組PLAC8的AOD差異無(wú)顯著性（P>0.05）。

結(jié)論 絨毛組織E-CAD、CK7表達(dá)升高可能與不明原因稽留流產(chǎn)的發(fā)生有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 鈣黏蛋白；角蛋白7；胎盤(pán)特異性蛋白8；流產(chǎn)，稽留

[中圖分類(lèi)號(hào)] R714.21

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A

[文章編號(hào)] 2096-5532（2022）05-0726-04doi：10.11712/jms.2096-5532.2022.58.162

[開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）]

[網(wǎng)絡(luò)出版] https：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20221021.1422.009.html;2022-10-24 09：19：58

EXPRESSION OF E-CAD/CK7/PLAC8 IN CHORION TISSUE OF UNEXPLAINED MISSED ABORTION

LENG Zhe， SUN Xianli， LIN Hui， CHANG Xiaotong， SONG Huangbei， HUANG Yu

（Department of Gynaecology， Qingdao Women and Children’s Hospital Affiliated to Qingdao University， Qingdao 266000， China）

[ABSTRACT] Objective To investigate the expression of E-cadherin （E-CAD）， cytokeratin 7 （CK7）， and placental-specific protein 8 （PLAC8） in chorion tissue of unexplained missed abortion and their possible significance.

Methods A total of 20 patients with unexplained missed abortion in early pregnancy were enrolled as missed abortion group， and 20 women with normal early pregnancy who underwent induced abortion due to unplanned pregnancy were enrolled as normal pregnancy group. Quantitative real-time PCR was used to measure the mRNA expression of E-CAD， CK7， and PLAC8 in chorion tissue， and Western Blot and immunohistochemistry were used to measure the protein expression of E-CAD， CK7， and PLAC8 in chorion tissue.

Results Compared with the normal pregnancy group， the missed abortion group had significantly higher mRNA and protein expression le-vels of E-CAD and CK7 in chorion tissue （t=12.200，9.968;P<0.01）， and there was no significant difference in the mRNA and protein expression levels of PLAC8 between the two groups （t=8.447，P>0.05）. The positive staining of E-CAD and CK7 was mainly localized in the cell membrane of trophoblast cells， and the positive staining of PLAC8 was mainly localized in the nucleus of syncytiotrophoblast cells. Compared with the normal pregnancy group， the missed abortion group had a significantly higher average optical density （AOD） of E-CAD and CK7 in chorion tissue （t=3.823，3.889;P<0.05）， and there was no significant difference in the AOD of PLAC8 between the two groups （P>0.05）.

Conclusion Increases in the expression of E-CAD and CK7 in chorion tissue may be associated with the occurrence of unexplained missed abortion.

[KEY WORDS] cadherin; keratin-7; placental specific-8; abortion， missed

稽留流產(chǎn)表現(xiàn)為胚胎或者胎兒的發(fā)育停滯。目前約有50%的稽留流產(chǎn)原因不明，尋找對(duì)妊娠結(jié)局具有預(yù)測(cè)價(jià)值的生物學(xué)指標(biāo)具有重要意義。E-鈣黏蛋白（E-CAD）是一種腫瘤抑制蛋白，在調(diào)節(jié)多種生理功能方面發(fā)揮著重要的作用，而這些功能的失調(diào)可能導(dǎo)致癌癥的發(fā)生。細(xì)胞角蛋白7（CK7）是一種低分子量的細(xì)胞角蛋白，其主要功能是維持上皮組織的完整性和連續(xù)性。 胎盤(pán)特異性蛋白8（PLAC8）是一種分子量為16 000的蛋白質(zhì)，又稱(chēng)為Onzin，從兩棲動(dòng)物到人類(lèi)都高度保守。本研究初步冷喆，等. 不明原因稽留流產(chǎn)絨毛組織E-CAD/CK7/PLAC8表達(dá)探討E-CAD、CK7以及PLAC8在稽留流產(chǎn)中作為生物學(xué)指標(biāo)的潛能。

1 材料與方法

1.1 組織樣本的收集

2020年11月—2021年1月，選取我院婦科就診的早孕稽留流產(chǎn)病人（稽留流產(chǎn)組）及非計(jì)劃妊娠行人工流產(chǎn)的正常早孕女性（正常妊娠組）各20例，年齡18～40歲。根據(jù)《婦產(chǎn)科學(xué)》第9版的標(biāo)準(zhǔn)診斷正常早孕與稽留流產(chǎn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：夫妻雙方染色體異常，內(nèi)分泌紊亂，生殖系統(tǒng)畸形，生殖道感染，免疫功能障礙，血栓前狀態(tài)，嚴(yán)重的慢性疾病，接受過(guò)絨毛膜促性腺激素（HCG）保胎治療。絨毛組織從子宮取出后立刻用無(wú)菌生理鹽水沖洗，每份標(biāo)本分成3部分，一部分置于RNA穩(wěn)定保存液中，4 ℃保存；一部分置于-80 ℃冷凍保存；另一部分置于40 g/L多聚甲醛中，4 ℃固定。兩組年齡、妊娠時(shí)間和妊娠次數(shù)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象均簽署知情同意書(shū)。

1.2 RNA的提取以及實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）

使用MolPure Cell/Tissue Total RNA Kit（翌圣生物科技（上海）股份有限公司產(chǎn)品）提取絨毛組織總RNA，應(yīng)用紫外線(xiàn)分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度及純度，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Roche，巴塞爾，瑞士）將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。根據(jù)SYBR Green qPCR Mix（翌圣生物科技（上海）股份有限公司產(chǎn)品）說(shuō)明書(shū)的方法行qRT-PCR，PCR引物及其序列見(jiàn)表1。應(yīng)用2方法計(jì)算E-CAD、CK7以及PLAC8的mRNA表達(dá)，以GAPDH作為管家基因進(jìn)行歸一化處理。結(jié)果以目的基因與GAPDH的比值表示。

1.3 Western Blot檢測(cè)

應(yīng)用含有10 g/L蛋白酶以及磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液（上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司）從絨毛組織中提取總蛋白，使用BCA試劑盒（上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司）測(cè)定蛋白濃度，總蛋白經(jīng)125 g/L SDS-PAGE凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，加入50 g/L脫脂奶粉室溫封閉2 h后，加入一抗，4 ℃孵育8～10 h，TBST洗滌，加入相應(yīng)二抗室溫孵育2 h，洗滌，用ECL試劑盒（上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司）檢測(cè)蛋白表達(dá)，以β-Actin作為內(nèi)參對(duì)照。

1.4 免疫組化染色

將絨毛組織加入40 g/L多聚甲醛4 ℃固定過(guò)夜，石蠟包埋，切5 μm厚度的切片，使用二甲苯及梯度濃度的乙醇（體積分?jǐn)?shù)1.0～0.7）進(jìn)行脫蠟及復(fù)水，然后將切片浸入0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液中，微波爐中進(jìn)行抗原修復(fù)，采用免疫組化SP法進(jìn)行染色，操作過(guò)程嚴(yán)格按照通用SP試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。使用Olympus DP80顯微鏡獲取切片圖像， Image J軟件分析圖像的累積光密度值及陽(yáng)性染色面積，計(jì)算平均光密度值（AOD，累積光密度值/陽(yáng)性染色面積）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用Graphpad Prism 9軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料結(jié)果以±s表示，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本均數(shù)比較的t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組絨毛組織中E-CAD、CK7以及PLCA8的mRNA表達(dá)比較

qRT-PCR檢測(cè)顯示，稽留流產(chǎn)組絨毛組織中E-CAD、CK7的mRNA表達(dá)明顯高于正常妊娠組（t=12.200、9.968，P<0.01），而兩組PLAC8的mRNA水平差異無(wú)顯著性（P>0.05）。見(jiàn)表2。

2.2 兩組絨毛組織中E-CAD、CK7以及PLAC8蛋白表達(dá)比較

Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示，稽留流產(chǎn)組絨毛組織中E-CAD、CK7蛋白表達(dá)水平明顯高于正常妊娠組（t=3.995、7.603，P<0.01），而兩組PLAC8的蛋白表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)圖1和表2。

2.3 兩組絨毛組織中E-CAD、CK7以及PLAC8的蛋白表達(dá)和定位比較

免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示，E-CAD以及CK7陽(yáng)性染色主要定位于合體滋養(yǎng)層細(xì)胞和細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞的細(xì)胞膜，PLAC8陽(yáng)性染色主要定位于合體滋養(yǎng)層細(xì)胞的細(xì)胞核（圖2）?；袅鳟a(chǎn)組絨毛組織中E-CAD、CK7的AOD明顯高于正常妊娠組，差異有顯著性（t=3.823、3.889，P<0.05），兩組PLAC8的AOD差異無(wú)顯著性（P>0.05）。見(jiàn)表3。

3 討 論

稽留流產(chǎn)是妊娠中常見(jiàn)的并發(fā)癥之一，目前已經(jīng)明確了稽留流產(chǎn)的幾個(gè)原因。但是，仍有50%的稽留流產(chǎn)原因不明。目前沒(méi)有能夠有效預(yù)測(cè)稽留流產(chǎn)的臨床指標(biāo)，因此，尋找能夠預(yù)測(cè)妊娠結(jié)局的特異性強(qiáng)、靈敏度高的臨床指標(biāo)具有重要的意義。本文研究比較早孕期不明原因稽留流產(chǎn)病人及正常早孕女性絨毛組織中E-CAD、CK7以及PLAC8的表達(dá)水平，探討其作為預(yù)測(cè)妊娠結(jié)局的生物學(xué)標(biāo)志物的潛能。

眾所周知，上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是一種細(xì)胞失去上皮特性而獲得間充質(zhì)特性并伴有轉(zhuǎn)移的細(xì)胞過(guò)程。E-CAD的丟失和波形蛋白的獲得被認(rèn)為是EMT過(guò)程中的重要事件。EMT可以由多種誘導(dǎo)因子的復(fù)雜相互作用觸發(fā)，如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF-β）或者成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGF）、多種受體酪氨酸激酶（RTKs）、WNT/β-catenin、NOTCH和HEDGEHOG信號(hào)通路、EMT誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子（TFs）的激活、microRNAs，以及表觀(guān)遺傳和翻譯后修飾。當(dāng)機(jī)體在炎癥、傷口愈合和癌變等病理情況下EMT也可被激活。有研究顯示，E-CAD存在于母胎界面的滋養(yǎng)細(xì)胞以及蛻膜上皮細(xì)胞，可能與胚胎著床、滋養(yǎng)細(xì)胞分化及侵襲等生物學(xué)行為密切相關(guān)。

在人類(lèi)妊娠過(guò)程中，關(guān)鍵的環(huán)節(jié)是胚胎在子宮內(nèi)膜中植入以及建立一個(gè)功能完備的胎盤(pán)，滋養(yǎng)層細(xì)胞對(duì)母體蛻膜的侵襲在其中發(fā)揮了重要作用。滋養(yǎng)層細(xì)胞是妊娠早期胎盤(pán)和胎兒發(fā)育的重要組成部分，其從黏附依賴(lài)的上皮表型分化為間充質(zhì)樣的侵襲性絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞，在母胎界面的發(fā)育中至關(guān)重要。本文研究結(jié)果顯示，不明原因稽留流產(chǎn)病人的E-CAD表達(dá)水平明顯高于正常對(duì)照組，提示不明原因稽留流產(chǎn)胚胎絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞的細(xì)胞間黏附增加，導(dǎo)致滋養(yǎng)層細(xì)胞對(duì)母體蛻膜的侵襲減少，可能導(dǎo)致母體子宮螺旋動(dòng)脈重構(gòu)不足，最終導(dǎo)致不良妊娠結(jié)局的發(fā)生。因此，深入研究滋養(yǎng)層細(xì)胞對(duì)母體蛻膜的侵襲行為的調(diào)控機(jī)制具有重要意義。E-CAD表達(dá)水平的增加是通過(guò)何種方式影響滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵襲性還有待進(jìn)一步發(fā)掘。

細(xì)胞角蛋白具有極高的組織分化特異性和保守性，與上皮細(xì)胞的類(lèi)型、增殖、分化密切相關(guān)，因此常被用作腫瘤細(xì)胞的標(biāo)記物。在宮頸上皮內(nèi)瘤變中，CK7陽(yáng)性表達(dá)是病變進(jìn)展的一個(gè)標(biāo)志。然而，盡管有許多CK7在腫瘤進(jìn)展以及預(yù)后預(yù)測(cè)中的作用研究，但在稽留流產(chǎn)中作用報(bào)道相對(duì)較少。本研究結(jié)果顯示，不明原因稽留流產(chǎn)病人的絨毛組織中CK7的表達(dá)水平明顯高于正常對(duì)照組，提示CK7的高表達(dá)可能是導(dǎo)致稽留流產(chǎn)的一個(gè)重要原因。

PLAC8已被證實(shí)參與各種細(xì)胞過(guò)程。PLAC8在妊娠和胎盤(pán)發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)是動(dòng)態(tài)的，并以植入依賴(lài)的方式積累。本文研究結(jié)果顯示，不明原因稽留流產(chǎn)病人絨毛組織中PLAC8的mRNA及蛋白表達(dá)水平與正常對(duì)照者比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CHANG等研究顯示，PLAC8是間質(zhì)性絨毛膜外滋養(yǎng)層細(xì)胞（iEVT）的標(biāo)志物?？紤]到iEVT主要定植于母體蛻膜，PLAC8可能在不明原因稽留流產(chǎn)病人與正常早孕女性的蛻膜組織中會(huì)有差異表達(dá)，有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，不明原因稽留流產(chǎn)病人絨毛組織中的E-CAD以及CK7表達(dá)上調(diào)，這可能有助于開(kāi)發(fā)稽留流產(chǎn)新的診斷和治療策略，同時(shí)提示了稽留流產(chǎn)潛在的研究方向。

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（本文編輯 黃建鄉(xiāng)）