王巧祎 趙希芹 郭雨辰 張璐 李曉欣 王云

[摘要] 目的 探討人乳頭瘤病毒52型（HPV52）E6和E7基因多態(tài)性與宮頸上皮內瘤變（CIN）的相關性。

方法 收集來自青島地區(qū)的177例HPV52陽性且進行宮頸活檢病人的宮頸脫落細胞樣本，采用PCR直接測序法檢測E6和E7基因序列，在GenBank中剪切HPV52標準株和變異株序列，應用Lasergene和MEGA軟件對序列進行比對和系統(tǒng)進化樹分析。比較正常、低級別上皮內瘤變（CIN1）和高級別上皮內瘤變（CIN2/3）樣本中E6和E7基因變異型的分布。

結果 138例樣本成功獲得E6和E7基因序列。與標準株比較，132例（95.7%）樣本在E6區(qū)同時出現(xiàn)1處錯義突變（K93R）和1處同義突變（g350t），經系統(tǒng)進化樹分析，確定為B變異型；其余樣本有5例（3.6%）屬于A變異型，1例（0.7%）屬于C變異型。135例（97.8%）樣本在E7區(qū)同時出現(xiàn)2處同義突變（c751t和a801g），為B變異型；其余樣本有2例（1.5%）屬于A變異型，1例（0.7%）屬于C變異型。正常、CIN1和CIN2/3樣本之間E6和E7變異型的分布差異均無顯著性（P＞0.05）。

結論 來自青島地區(qū)正常及CIN樣本中HPV52 E6和E7基因均以亞洲株B變異型為主，E6和E7基因多態(tài)性可能與CIN發(fā)生發(fā)展無明顯相關性。

[關鍵詞] 人乳頭瘤病毒52；乳頭瘤病毒E6蛋白質類；乳頭瘤病毒E7蛋白質類；宮頸上皮內瘤樣病變；多態(tài)性，單核苷酸

[中圖分類號] R373.9；R711.74

[文獻標志碼] A

[文章編號] 2096-5532（2022）05-0667-05doi：10.11712/jms.2096-5532.2022.58.136

[開放科學（資源服務）標識碼（OSID）]

[網絡出版] https：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.r.20220713.1040.006.html;2022-07-14 13：37：34

RELATIONSHIP BETWEEN E6 AND E7 GENE POLYMORPHISMS OF HUMAN PAPILLOMAVIRUS TYPE 52 AND CERVICAL INTRAEPITHELIAL NEOPLASIA

WANG Qiaoyi， ZHAO Xiqin， GUO Yuchen， ZHANG Lu， LI Xiaoxin， WANG Yun

（Department of Pathogenic Biology， School of Basic Medicine， Qingdao University， Qingdao 266071， China）;

[ABSTRACT] Objective To explore the relationship between the E6 and E7 gene polymorphisms of human papillomavirus type 52 （HPV52） and cervical intraepithelial neoplasia （CIN）.

Methods We collected the cervical exfoliated cell samples from 177 patients who were positive for HPV52 and underwent cervical biopsy in Qingdao， China. The E6 and E7 gene sequences of the samples were determined by PCR-based direct sequencing. With the sequences of standard and variant HPV52 strains obtained from GenBank， sequence alignment and phylogenetic analysis were carried out using Lasergene and MEGA software. The distributions of E6 and E7 variants were compared between normal， low-grade intraepithelial neoplasia （CIN1）， and high-grade intraepithelial neoplasia （CIN2/3） samples.

Results The E6 and E7 sequences of 138 samples were obtained. Compared with the standard strain， 132（95.7%） samples had a missense mutation （K93R） and a synonymous mutation （g350t） both in the E6 region， belonging to lineage B variant as demonstrated by the phylogenetic tree; in addition， 5（3.6%） and 1（0.7%） samples belonged to lineage A and C variants， respectively. One hundred and thirty-five （97.8%） samples had two synonymous mutations （c751t and a801g） both in the E7 region， belonging to lineage B variant; 2（1.5%） and 1（0.7%） samples belonged to lineage A and C variants， respectively. There were no significant differences in the distributions of E6 and E7 variants between normal， CIN1， and CIN2/3 samples （P>0.05）.

Conclusion The HPV52 E6 and E7 variants in normal and CIN samples from Qingdao predominantly belong to Asian lineage B. E6 and E7 gene polymorphisms may not be related to the development of CIN.

[KEY WORDS] human papillomavirus 52; papillomavirus E6 proteins; papillomavirus E7 proteins; cervical intraepithelial neoplasia; polymorphism， single nucleotide

宮頸癌是嚴重威脅女性生命的惡性腫瘤之一，2020年研究數據顯示，宮頸癌的發(fā)病率和病死率在全球女性惡性腫瘤中位居第4位。宮頸上皮內瘤變（CIN）是反映宮頸癌持續(xù)發(fā)展的重要指標，而持續(xù)人乳頭瘤病毒（HPV）感染是導致CIN和宮頸癌發(fā)生發(fā)展的關鍵因素。HPV有200余種基因型，不同地區(qū)及不同宮頸疾病人群中HPV的感染率和基因型分布均存在差異。以往的個例報道和Meta分析數據均表明，在我國HPV 52型（HPV52）是與宮頸病變發(fā)生有關的一種重要的HPV基因型。HPV編碼基因存在多態(tài)性，E6和E7是HPV致癌的關鍵蛋白，其多態(tài)性與宮頸病變發(fā)生的相關性備受關注。但目前對HPV52 E6和E7基因多態(tài)性的研究相對較少，其與宮頸病變的關系尚無明確結論。本研究分析比較青島地區(qū)正常和不同級別CIN樣本中HPV52 E6和E7基因多態(tài)性，為豐富HPV52分子流行病學資料和明確HPV52基因變異在宮頸病變中的作用提供依據。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2019年6月—2020年12月于青島大學附屬醫(yī)院中心實驗室行HPV基因型檢測并進行陰道鏡下宮頸活檢的門診、住院病人及體檢女性為研究對象。首先采集宮頸脫落細胞樣本，采用HPV分型檢測試劑盒（亞能生物技術深圳有限公司）進行HPV檢測，樣本采集和檢測步驟均嚴格按照試劑盒說明書的要求操作，并留取HPV52單獨陽性標本-20 ℃凍存。然后利用病人門診號（唯一號）通過醫(yī)院醫(yī)渡云科研平臺檢索留取樣本病例的病理檢測結果，選取其中首次進行宮頸活檢的病例，并進一步檢索或咨詢其年齡、戶籍和民族等相關信息。最后納入177例樣本進行HPV52 E6和E7基因序列檢測和分析，其中病理結果顯示正常者68例，CIN1者57例，CIN2/3者52例；病人年齡21～77歲，平均（43.02±11.40）歲；病人均為青島地區(qū)戶籍，漢族，有性生活史，無子宮切除、宮頸手術及HPV感染治療史。177例樣本經序列檢測后共138例樣本成功獲得E6和E7基因序列，其中病理結果正常者47例，CIN1者46例，CIN2/3者45例。正常組年齡為22～77歲，平均（44.45±12.10）歲；CIN1組年齡21～67歲，平均（43.44±12.36）歲；CIN2/3組年齡21～65歲，平均（40.91±10.53）歲，3組之間年齡差異無統(tǒng)計學意義（F=1.100，P=0.336）。

1.2 E6和E7基因序列檢測

采用Primer-BLAST（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/）在線設計引物，擴增區(qū)域包括E6編碼區(qū)（nt 102～548）和E7編碼區(qū)（nt 553～852）。引物名稱、序列、擴增片段大小及其在基因組中的位置見表1。先以HPV52-F1和HPV52-R1為引物進行PCR擴增，出現(xiàn)擴增條帶的直接測序；如果沒有出現(xiàn)擴增條帶，則以該擴增產物為模板進行第2輪擴增，擴增引物為HPV52-F2和HPV52-R2，出現(xiàn)擴增條帶者進行測序。PCR擴增反應體系內含有：Taq Green PCR Master Mix（美國賽默飛世爾科技公司）15.0 μL，上下游引物各1.2 μL，DNA模板2.0 μL，用水補足至30.0 μL。循環(huán)條件：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。取3 μL的PCR產物進行20 g/L瓊脂糖凝膠電泳，觀察擴增條帶。每次PCR反應均設陰性對照和陽性對照，陰性對照為HPV陰性的宮頸癌細胞系C-33A提取的DNA，陽性對照為已知HPV52陽性標本DNA。

取上述PCR產物25 μL送北京華大基因有限公司測序，測序所用引物為HPV52-F2、HPV52-R2和HPV52-R3，采用末端終止法進行雙向測序。以HPV52標準株X74481（GenBank收錄號X74481）序列作參比，采用Lasergene軟件（version 7.0）進行序列剪接和對排。

1.3 系統(tǒng)進化樹分析

從GenBank中獲取HPV52變異型或亞型A2、B1、B2、C1、C2和D代表株E6、E7序列，這些代表株GenBank收錄號分別為HQ537739、HQ537740、HQ537743、HQ537744、HQ537746和HQ537748，標準株X74481為A1變異亞型。用MEGA 7.0軟件，將本研究所獲得的E6和E7序列及上述代表株序列，用Clastal W方法進行比對和同源性分析，臨接法（Neighbor-joining）繪制系統(tǒng)進化樹。

1.4 統(tǒng)計學分析

應用SAS 9.4統(tǒng)計軟件進行數據分析。采用Fisher確切概率法比較不同組間HPV52 E6和E7基因變異型的分布。以P＜0.05為差異有顯著性。

2 結 果

2.1 E6基因序列多態(tài)性

與標準株比較，138例標本中除2例在E6基因編碼區(qū)未出現(xiàn)變異，其余標本均出現(xiàn)單核苷酸突變，未見插入或缺失。共出現(xiàn)6處錯義突變和10處同義突變。錯義突變中，K93R見于134例樣本（4例樣本核苷酸a378c和a379g突變導致氨基酸K93R突變，130例a379g突變導致K93R突變），其中1例樣本還出現(xiàn)K93G突變（核苷酸a378g和a379g突變）；N122K（c467a）突變見于2例樣本；Q38H（a215t）、F45R（t235a）和L67V（c300g）同時出現(xiàn)于1例樣本；W132R（t495c）見于1例樣本。同義突變中，g350t見于133例樣本，g356a見于15例樣本，t191c和g356a突變各見于2例樣本，a180c、a278t、t309c、g371a、a422g和a530g各見于1例樣本。

本文138例樣本共出現(xiàn)15條不同序列，將這15條不同基因序列與GenBank中A1、A2、B1、B2、C1、C2和D代表序列共同繪制系統(tǒng)進化樹（圖1），結果顯示，2例樣本序列屬于A1變異亞型，與代表株X74481-A1序列相同；3例樣本序列屬于A2變異亞型，與代表株HQ537739-A2比較，均出現(xiàn)錯義突變K93R，但是未出現(xiàn)同義突變a251g；132例樣本序列屬于B變異型，與代表株HQ537740-B1和HQ537743-B2的序列相同，均同時出現(xiàn)錯義突變K93R（1例為K93G）和同義突變g350t；1例樣本序列屬于C2變異亞型，與代表株HQ537746-C2比較，出現(xiàn)同義突變a530g，但在氨基酸83僅出現(xiàn)核苷酸g350t突變，而代表株同時出現(xiàn)核苷酸g350t和c348g突變導致氨基酸L83V突變。

正常、CIN1和CIN2/3組E6基因各變異型分布差異無統(tǒng)計學意義（P=0.741），3組均以B變異型為主。見表2。

2.2 E7基因序列多態(tài)性

與標準株比較，138例標本中除2例標本在E7基因編碼區(qū)未出現(xiàn)變異，其余標本均出現(xiàn)單核苷酸突變，未見插入或缺失。共出現(xiàn)12處錯義突變和7處同義突變。在錯義突變中，M1T（t554c）和Y11C（a584g）同時出現(xiàn)于1例樣本；T37I（c662t）、S52D（a706g、g707a）、Y59D（a728g）、H61Y（c733t）、D64N（g742a）和L99R（t848g）同時見于1例樣本，其中D64N還見于另外2例樣本；M84I（g804t）見于1例樣本。在同義突變中，a801g出現(xiàn)于136例樣本，c751t出現(xiàn)于133例樣本，t583g、a681g、t765c、a793t和c837g各見于1例樣本。

本文138例樣本共出現(xiàn)12條不同序列，將這12條不同基因序列與GenBank中A1、A2、B1、B2、C1、C2和D代表序列共同繪制系統(tǒng)進化樹（圖2），結果顯示，2例樣本序列與代表株X74481-A1和HQ537739-A2序列均相同，在系統(tǒng)樹中屬于A變異型，這2條序列與E6基因屬于A1變異亞型的2條序列來源于相同樣本；135例樣本序列與代表株HQ537740-B1和HQ537743-B2比較，均同時出現(xiàn)同義突變c751t和a801g，屬于B變異型；1例樣本序列屬于C變異型，其與E6基因屬于C變異型的序列來源于同一樣本，該序列與HQ537746-C2的序列相同，出現(xiàn)6處錯義突變（T37I、S52D、Y59D、H61Y、D64N和L99R）和2處同義突變（t583g和a801g）。除3例在E6區(qū)屬于A2變異亞型的序列在E7區(qū)屬于B變異型外，其余序列在E6和E7區(qū)的變異型分類一致。

正常、CIN1和CIN2/3組中E7基因各變異型分布差異無統(tǒng)計學意義（P=0.472），3組均以B變異型為主。見表3。

3 討 論

HPV52編碼基因具有多態(tài)性，根據其編碼的E6、E7、主要衣殼蛋白L1和長控制區(qū)（LCR）基因多態(tài)性，將HPV52分為A、B、C、D等4種基因變異型，進一步分為A1、A2、B1、B2、C1、C2和D等7種變異亞型。以往研究顯示，HPV52變異型的分布具有地域差異，亞洲以B變異型為主，歐洲、美洲和非洲均以A變異型為主，C和D變異型在各地域檢出率均較低。本研究首次對來自青島地區(qū)正常和CIN樣本中HPV52 E6和E7基因進行檢測，結果顯示本地區(qū)樣本E6和E7基因均以B變異型為主，分別占95.7%和97.8%。這與日本、我國四川、上海和北京等地的檢測結果相似，2篇來自日本的研究中B變異型檢出率分別為96.2%（50/52）和92.3%（36/39），四川為97.6%（41/42），上海為96.3%（52/54），北京為90.0%（45/50）。但本研究樣本中HPV52 E6和E7變異型的分布與臺灣和湖北荊州的檢測數據存在明顯差異，臺灣280例樣本中A、B和C變異型的檢出率分別為0.7%、88.2%和11.1%，湖北荊州168例樣本中B、C和D變異型的檢出率分別為85%、5%和10%，這兩個地區(qū)B變異型的檢出率相對較低，C或者D變異型的檢出率相對較高。上述各地區(qū)HPV52 B變異型的檢出率均高于越南（73.7%，28/38）和菲律賓（62.5%，20/32）?？梢妬喼薏煌赜蚧驀鴥炔煌赜騂PV52 E6和E7基因變異型的分布存在差異，對不同地域樣本的檢測可為全面了解HPV52的分子流行病學特征提供有價值的信息。

HPV基因變異與宮頸病變的關系是HPV致癌機制研究的熱點問題之一。有研究比較同一地區(qū)不同程度宮頸病變或細胞學異常人群與正常人群中HPV52 E6和（或）E7基因變異情況，結果顯示不同宮頸病變人群及正常人群之間基因變異型或基因突變分布無明顯差異，從而認為HPV52 E6和E7基因變異與宮頸病變發(fā)病風險或病變嚴重程度不相關。本研究結果顯示，HPV52 E6和E7基因變異型分布在正常、CIN1和CIN2/3組中差異無顯著性，且多數樣本序列相同，提示HPV52 E6和E7基因多態(tài)性與CIN發(fā)生發(fā)展無明顯相關性。但也有研究結果顯示，HPV52 E6和E7基因某變異型或特定突變增加了CIN或宮頸癌患病風險，如韓國的一項研究中，HPV52 E6基因以B變異型和C變異型為主，而且B變異型E6基因的K93R（A379G）突變與宮頸惡性病變相關；加拿大的一項研究亦表明，LCR的t7744c和E6的K93R突變增加了CIN2/3（與CIN1+正常比較）的發(fā)生風險；臺灣一項研究顯示，E6和E7的C變異型增加了高級別鱗狀細胞內病變及宮頸癌的發(fā)生風險；美國最新的一項病例對照研究采用全基因組測序檢測50例CIN3和39例正常女性宮頸樣本，發(fā)現(xiàn)C2變異亞型與CIN3高風險有關；ZHANG等的研究顯示，與A型比較，B型和C型增加了CIN3及宮頸癌的發(fā)生風險。與HPV52 E6和E7變異增加患病風險不同，江蘇地區(qū)的一項研究和廣州地區(qū)的一項研究分別顯示，宮頸病變（CIN1/2/3和宮頸癌合并）樣本HPV52 E6基因的突變頻率顯著低于正常樣本，從而認為E6基因突變可能阻礙宮頸病變和宮頸癌的發(fā)生發(fā)展或降低HPV的致癌作用。由此可見，HPV52 E6和E7基因多態(tài)性與宮頸病變的相關性目前尚不能得出明確結論。導致不同研究結論不一致的原因，可能與研究樣本例數偏少、納入研究病種不一致、疾病分組不一致和地域局限等有關。

總之，本研究表明，來自青島地區(qū)宮頸細胞樣本中HPV52 E6和E7基因主要為B變異型，且E6和E7基因多態(tài)性可能與CIN發(fā)生發(fā)展無明顯相關性。本研究結果為了解該地區(qū)HPV52分子流行病學特征以及進一步明確HPV52基因變異與宮頸病變的關系提供了數據支持。

[參考文獻]

[1]SUNG H， FERLAY J， SIEGEL R L， et al. Global cancer statistics 2020： GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries[J]. CA： A Cancer Journal for Clinicians， 2021，71（3）：209-249.

[2]BRUSSELAERS N， SHRESTHA S， VAN DE WIJGERT J， et al. Vaginal dysbiosis and the risk of human papillomavirus and cervical cancer： systematic review and meta-analysis[J]. American Journal of Obstetrics and Gynecology， 2019，221（1）：9-18.e8.

[3]GUO C L， DU H， BELINSON J L， et al. The prevalence and distribution of human papillomavirus among 10，867 Chinese Han women[J]. Infectious Agents and Cancer， 2021，16（1）：21.

[4]BAO H L， JIN C， WANG S， et al. Prevalence of cervicovaginal human papillomavirus infection and genotypes in the pre-vaccine era in China： a nationwide population-based study[J]. The Journal of Infection， 2021，82（4）：75-83.

[5]韋夢娜，余艷琴，徐慧芳，等. 中國大陸地區(qū)不同宮頸病變人群中人乳頭瘤病毒感染率及型別分布的系統(tǒng)研究[J]. 中國腫瘤臨床與康復， 2020，27（2）：133-137.

[6]趙希芹，宋海洋，孫有湘，等. 青島市部分地區(qū)女性HPV感染現(xiàn)狀分析[J]. 精準醫(yī)學雜志， 2021，36（5）：428-432.

[7]CHEN Z G， SCHIFFMAN M， HERRERO R， et al. Evolution and taxonomic classification of human papillomavirus 16 （HPV16）-related variant genomes： HPV31， HPV33， HPV35， HPV52， HPV58 and HPV67[J]. PLoS One， 2011，6（5）：e20183.

[8]ZHANG C Q， PARK J S， GRCE M， et al. Geographical distribution and risk association of human papillomavirus genotype 52-variant lineages[J]. The Journal of Infectious Diseases， 2014，210（10）：1600-1604.

[9]ISHIZAKI A， MATSUSHITA K， HOANG H T， et al. E6 and E7 variants of human papillomavirus-16 and-52 in Japan， the Philippines， and Vietnam[J]. Journal of Medical Virology， 2013，85（6）：1069-1076.

[10]CHOI Y J， KI E Y， ZHANG C Q， et al. Analysis of sequence variation and risk association of human papillomavirus 52 va-riants circulating in Korea[J]. PLoS One， 2016，11（12）：e0168178.

[11]王本敬，劉敏娟，李文靜，等. 人乳頭瘤病毒52型E6和E7基因突變與宮頸癌及癌前病變關系的研究[J]. 中國計劃生育和婦產科， 2018，10（6）：24-30.

[12]秦燕萍，夏小璐，楊麗芳. HPV52型E6和E7基因突變位點分布及與宮頸癌和癌前病變的相關性[J]. 中國病案， 2020，21（5）：83-86.

[13]KUMAR S， STECHER G， TAMURA K. MEGA7： molecular evolutionary genetics analysis version 7.0 for bigger datasets[J]. Molecular Biology and Evolution， 2016，33（7）：1870-1874.

[14]TENJIMBAYASHI Y， ONUKI M， HIROSE Y， et al. Whole-genome analysis of human papillomavirus genotypes 52 and 58 isolated from Japanese women with cervical intraepithelial neoplasia and invasive cervical cancer[J]. Infectious Agents and Cancer， 2017，12：44.

[15]SONG Z L， CUI Y R， LI Q F， et al. The genetic variability， phylogeny and functional significance of E6， E7 and LCR in human papillomavirus type 52 isolates in Sichuan， China[J]. Virology Journal， 2021，18（1）：94.

[16]ZHAO J W， ZHAN Q， GUO J H， et al. Phylogeny and polymorphism in the E6 and E7 of human papillomavirus： alpha-9 （HPV16，31，33，52，58）， alpha-5 （HPV51）， alpha-6 （HPV53，66）， alpha-7 （HPV18，39，59，68） and alpha-10 （HPV6，44） in women from Shanghai[J]. Infectious Agents and Cancer， 2019，14：38.

[17]李穎，周玲，廖秦平，等. 北京地區(qū)收集的人乳頭瘤病毒52型基因突變和型下分類的研究[J]. 中華實驗和臨床病毒學雜志， 2016，30（6）：558-561.

[18]CHANG Y J， CHEN H C， LEE B H， et al. Unique variants of human papillomavirus genotypes 52 and 58 and risk of cervical neoplasia[J]. International Journal of Cancer， 2011，129（4）：965-973.

[19]LI S， YE M X， CHEN Y L， et al. Genetic variation of E6 and E7 genes of human papillomavirus 52 from Central China[J]. Journal of Medical Virology， 2021，93（6）：3849-3856.

[20]FRATI E R， BIANCHI S， AMENDOLA A， et al. Genetic characterization of variants of HPV-16， HPV-18 and HPV-52 circulating in Italy among general and high-risk populations[J]. Molecular Medicine Reports， 2020，21（2）：894-902.

[21]BEE K J， GRADISSIMO A， CHEN Z G， et al. Genetic and epigenetic variations of HPV52 in cervical precancer[J]. International Journal of Molecular Sciences， 2021，22（12）：6463.

[22]DING T， WANG X Y， YE F， et al. Distribution of human papillomavirus 58 and 52 E6/E7 variants in cervical neoplasia in Chinese women[J]. Gynecologic Oncology， 2010，119（3）：436-443.

[23]SUN Z R， LU Z T， LIU J H， et al. Genomic polymorphism of human papillomavirus type 52 in women from Northeast China[J]. International Journal of Molecular Sciences， 2012，13（11）：14962-14972.

[24]FORMENTIN A， ARCHAMBAULT J， KOUSHIK A， et al. Human papillomavirus type 52 polymorphism and high-grade lesions of the uterine cervix[J]. International Journal of Can-cer， 2013，132（8）：1821-1830.

（本文編輯 馬偉平）