紀曉月 彭旭東 戰(zhàn)璐 張冉冉 趙桂秋

[摘要] 目的 探討白及多糖（BSP）對煙曲霉菌誘導(dǎo)的小鼠巨噬細胞炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用。

方法 通過CCK-8細胞毒性實驗檢測0、1、2、4、8、16、32、64、128 g/L的BSP溶液對巨噬細胞活力的影響；煙曲霉菌滅活菌絲感染RAW264.7細胞后給予16 g/L的BSP溶液進行處理，應(yīng)用RT-PCR方法檢測其炎癥因子白細胞介素1β（IL-1β）、白細胞介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）和模式識別受體LOX-1 mRNA的表達；應(yīng)用ELISA和Western blot方法檢測炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α和模式識別受體LOX-1蛋白的表達。

結(jié)果 不超過32 g/L的BSP不影響RAW264.7細胞活性（F=0.08～2.09，P>0.05）。BSP可以顯著降低煙曲霉菌刺激所引起的巨噬細胞模式識別受體LOX-1和下游炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA表達（F=341.20～1 112.33，P<0.001）和蛋白表達（F=74.20～641.34，P<0.001）。

結(jié)論 BSP通過下調(diào)巨噬細胞中模式識別受體LOX-1表達，抑制下游促炎因子表達，發(fā)揮對煙曲霉菌感染后的抗炎作用。

[關(guān)鍵詞] 白及多糖；巨噬細胞；煙曲霉菌；炎癥

[中圖分類號] R392.5;R379.6

[文獻標志碼] A

[文章編號] 2096-5532（2022）05-0662-05doi：10.11712/jms.2096-5532.2022.58.131

[開放科學（資源服務(wù)）標識碼（OSID）]

[網(wǎng)絡(luò)出版] https：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20220713.1059.011.html;2022-07-14 08：58：07

REGULATORY EFFECT OF BLETILLA STRIATA POLYSACCHARIDES ON MACROPHAGE INFLAMMATION INDUCED BY ASPERGILLUS FUMIGATUS

JI Xiaoyue， PENG Xudong， ZHAN Lu， ZHANG Ranran， ZHAO Guiqiu

（Department of Ophthalmology， The Affiliated Hospital of Qingdao University， Qingdao 266003， China）;

[ABSTRACT] Objective To investigate the regulatory effect of Bletilla striata polysaccharides （BSP） on the inflammatory response of mouse macrophages induced by Aspergillus fumigatus.Methods CCK-8 cytotoxicity assay was used to investigate the influence of BSP on macrophage viability at the concentrations of 0，1，2，4，8，16，32，64， and 128 g/L. RAW264.7 cells were infected by the inactivated hyphae of Aspergillus fumigatus and then treated with 16 g/L BSP solution; real-time PCR was used to measure the mRNA expression levels of the inflammatory cytokines interleukin-1β （IL-1β）， interleukin-6 （IL-6）， and tumor necrosis factor-α （TNF-α） and the pattern recognition receptor LOX-1， and ELISA and Western blot were used to measure the protein expression levels of the inflammatory factors IL-1β， IL-6， and TNF-α and the pattern recognition receptor LOX-1.Results BSP with a concentration of ≤32 g/L did not affect the viability of RAW264.7 cells （F=0.08-2.09，P>0.05）. BSP significantly reduced the mRNA and protein expression levels of the macrophage pattern recognition receptor LOX-1 and the downstream inflammatory cytokines IL-1β， IL-6， and TNF-α induced by Aspergillus fumigatus stimulation （mRNA expression： F=341.20-1 112.33，P<0.001; protein expression： F=74.20-641.34，P<0.001）.Conclusion BSP exerts an anti-inflammatory effect after Aspergillus fumigatus infection by downregulating the pattern recognition receptor LOX-1 in macrophages and inhibiting the expression of downstream proinflammatory factors.

[KEY WORDS] Bletilla striata polysaccharide; macrophages; Aspergillus fumigatus; inflammatory

煙曲霉菌作為一種常見的條件致病性真菌，其分生孢子直徑為2～3 μm，在自然界中無處不在，可漂浮在空氣中。當機體免疫力低下，抵抗真菌侵襲的能力下降，煙曲霉菌極易在體內(nèi)黏附、繁殖、形成生物膜，逃避免疫清除，侵害機體；同時煙曲霉菌能夠釋放多種蛋白酶水解機體組織結(jié)構(gòu)，擴大真菌的感染范圍，引起機體嚴重的損傷。巨噬細胞作為機體抵抗真菌的第一道防線，分泌特定的細胞因子來激活其他免疫細胞，并對煙曲霉菌起到清除作用，但是過量的細胞因子則會造成過度的炎癥反應(yīng)，不僅不利于組織的修復(fù)還會損傷正常的組織細胞。白及多糖（BSP）是一種從中藥白及中提取出的多糖類物質(zhì)，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等多種藥理活性作用。既往研究發(fā)現(xiàn)，BSP可以通過下調(diào)JAK/STAT信號通路中的JAK2表達水平來抑制腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素6（IL-6）和白細胞介素1β（IL-1β）的釋放，從而發(fā)揮抗炎作用。本研究旨在探討B(tài)SP對煙曲霉菌感染后巨噬細胞產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用，為煙曲霉菌感染所致的炎癥性疾病治療提供一種新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

小鼠RAW264.7巨噬細胞株購自中國科學院上海細胞庫。煙曲霉菌菌株（NO3.0772）來自中國北京普通微生物培養(yǎng)物保藏中心，根據(jù)林浩等研究方法進行煙曲霉菌滅活菌絲的制備。

1.2 RAW264.7細胞處理

RAW264.7細胞接種于6孔板或12孔板中，細胞密度約為5×10/L，37 ℃培養(yǎng)24 h后，加入滅活煙曲霉菌菌絲刺激1 h，再加入16 g/L 的BSP。將細胞分為空白組（N組）、單純BSP處理組（N+BSP組）、單純滅活菌絲處理組（AF組）及加菌加藥處理組（AF+BSP組），分別給予相應(yīng)的處理。在菌絲感染8 h后收集12孔板中的細胞用于實時熒光定量PCR（RT-PCR）實驗；菌絲感染24 h后收集6孔板中的細胞培養(yǎng)液，離心后取上清液用于ELISA實驗；吸出6孔板中細胞培養(yǎng)液后，在孔中加入蛋白裂解液（RIPA裂解液∶PMSF∶磷酸酶抑制劑=98∶1∶1），應(yīng)用細胞刮刮取細胞收集至EP管中，用于Western blot實驗。

1.3 BSP細胞毒性測定

將RAW264.7細胞懸浮液100 μL接種于96孔板中，加入100 μL含有胎牛血清的DMEM細胞培養(yǎng)液，置于37 ℃培養(yǎng)24 h。每孔中加入不同濃度的BSP（0、1、2、4、8、16、32、64、128 g/L），同一濃度設(shè)6個復(fù)孔，孵育48 h。再將每孔中加入10 μL的CCK-8試劑（MCE，美國），孵育2 h。使用酶標儀（PerkinElimer，美國）測定各孔450 nm波長處的吸光度值。

1.4 RT-PCR方法檢測相關(guān)炎癥因子mRNA表達

提取細胞總mRNA，干燥后，加入適量DEPC水（生工生物工程（上海）股份有限公司）混勻。按照Prime Script RTreagent Kit With gDNA Eraser試劑盒（TaKaRa，中國大連）逆轉(zhuǎn)錄步驟，建立20 μL逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，其中包含： SYBR 10.0 μL，上游引物、下游引物各0.5 μL，cDNA模板2.0 μL，RNase Free dHO 7.0 μL。合成cDNA，應(yīng)用RT-PCR儀（Eppendorf公司，德國）進行PCR擴增反應(yīng)，將β-actin作為內(nèi)參照，分別檢測模式識別受體LOX-1和炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA表達。引物及其序列見表1。

1.5 ELISA實驗檢測IL-1β、IL-6和TNF-α的蛋白表達

應(yīng)用鼠IL-1β、IL-6和TNF-α酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒（R&D Systems，SanDiego，CA，美國），采用雙抗體夾心法檢測RAW264.7細胞分泌的IL-1β、IL-6和TNF-α的蛋白表達水平，使用酶標儀檢測樣品在450 nm波長處的吸光度。

1.6 Western blot方法檢測模式識別受體LOX-1的蛋白表達

根據(jù)BCA蛋白濃度測定試劑盒（Elabscience，中國武漢）的步驟檢測細胞蛋白濃度并計算各樣本上樣量，將樣品和Marker加入到膠板孔道中。連接電泳儀，至Buffer跑到膠底終止電泳。膠體通過SDS-PAGE電轉(zhuǎn)液的濕轉(zhuǎn)盒將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，加入適量PBST洗滌液進行洗膜。搖洗后加入封閉液（beyotime，中國北京）室溫封閉1 h，將封閉好的PVDF膜置于LOX-1（1∶1 000，abcam，英國）或GAPDH（1∶1 000，Elabscience，中國武漢）中4 ℃孵育過夜。PBST洗滌液洗膜，加入山羊抗兔二抗（1∶2 000，Elabscience，中國武漢）室溫孵育1 h；PVDF膜浸潤顯影液（Bio-Rad，美國）進行顯影并拍照。用Image J軟件定量分析各組蛋白條帶的灰度值。

1.7 統(tǒng)計學處理

應(yīng)用Graph Pad 8.0軟件進行統(tǒng)計學處理。計量資料數(shù)據(jù)以±s表示，數(shù)據(jù)間比較采用單因素方差分析及雙因素析因方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度BSP溶液對RAW264.7細胞活力的影響

終濃度為0、1、2、4、8、16、32、64、128 g/L的BSP溶液處理RAW264.7細胞48 h后， 64 g/L和128 g/L的 BSP溶液處理組RAW264.7細胞存活率與其他濃度處理組比較差異有統(tǒng)計學意義（F=372.90，P<0.001）。32 g/L濃度以內(nèi)的BSP溶液處理組的細胞存活率比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見圖1。

2.2 BSP對煙曲霉菌誘導(dǎo)的小鼠巨噬細胞炎癥因子mRNA表達的影響

析因設(shè)計的方差分析結(jié)果顯示，滅活菌絲處理產(chǎn)生的單獨效應(yīng)（F=234.78～2 433.53，P<0.001）、BSP處理產(chǎn)生的單獨效應(yīng)（F=20.002～141.20，P<0.001）、不同滅活菌絲處理組間（FAF=823.66～1 827.71，P<0.001）和不同BSP處理組間（FBSP=57.07～104.17，P<0.001）差異均具有統(tǒng)計學意義，兩處理因素有交互作用（FBSP×AF=57.07～106.41，P<0.001）。AF組中模式識別受體LOX-1和炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA表達水平較N組和N+BSP組明顯升高；AF+BSP組與AF組相比，模式識別受體LOX-1和炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA表達明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義（F=341.20～1 112.33，P<0.001）。見表2。

2.3 BSP對煙曲霉菌誘導(dǎo)的小鼠巨噬細胞炎癥因子蛋白表達的影響

析因設(shè)計的方差分析結(jié)果顯示，滅活菌絲處理產(chǎn)生的單獨效應(yīng)（F=14.28～1 162.37，P<0.001）、BSP處理產(chǎn)生的單獨效應(yīng)（F=66.10～602.34，P<0.001）、不同滅活菌絲處理組間（FAF=189.93～817.66，P<0.001）和不同BSP處理組間（FBSP=14.10～542.23，P<0.001）差異均具有統(tǒng)計學意義，并且兩處理因素交互間也有統(tǒng)計學意義（FBSP×AF=18.57～564.13，P<0.001）。AF組中模式識別受體LOX-1和下游炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α的蛋白表達水平較N組和N+BSP組明顯升高；經(jīng)過BSP處理后，AF+BSP組與AF組相比，模式識別受體LOX-1和炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α的蛋白表達水平明顯下降，差異均有統(tǒng)計學意義（F=74.20～641.34，P<0.001）。見表3。

3 討 論

當煙曲霉菌侵襲機體時，機體自身免疫是抵御真菌的首要因素，并且機體的免疫防御和免疫耐受之間的動態(tài)平衡在清除真菌的過程中起著重要作用。真菌侵入機體后，真菌結(jié)構(gòu)中的某些成分可以作為病原體相關(guān)分子模式被巨噬細胞吞噬并識別，使其分泌相關(guān)炎癥因子，激活機體炎癥級聯(lián)反應(yīng)，趨化其他免疫細胞共同抵抗病原菌的入侵并且消滅病原體。既往研究表明，固有免疫在煙曲霉菌感染過程中，尤其在早期進程中起決定性作用，巨噬細胞作為固有免疫的“先頭部隊”，其直接殺傷力僅次于中性粒細胞，并間接參與抗感染調(diào)節(jié)，在抗炎治療中具有診斷價值。

近來研究發(fā)現(xiàn)，BSP作為從中藥白及中提取出的一種多糖類物質(zhì)，具有良好的抗炎活性，在醫(yī)藥領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景。巨噬細胞作為BSP發(fā)揮抗炎作用的主要靶細胞，能夠吞噬真菌孢子和菌絲，完成抗原提呈，同時作為第一線防御細胞趨化其他免疫細胞，激活免疫系統(tǒng)，引發(fā)免疫應(yīng)答，在抵抗煙曲霉菌所致的感染性疾病中發(fā)揮著重要作用。已有研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細胞通過其細胞膜表面的模式識別受體，識別某些煙曲霉菌細胞壁成分，進一步觸發(fā)巨噬細胞對煙曲霉菌的吞噬、抗原提呈以及殺傷作用。LOX-1屬于C型凝集素受體家族，在宿主防御中起到促炎作用。已有研究結(jié)果表明，LOX-1是在巨噬細胞抗煙曲霉菌感染中發(fā)揮重要作用的模式識別受體之一。它可以通過炎癥信號傳導(dǎo)通路促進IL-1β、IL-6和TNF-α等因子的表達，因此適當控制LOX-1的表達水平有利于抑制炎性細胞因子的表達從而起到炎癥保護作用。IL-1β是一種主要由活化的單核-巨噬細胞、淋巴細胞等產(chǎn)生的細胞因子，通過與IL-1受體結(jié)合后發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)、趨化中性粒細胞作用，引起炎癥遞質(zhì)的釋放，導(dǎo)致煙曲霉菌性角膜炎癥的形成。TNF-α是一種主要由巨噬細胞和單核細胞分泌的促炎細胞因子，在機體應(yīng)激反應(yīng)及病理狀態(tài)下最早出現(xiàn)并且產(chǎn)生增多。IL-6是全身或局部急性炎癥反應(yīng)的標志因子。

本文研究結(jié)果顯示，32 g/L濃度內(nèi)的BSP對RAW264.7細胞無毒性作用，不影響其細胞活性；煙曲霉菌感染的巨噬細胞中模式識別受體LOX-1和下游促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表達水平顯著升高，這與前期研究結(jié)果一致。有研究發(fā)現(xiàn)，在人腎小球細胞和人角質(zhì)細胞中，BSP可以通過調(diào)節(jié)炎癥因子的釋放來發(fā)揮抗炎作用，對炎癥引起損傷的細胞具有一定的保護作用。本研究通過RT-PCR、ELISA和Western blot等檢測顯示，BSP能夠顯著降低煙曲霉菌刺激引起的巨噬細胞中模式識別受體LOX-1以及相關(guān)炎癥因子如IL-1β、IL-6和TNF-α的表達水平。

綜上所述，BSP能夠通過抑制模式識別受體LOX-1和下游炎癥因子表達，降低煙曲霉菌感染后的炎癥反應(yīng)，但BSP在真菌感染性疾病中的具體抗炎機制還需進一步研究。

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（本文編輯 黃建鄉(xiāng)）