程金金， 孫 星， 田莉莉， 王 亞， 余向陽

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所，江蘇南京210014；2.省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地/江蘇省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京210014)

鄰苯二甲酸二丁酯(Dibutyl phthalate, DBP)是一種常見的鄰苯二甲酸酯類化合物，主要用作增塑劑、染料溶劑、橡膠助劑等。近年來，由于大氣沉降、污水灌溉、污泥農(nóng)用以及肥料、農(nóng)藥和農(nóng)膜的大量使用，DBP已成為中國農(nóng)田土壤中較易被檢出且含量較高的鄰苯二甲酸酯類污染物之一[1]。農(nóng)田土壤中高含量的DBP不僅會(huì)影響作物生長和農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)[2]，還會(huì)通過食物鏈危害人體健康，導(dǎo)致人體內(nèi)分泌紊亂、生殖機(jī)能失常等[3]。美國國家環(huán)保局已將DBP列為優(yōu)先控制的污染物和內(nèi)分泌干擾物，中國也將其列為優(yōu)先控制的污染物。

土壤微生物作為指示土壤污染的敏感受體，對DBP污染具有靈敏的響應(yīng)[4]。已有研究發(fā)現(xiàn)，DBP污染對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)、多樣性及碳、氮、硫循環(huán)等生態(tài)功能均會(huì)產(chǎn)生影響[5-6]。此外，DBP污染對土壤DBP降解菌群、DBP降解基因豐度也有較大影響。Xu等[7]研究發(fā)現(xiàn)，DBP污染增加了土壤中DBP降解基因的豐度。吳學(xué)玲等[8]研究發(fā)現(xiàn)，DBP污染對土壤中能夠耐受和利用DBP的細(xì)菌類群起到了選擇性富集的作用。微生物降解作用是土壤中DBP消減的主要途徑[9]。因此，DBP降解菌群及降解基因豐度的變化可能對后續(xù)土壤中DBP污染的降解產(chǎn)生影響，相關(guān)研究有待深入。

目前，關(guān)于DBP對土壤微生物影響的研究多采用高劑量單次污染的方法。實(shí)際上，DBP主要是在大氣沉降、地膜使用等過程中以低劑量逐步累積的方式進(jìn)入土壤環(huán)境中[10]。在高劑量單次污染處理下，由于污染物未充分老化，因而其生物有效性較高[11]。多項(xiàng)研究均發(fā)現(xiàn)，有機(jī)污染物高劑量單次污染處理與低劑量累積污染處理間的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)和生態(tài)毒性差異顯著[12-13]，采用高劑量單次污染的處理方式可能會(huì)高估有機(jī)污染物的實(shí)際環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)和生態(tài)毒性[14-15]。因此，采用高劑量DBP單次污染處理與低劑量DBP累積污染處理對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及功能的影響可能存在較大差別。目前，關(guān)于不同污染方式下DBP對土壤微生物及相關(guān)功能影響的報(bào)道較少。

因此，本研究選擇2種物理化學(xué)性質(zhì)和生物學(xué)性質(zhì)差異較大的土壤作為供試土壤，模擬高劑量DBP單次污染和低劑量DBP累積污染的方式，對比研究不同污染方式對DBP降解能力的影響及不同污染方式的DBP對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)、多樣性的影響，以期為準(zhǔn)確評估受DBP污染土壤的環(huán)境效應(yīng)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試土壤

供試的2種土壤分別為采自江蘇省南京市農(nóng)田的0～20 cm層黃棕壤(地理位置：32°01′58″N，118°52′15″E)和廣西壯族自治區(qū)南寧市農(nóng)田的0～20 cm層紅壤(地理位置：23°08′05″N，109°01′07″E)。供試黃棕壤、紅壤的pH值分別為7.24、4.38，有機(jī)碳含量分別為7.44 g/kg、6.44 g/kg，黏粒含量分別為27%、65%，微生物量碳含量分別為165 mg/kg、43 mg/kg。供試的2種土壤除基本理化性質(zhì)、生物學(xué)性質(zhì)差異較大外，對DBP降解能力的差異也較大。DBP在供試黃棕壤、紅壤中的降解半衰期分別為0.65 d、2.53 d。將土樣帶回實(shí)驗(yàn)室后立即去除植物根系等雜物，過2 mm不銹鋼篩網(wǎng)后放置于4 ℃冷庫中備用。為保證土壤微生物的活性，在試驗(yàn)開始前，將土壤含水量調(diào)節(jié)至50%田間最大持水量，于25 ℃人工氣候箱中預(yù)培養(yǎng)7 d。

1.2 試驗(yàn)處理

根據(jù)相關(guān)報(bào)道提到的中國農(nóng)田土壤中DBP污染的濃度范圍[16]，試驗(yàn)設(shè)高劑量(20 mg/kg)DBP單次污染處理(S處理)、低劑量(每次1 mg/kg) DBP累積污染處理(每周污染1次，連續(xù)污染20次，R處理)和對照(CK，無DBP污染)，重復(fù)3次。首先按如下方法分別制備DBP含量為0 mg/kg、100 mg/kg、2 000 mg/kg的污染母土：在通風(fēng)櫥中，將DBP(分析純，含量為99.9%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)溶于丙酮后按預(yù)設(shè)含量加入到一定量供試土壤中并混合均勻，待丙酮完全揮發(fā)后研磨土壤并將其粉碎過60目篩。試驗(yàn)開始時(shí)，按質(zhì)量比1∶99取污染母土和預(yù)培養(yǎng)土壤于玻璃燒杯中，在試驗(yàn)第1～19周，繼續(xù)向玻璃燒杯中加入1%(質(zhì)量比)污染母土，充分混合均勻后，調(diào)節(jié)含水量至田間最大持水量的50%，用透氣膜封口，于25 ℃人工氣候箱中恒溫培養(yǎng)，每3 d稱1次質(zhì)量并補(bǔ)充損失的水分。在2種污染方式下，總DBP污染物含量均為20 mg/kg。不同處理下DBP的添加量及總DBP污染物含量詳見表1。

表1 不同污染方式的鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)添加量和總污染物含量

1.3 樣品的采集及測定

從第20周起，每周采樣并測定不同處理組的DBP含量。當(dāng)不同處理組的DBP含量均低于1 mg/kg時(shí)(試驗(yàn)第23周末)，采集玻璃燒杯中的土壤樣品，用于土壤微生物群落多樣性和DBP降解能力的測定。

土壤細(xì)菌群落多樣性的測定。用HiPure Soil DNA Kits(Magen，China)提取土壤中的總DNA。確認(rèn)土壤總DNA純度、濃度和完整性后，以土壤總DNA為模板，用細(xì)菌通用引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)、806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)對細(xì)菌的16S rRNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒(Axygen，USA)、Quantus熒光定量系統(tǒng)(Promega，USA)對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化回收和檢測定量。用Illumina公司的Miseq PE300平臺(tái)進(jìn)行測序，測序數(shù)據(jù)分析基于上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司的云平臺(tái)(https://cloud.majorbio.com/)。

土壤DBP降解能力的測定：取一部分S處理、R處理和CK的土壤樣品進(jìn)行滅菌處理。分別取200 g S處理、R處理、CK、S滅菌處理、R滅菌處理和CK滅菌處理的土壤樣品，向其中加入2 g 2 000 mg/kg DBP污染母土，使土壤樣品中后續(xù)加入的DBP含量為20 mg/kg。充分混合均勻后，調(diào)節(jié)土壤含水量至田間最大持水量的50%，用透氣膜封口后于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)。在培養(yǎng)的第0、12 h、24 h、36 h、48 h、72 h采集土壤樣品，測定土壤中殘留的DBP量。土壤中殘留的DBP的提取和測定參照Cheng等[17]的方法，回收率為82.5%～106.1%，滿足微量分析的要求。用OriginPro 2015軟件擬合土壤中殘留DBP的動(dòng)態(tài)曲線：Ct=C0e-kt，式中，Ct(mg/kg)為t(h)時(shí)土壤中的DBP殘留量，C0(mg/kg)為土壤中初始的DBP含量，k(d-1)為降解速率常數(shù)，e為數(shù)學(xué)常數(shù)。DBP降解半衰期采用公式t1/2=ln2/k進(jìn)行計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同DBP污染方式對土壤細(xì)菌群落α多樣性的影響

對不同DBP污染方式下的土壤細(xì)菌群落進(jìn)行α多樣性分析。由表2可以看出，在黃棕壤中，細(xì)菌群落多樣性指數(shù)(Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù))、豐富度指數(shù)(Ace指數(shù)、Chao指數(shù))和均勻度指數(shù)(Heip指數(shù)、Smith-Wilson指數(shù))在不同DBP污染方式下與對照間均無顯著差異，表明高劑量DBP單次污染處理、低劑量DBP累積污染處理對黃棕壤微生物群落多樣性的影響較小。在不同DBP污染方式下，紅壤的細(xì)菌群落多樣性指數(shù)、均勻度指數(shù)與對照間均無顯著差異，而在高劑量DBP單次污染處理下，細(xì)菌群落的豐富度指數(shù)較對照顯著降低(P<0.05)。由此可見，高劑量DBP單次污染處理對紅壤細(xì)菌群落的豐富度有顯著影響，而低劑量DBP累積污染處理對紅壤細(xì)菌多樣性、豐富度、均勻度均無顯著影響?？傮w上看，土壤細(xì)菌多樣性對不同DBP污染方式的響應(yīng)較不敏感。

表2 不同鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)污染方式下土壤細(xì)菌群落的α多樣性

2.2 不同DBP污染方式對土壤細(xì)菌群落β多樣性的影響

在屬分類水平上對不同DBP污染方式處理組的土壤細(xì)菌群落β多樣性進(jìn)行主坐標(biāo)分析(PCoA)。由圖1可以看出，紅壤中PC1、PC2的貢獻(xiàn)率分別為80.59%、7.71%，二者的累積貢獻(xiàn)率為88.30%；黃棕壤中PC1、PC2的貢獻(xiàn)率分別為44.44%、17.31%，二者的累積貢獻(xiàn)率為61.75%。由此可見，PC1、PC2這2個(gè)主成分可以解釋紅壤、黃棕壤細(xì)菌群落組成的主要變異度。在不同污染方式處理下，土壤細(xì)菌群落在PC1、PC2組成的二維平面上可以明顯分開，表明不同DBP污染方式對紅壤、黃棕壤細(xì)菌群落有明顯影響。

CK：對照；S：高劑量DBP單次污染處理；R：低劑量DBP累積污染處理。

為了進(jìn)一步檢驗(yàn)不同DBP污染方式處理下土壤細(xì)菌群落間的差異顯著性，在屬分類水平上對不同DBP污染方式處理組的土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行組間相似性分析(Analysis of similarities, Anosim)，結(jié)果表明，黃棕壤、紅壤中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的組間差異(R值)為0.49～1.00(表3)。R值越接近1.00表示組間差異越大。與對照相比，不同DBP污染方式對黃棕壤、紅壤中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)均產(chǎn)生了較為明顯的影響。其中，黃棕壤中低劑量DBP累積污染處理組與對照組之間的R值(0.74)高于高劑量DBP單次污染處理組與對照組之間的R值(0.56)，表明低劑量DBP累積污染處理對黃棕壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成的影響大于高劑量DBP單次污染處理。紅壤中高劑量DBP單次污染處理組與對照組之間的R值(1.00)大于低劑量DBP累積污染處理組與對照組之間的R值(0.49)，表明高劑量DBP單次污染處理對紅壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成的影響大于低劑量DBP累積污染處理。紅壤中高劑量DBP單次污染處理組與對照之間的R值顯著大于黃棕壤中的相應(yīng)R值，表明高劑量DBP單次污染處理對紅壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成的影響大于黃棕壤。

表3 不同鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)污染方式下土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的組間差異

進(jìn)一步通過組間的差異顯著性檢驗(yàn)，篩選出不同處理間群落相對豐度均存在顯著差異(P<0.05)的優(yōu)勢菌屬。由圖2可以看出，與對照相比，黃棕壤中2種DBP污染方式均明顯降低了赭黃嗜鹽囊菌屬、硝化螺菌屬、不動(dòng)桿菌屬、Parasegetibacter屬和Nordella屬細(xì)菌群落的相對豐度，均明顯提高了土壤紅桿菌屬、Iamia屬和Conexibacter屬細(xì)菌群落的相對豐度。與對照和高劑量DBP單次污染處理相比，低劑量DBP累積污染處理明顯提高了類諾卡氏菌屬、氣微菌屬、土壤紅桿菌屬、Iamia屬和Conexibacter屬細(xì)菌群落的相對豐度。與對照和低劑量DBP累積污染處理相比，高劑量DBP單次污染處理明顯降低了類諾卡氏菌屬、氣微菌屬細(xì)菌的相對豐度。

CK：對照；S：高劑量DBP單次污染處理；R：低劑量DBP累積污染處理。*表示與CK間差異顯著(0.01

由圖3可以看出，與對照相比，低劑量DBP累積污染處理明顯提高了紅壤中慢生根瘤菌屬、Amycolatopsis屬細(xì)菌的相對豐度，高劑量DBP單次污染處理明顯提高了紅壤中慢生根瘤菌屬、鞘氨醇單胞菌屬細(xì)菌的相對豐度，明顯降低了兩面神菌屬、馬杜拉放線菌屬、Ramlibacter、Conexibacter、Marmoricola、Actinospica和Kutzneria屬細(xì)菌的相對豐度。在低劑量DBP累積污染處理中，紅壤中兩面神菌屬、馬杜拉放線菌屬、Ramlibacter、Amycolatopsis、Marmoricola、Actinospica和Kutzneria屬細(xì)菌的相對豐度明顯高于高劑量DBP單次污染處理，慢生根瘤菌屬、鞘氨醇單胞菌屬細(xì)菌的相對豐度明顯低于高劑量DBP單次污染處理。

CK：對照；S：高劑量DBP單次污染；R：低劑量DBP累積污染。*表示與CK間差異顯著(0.01

2.3 不同DBP污染方式處理后土壤中DBP殘留情況

用不同DBP污染方式處理161 d后，高劑量單次污染處理下的紅壤、黃棕壤中DBP殘留量分別為0.36 mg/kg、0.42 mg/kg，低劑量累積污染處理下的紅壤、黃棕壤中DBP殘留量分別為0.21 mg/kg、0.33 mg/kg。說明在不同DBP污染方式處理過程中，低劑量(每次1 mg/kg)累積污染方式更有利于DBP的降解。

2.4 不同DBP污染方式處理后的土壤降解DBP的能力

如圖4所示，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，滅菌土壤中的DBP含量均略有降低，而在未滅菌土壤中均大幅降低，表明土壤中的微生物在DBP降解中起主導(dǎo)作用。由圖4還可以看出，不同污染方式明顯影響了后續(xù)進(jìn)入土壤中DBP的降解。與對照相比，培養(yǎng)72 h后，紅壤中低劑量DBP累積污染處理、高劑量DBP單次污染處理的DBP殘留量分別減少了72.65%、34.00%，黃棕壤中低劑量DBP累積污染處理、高劑量DBP單次污染處理的DBP殘留量分別減少了41.22%、36.08%。在紅壤中，2種污染方式間土壤中的DBP的殘留量在培養(yǎng)12～72 h均有較大差異，而在黃棕壤中，僅在培養(yǎng)12 h時(shí)2種污染方式間土壤中DBP殘留量之間差異較明顯。從表4可以看出，與對照相比，低劑量DBP累積污染處理、高劑量DBP單次污染處理均明顯降低了DBP的降解半衰期，提高了土壤對后續(xù)DBP污染的降解能力。在黃棕壤中，高劑量DBP單次污染處理DBP的降解半衰期比對照組減少了46.15%，低劑量DBP累積污染處理的DBP降解半衰期比對照減少了61.54%。在紅壤中，高劑量DBP單次污染處理的DBP降解半衰期比對照減少了41.11%，低劑量DBP累積污染處理的DBP降解半衰期比對照減少了86.56%。與高劑量DBP單次污染處理相比，低劑量DBP累積污染處理的紅壤、黃棕壤對后續(xù)進(jìn)入土壤中的DBP降解半衰期分別縮短了77.18%、28.57%，表明低劑量累積污染處理在提高土壤對DBP的降解能力上具有更強(qiáng)的作用。

CK：對照；S：高劑量DBP單次污染；R：低劑量DBP累積污染。

表4 不同污染方式處理后鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)在2種土壤中的降解半衰期

3 討論

與對照相比，低劑量DBP累積污染處理對紅壤、黃棕壤的微生物多樣性指數(shù)、均勻度指數(shù)和豐富度指數(shù)均無明顯影響，這可能與低劑量DBP進(jìn)入土壤后能與土壤充分作用，并被土壤迅速吸附和降解有關(guān)[12,18]。高劑量DBP單次污染處理顯著降低了紅壤中細(xì)菌群落的豐富度指數(shù)，但對黃棕壤中細(xì)菌群落多樣性指數(shù)、豐富度指數(shù)和均勻度指數(shù)均無顯著影響。同時(shí)，高劑量DBP單次污染處理對紅壤中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成的影響大于黃棕壤。有研究發(fā)現(xiàn)，土壤有機(jī)質(zhì)含量越低，對DBP的吸附作用越弱，從而增強(qiáng)了DBP的生物有效性和生態(tài)毒性[17,19]。在本研究中，紅壤的有機(jī)質(zhì)含量遠(yuǎn)低于黃棕壤，因而紅壤中DBP的生物有效性和生態(tài)毒性更高，這可能是導(dǎo)致高劑量DBP單次污染對紅壤細(xì)菌群落豐富度指數(shù)、細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成影響較大的一個(gè)重要原因。此外，在微生物數(shù)量多、種類豐富的土壤中，土壤生態(tài)系統(tǒng)的抗逆性更強(qiáng)[20]。紅壤中微生物量碳、Shannon多樣性指數(shù)明顯低于黃棕壤，表明紅壤中的微生物數(shù)量更少，多樣性更低，對DBP污染脅迫的抵御能力更差，這可能是高劑量DBP單次污染對紅壤中微生物多樣性、細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成影響較大的又一個(gè)重要原因。

在土壤細(xì)菌豐度方面，與對照相比，2種污染處理均顯著改變了黃棕壤中硝化螺菌屬、紅壤中慢生根瘤菌屬細(xì)菌的相對豐度。硝化螺菌屬細(xì)菌是參與土壤硝化作用的關(guān)鍵微生物[21]，而土壤慢生根瘤菌屬細(xì)菌被認(rèn)為是固氮過程中的關(guān)鍵菌，在氮素循環(huán)中起著重要作用[22]。因此可見，在本研究中的2種污染方式下，DBP均對土壤氮素循環(huán)功能產(chǎn)生了擾動(dòng)，這與Wang等[6-7]的研究結(jié)果一致。此外，在高劑量DBP單次污染方式下，由于高含量DBP未經(jīng)充分老化，黃棕壤中類諾卡氏菌屬、氣微菌屬細(xì)菌的相對豐度，以及紅壤中Ramlibacter、Marmoricola、Actinospica、Kutzneria等菌屬細(xì)菌的相對豐度較其他組明顯降低。據(jù)報(bào)道，上述幾類菌屬在土壤有機(jī)物分解、拮抗病原菌和促進(jìn)植物生長等方面具有重要作用[23-28]。在低劑量DBP累積污染方式下，黃棕壤中類諾卡氏菌屬、氣微菌屬、土壤紅桿菌屬、Conexibacter等菌屬細(xì)菌以及紅壤中Amycolatopsis屬細(xì)菌的相對豐度較其他組明顯提高，這幾類菌屬與土壤有機(jī)物分解、拮抗病原菌等功能相關(guān)[23-24,29-31]。由此可見，在本研究的2種污染方式下，DBP對土壤中具有氮素循環(huán)、有機(jī)物分解、拮抗病原菌和植物促生等重要功能的細(xì)菌群落產(chǎn)生了明顯擾動(dòng)，但土壤中承擔(dān)同一功能的微生物種類眾多[32]，受到測序技術(shù)的限制，本研究僅得到了部分功能菌群變化的信息，關(guān)于DBP對土壤相關(guān)菌群功能的影響還需進(jìn)一步研究。

在土壤中DBP的降解方面，土壤微生物被認(rèn)為在土壤中DBP的降解過程中起關(guān)鍵作用[33]。已有研究發(fā)現(xiàn)，DBP污染可造成DBP降解菌在土壤中富集以及土壤中DBP降解基因豐度的增加[7-8]，進(jìn)而提高土壤對DBP污染的降解能力。在本研究中，與對照相比，2種污染方式提高了黃棕壤中土壤紅桿菌屬、Conexibacter屬細(xì)菌的相對豐度以及紅壤中鞘氨醇單胞菌屬細(xì)菌的相對豐度，它們均與有機(jī)污染物的降解密切相關(guān)[29-30,33]，這可能是2種污染處理明顯提高黃棕壤、紅壤對DBP污染降解能力的原因。對比2種污染方式可以發(fā)現(xiàn)，低劑量DBP累積污染處理對提高土壤DBP降解能力具有更強(qiáng)的作用。在低劑量DBP累積污染處理下，紅壤中的Amycolatopsis屬[31]細(xì)菌與黃棕壤中的類諾卡氏菌屬[23]、氣微菌屬[24]、土壤紅桿菌屬[29]細(xì)菌等與土壤有機(jī)污染物降解相關(guān)的菌屬細(xì)菌受到了誘導(dǎo)，群落的相對豐度較對照顯著增加。由此可見，低劑量DBP累積污染方式對土壤中DBP降解的促進(jìn)作用更強(qiáng)，可能與DBP以低劑量累積的方式進(jìn)入土壤，對土壤中具有DBP降解能力的微生物產(chǎn)生了較強(qiáng)的誘導(dǎo)作用有關(guān)[34]。

4 結(jié)論

土壤細(xì)菌群落α多樣性對不同DBP污染方式的響應(yīng)較不敏感，僅高劑量DBP單次污染處理顯著降低紅壤細(xì)菌群落豐富度指數(shù)，其余處理的土壤細(xì)菌多樣性指數(shù)、豐富度指數(shù)和均勻度指數(shù)與對照相比均無顯著差異。土壤細(xì)菌群落β多樣性對不同DBP污染方式的響應(yīng)敏感，紅壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成受高劑量DBP單次污染處理的影響較大，黃棕壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成受低劑量DBP累積污染處理的影響較大。2種DBP污染方式處理對紅壤、黃棕壤中部分具有氮素循環(huán)、有機(jī)物分解、拮抗病原菌和植物促生等重要功能的細(xì)菌群落產(chǎn)生了明顯擾動(dòng)。本研究中的2種污染方式處理后明顯提高了紅壤、黃棕壤對DBP污染的降解能力。與高劑量DBP單次污染方式處理后的土壤相比，低劑量DBP累積污染方式處理后的土壤更大幅度地縮短了土壤中DBP降解半衰期。