周麗貞

（麗江師范高等?？茖W(xué)校，云南 麗江 674100）

植物傳粉包括了自花傳粉和異花傳粉，其中異花傳粉是有花植物最普遍的傳粉方式[1]。對(duì)于植物傳粉的研究包括了花粉和柱頭生物學(xué)、蟲(chóng)媒授粉的演化、多樣性的地理趨勢(shì)、植物-授粉者的對(duì)應(yīng)關(guān)系等[2]，開(kāi)展傳粉生物學(xué)研究在探索自然、生物資源利用、農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)和生物多樣性保護(hù)等實(shí)踐上有重要意義[3]。雞肉參（Incarvillea mairei(Levl.)Grierson）屬于紫葳科（Bignoniaceae）角蒿屬植物，為喜馬拉雅-橫斷山脈的多年生草本植物[4]，花冠較大，顏色為紫紅色，根為肉質(zhì)根，具有一定的觀賞性與藥用價(jià)值[5-6]，研究其傳粉機(jī)制對(duì)引種栽培、原生地資源保護(hù)利用等具有重要意義。在自然界中，花粉與柱頭的結(jié)構(gòu)演變出紛繁復(fù)雜的傳粉適應(yīng)性和傳粉策略[7]，在這些適應(yīng)性中，有一些是通過(guò)柱頭的運(yùn)動(dòng)和形態(tài)變化來(lái)適應(yīng)惡劣環(huán)境和授粉昆蟲(chóng)稀少的限制，以提高異花授粉的幾率[8]。雞肉參具有敏感性二裂片柱頭，這類柱頭在物理性碰觸后會(huì)閉合，不滿足授粉要求則又能夠再次打開(kāi)，閉合速度因種而異；如果由于授粉而閉合柱頭，多數(shù)不再打開(kāi)[9-11]。一些研究指出這類柱頭的運(yùn)動(dòng)可能是為了避免或延遲自花授粉[12-13]。研究通過(guò)對(duì)雞肉參雌蕊及蜜腺的微觀觀察，以及花粉-胚珠數(shù)（P/O）比值，蕾期、半開(kāi)期、平展期、凋謝期的柱頭運(yùn)動(dòng)性，旨在探索雞肉參潛在的傳粉機(jī)制和二裂片柱頭運(yùn)動(dòng)的意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

雞肉參新鮮花朵和雌蕊不同部位樣品取自麗江甘海子，海拔3020 m，離麗江師范高等?？茖W(xué)校實(shí)驗(yàn)室約31km。樣品花粉-胚珠數(shù)比值實(shí)驗(yàn)、體式解剖鏡觀察、固定液配制、保存等均在師專實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，后期處理和掃描電鏡觀察在中科院昆明植物所完成，柱頭運(yùn)動(dòng)性實(shí)驗(yàn)在甘海子進(jìn)行。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 解剖鏡實(shí)驗(yàn)

取新鮮花朵裝入保鮮袋，帶回實(shí)驗(yàn)室用體式解剖鏡解剖觀察。

1.2.2 掃描電鏡實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 樣品固定

樣品的固定采用了磷酸緩沖戊二醛固定液，戊二醛終濃度為2.5%。磷酸緩沖液分為甲液和乙液，甲液為0.2 mol/L磷酸氫二鈉溶液，乙液為0.2 mol/L磷酸二氫鈉溶液。采樣當(dāng)天取24.5 mL的甲液加入25.5 mL乙液混勻，即為0.2 mol/L的磷酸緩沖液（pH=6.8），并加入10 mL 25%戊二醛水溶液，用蒸餾水定容至100 mL混勻，分裝入5 mL指型試管待用。在采樣過(guò)程中使用了冰袋和泡沫箱，以減少溫度的影響。

樣品根據(jù)開(kāi)花程度，分為蕾期、半開(kāi)期、平展期、凋謝期四個(gè)時(shí)期分開(kāi)采樣，并且每個(gè)時(shí)期分別以柱頭、子房、子房基部三部分取樣。取樣時(shí)，用雙面刀片迅速切取樣品放入事先標(biāo)記的裝有固定液的試管中，蓋好蓋子并放回泡沫箱中。待所有樣品取好后，將樣品帶回師專實(shí)驗(yàn)室，以第一個(gè)樣品采樣開(kāi)始計(jì)時(shí)至6 h，依次將所有樣品更換新鮮配制的磷酸緩沖戊二醛固定液，放入4℃冰箱保存。后期樣品也采用冰袋與泡沫箱運(yùn)送。

1.2.2.2.樣品處理和觀察

樣品采用梯度濃度的乙醇溶液脫水，其中初始處理濃度為30%，處理2 h后轉(zhuǎn)入45%和60%乙醇溶液中，處理時(shí)間均為30 min，然后轉(zhuǎn)入70%的乙醇溶液中處理過(guò)夜，再依次轉(zhuǎn)入80%、90%乙醇溶液中，每階梯停留時(shí)間為15 min，最后以無(wú)水乙醇處理3次，每次處理時(shí)間10 min。將脫水后的樣品進(jìn)行臨界點(diǎn)干燥，上臺(tái)并進(jìn)行掃描電鏡觀察與拍照。

1.2.3 花粉及P/O值測(cè)定

根據(jù)孫鵬等[14]的方法，隨機(jī)取10個(gè)花蕾，分別取其花藥，用2 mL 0.1mol·L-1HCl溶液在60℃恒溫水浴中處理1 h，吸5μL于載玻片上，滴1μL I2-IK溶液觀察計(jì)數(shù)[15]。重復(fù)取樣觀察6次，其中染色深黑色和淺黃色的花粉粒分開(kāi)記錄。取子房在解剖鏡下觀察并記錄胚珠數(shù)。

1.2.4 柱頭運(yùn)動(dòng)行為觀察

分別根據(jù)花開(kāi)程度，對(duì)蕾期、半開(kāi)期、平展期、凋謝期的花朵進(jìn)行柱頭運(yùn)動(dòng)性實(shí)驗(yàn)，對(duì)柱頭裂片內(nèi)側(cè)進(jìn)行物理性碰觸，同時(shí)記錄完全閉合時(shí)間以及閉合后再次打開(kāi)的時(shí)間，并對(duì)觀測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行Excel統(tǒng)計(jì)分析。蕾期需要用刀片從花冠1/2處橫切，將上部花冠輕輕的垂直取下以便觀察柱頭。

2 結(jié)果與分析

2.1 解剖鏡觀察結(jié)果

通過(guò)解剖鏡觀察，雞肉參柱頭等二裂，淡黃色，內(nèi)具絨毛，由花柱與子房相連。子房綠色，在子房基部具有環(huán)狀凸起，子房和基部環(huán)狀凸起上均發(fā)現(xiàn)有液體（圖1A-B），表明雞肉參具有環(huán)狀蜜腺，且子房上也可能分布有蜜腺，并以花蜜吸引授粉者傳粉，但通過(guò)觀察發(fā)現(xiàn)泌蜜量并不多。

圖1.解剖鏡圖片（4×）（A：子房基部的環(huán)狀蜜腺；B:正在分泌花蜜的子房外壁)。

2.2 掃描電鏡觀察結(jié)果

2.2.1 柱頭結(jié)構(gòu)

掃描電鏡視野下，雞肉參柱頭裂片外部并不光滑，外表皮細(xì)胞特化為具有縱向皺褶紋路的表皮毛，在130倍數(shù)下觀察，如鱗片狀覆蓋在柱頭裂片外側(cè)，其間散布有特化的氣孔和蘑菇狀細(xì)胞。氣孔與子房基部環(huán)狀蜜腺的泌蜜孔相似，蘑菇狀細(xì)胞與子房外部的相似（圖2A）。

柱頭裂片內(nèi)外側(cè)差別巨大，與外側(cè)不同，內(nèi)側(cè)密布指狀表皮毛（圖2A）。表皮毛自裂片邊緣一直延展至與花柱連接處，靠外的指狀表皮毛較細(xì)小，向心的指狀表皮毛較粗大，當(dāng)花粉粒落在裂片內(nèi)側(cè)指狀表皮毛上，花粉粒萌發(fā)，花粉管自表皮毛細(xì)胞進(jìn)入花柱頭（圖2B）。

2.2.2 子房外部結(jié)構(gòu)

子房表皮細(xì)胞排列緊密，無(wú)氣孔狀泌蜜孔分布，但散布有蘑菇狀細(xì)胞，多數(shù)為飽滿的近圓球體，部分皺縮癟塌（圖2C-D）。結(jié)合解剖鏡觀察結(jié)果，推測(cè)這一類細(xì)胞可能是一類分泌細(xì)胞，具有分泌花蜜的能力。

圖2.柱頭和子房超顯微結(jié)構(gòu)。（A：柱頭內(nèi)外部結(jié)構(gòu)對(duì)比（120×）；B：花粉管從柱頭內(nèi)側(cè)指狀細(xì)胞中進(jìn)入（1.00K×）；C：子房表皮的顯微結(jié)構(gòu)（120×）；D：子房上飽滿的蘑菇狀細(xì)胞（1.00K×）。

2.2.3 蜜腺

通過(guò)掃描電鏡對(duì)子房基部的環(huán)狀蜜腺進(jìn)一步觀察，發(fā)現(xiàn)上面分布有氣孔狀泌蜜孔。根據(jù)蕾期、半開(kāi)期、平展期、凋謝期四個(gè)時(shí)期采集的樣品發(fā)現(xiàn)，蕾期泌蜜孔緊閉（圖3A），花朵半開(kāi)至平展期泌蜜孔打開(kāi)（圖3B-C），凋謝期泌蜜孔被一些物質(zhì)填塞（圖3D）而失去開(kāi)合和分泌物質(zhì)的能力。

圖3.不同開(kāi)花時(shí)期的泌蜜孔變化（2.00K×）（A.蕾期；B.半開(kāi)期；C.平展期；D.凋謝期）

2.3 花粉-胚珠比（P/O）及蕾期花粉活力

通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析，雞肉參單花總花粉粒為72300±4837.8064，胚珠數(shù)136.3684±5.6716，P/O約為530，根據(jù)分類，雞肉參屬于兼性異交型繁殖系統(tǒng)[16]。通過(guò)I2-KI染色，其中深黑色花粉粒為70340±5130.9224，占總花粉數(shù)的97.11%；淺黃色花粉粒1960±1043.6971，占總花分?jǐn)?shù)的2.89%，說(shuō)明在蕾期，大量花粉就已經(jīng)成熟。

2.4 柱頭的運(yùn)動(dòng)性

在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，蕾期柱頭并未打開(kāi)，在花冠取下后1h以上仍然閉合，凋謝期的柱頭則保持閉合或打開(kāi)而失去運(yùn)動(dòng)能力，僅半開(kāi)期和盛開(kāi)期具有運(yùn)動(dòng)能力，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示。

表1 柱頭二裂片運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在物理碰觸下，半開(kāi)期柱頭的閉合時(shí)間比盛開(kāi)期柱頭閉合的時(shí)間短，且兩者具有顯著性差異P=0.0135（＜0.05，df=9,10），表明柱頭在半開(kāi)期比盛開(kāi)期對(duì)碰觸更為敏感；而再次打開(kāi)的時(shí)間，兩者之間沒(méi)有顯著性差異P=0.1407（＞0.05，df=9,10），表明在半開(kāi)至盛開(kāi)的時(shí)候，開(kāi)花程度對(duì)柱頭閉合后再次打開(kāi)沒(méi)有影響。

3 討論

開(kāi)花植物能夠通過(guò)花內(nèi)蜜腺分泌具有糖分的液體吸引并反饋給傳粉昆蟲(chóng)，從而實(shí)現(xiàn)蟲(chóng)媒植物不同花朵之間的傳粉，分泌花蜜的通道往往是蜜腺上特化的氣孔，又稱為泌蜜孔[17-18]。泌蜜孔一般分布于蜜腺上，在傳粉昆蟲(chóng)采食花蜜的時(shí)候，蟲(chóng)體的絨毛接觸花粉和柱頭而得以傳粉。通過(guò)體式解剖鏡和掃描電鏡的觀察，雞肉參蜜腺為子房基部的環(huán)狀蜜腺，上面分布有泌蜜孔，且隨著花朵的開(kāi)放與凋謝，泌蜜孔表現(xiàn)為：閉合-開(kāi)放-被物質(zhì)填塞而失去分泌花蜜能力的變化。

除了子房基部的環(huán)狀蜜腺，在二裂片柱頭外側(cè)也發(fā)現(xiàn)了類似泌蜜孔的結(jié)構(gòu)，子房與柱頭則還存在蘑菇狀細(xì)胞，這些可能與泌蜜和吸引昆蟲(chóng)有關(guān)，如建蘭花蜜的分泌是經(jīng)由表皮毛分泌的[19]?；凼侵匾膫鞣鄯答佄?，泌蜜量和花蜜的甜度受到花的性別、移出量等影響[20-21]，在一些植物的研究中則發(fā)現(xiàn)未被采食的花蜜會(huì)被再吸收利用[22-24]。植物分泌花蜜需要消耗大量的能量，它們往往需要在因花蜜產(chǎn)量增加而產(chǎn)生更多的受精種子和成本之間進(jìn)行權(quán)衡[25]。結(jié)合體式顯微鏡觀察，子房外壁有液體分泌，推測(cè)子房上的花蜜是經(jīng)由蘑菇狀凸起分泌而出，當(dāng)凸起細(xì)胞的水分含量增加，細(xì)胞變得鼓脹飽滿，細(xì)胞滲透壓增加（圖2D），在內(nèi)部壓力和傳粉昆蟲(chóng)給予的外部壓力（如攀爬、舔舐等）共同作用下，帶有糖分的液體從凸起基部的縫隙中滲出以反饋給傳粉者，當(dāng)花蜜分泌到一定量時(shí)，凸起細(xì)胞皺縮（圖2C）。如此，在沒(méi)有授粉昆蟲(chóng)訪問(wèn)時(shí)，可以避免多余的花蜜分泌，減少能量的消耗。

一般認(rèn)為，高海拔植物由于授粉昆蟲(chóng)的限制而更多的進(jìn)行自花授粉，但對(duì)Eritrichium nanum的研究表明，自花授粉隨著海拔的增加而降低[26]。根據(jù)P/O（≈530）表明雞肉參為兼性異交型植物，且蕾期花粉已經(jīng)基本成熟，但二裂片柱頭沒(méi)有打開(kāi)，在半開(kāi)期，柱頭更為敏感，而隨著盛開(kāi)到凋謝，柱頭運(yùn)動(dòng)能力降低直至失去運(yùn)動(dòng)能力，這可能是雞肉參在高海拔的環(huán)境條件下為了最大限度保證異花授粉的原因。

4 結(jié)論

雞肉參屬于兼性異交型植物，為提高異花傳粉的幾率，表現(xiàn)出蕾期花粉粒多數(shù)成熟，而二裂片柱頭閉合，半開(kāi)期裂片觸碰閉合速度比盛開(kāi)期快等特點(diǎn)?；凼请u肉參主要的傳粉反饋物，雌蕊基部具有環(huán)狀蜜腺，上面分布有氣孔狀泌蜜孔，從蕾期至凋謝期，泌蜜孔表現(xiàn)出“閉合-開(kāi)放-被物質(zhì)填塞而失去分泌花蜜能力”的變化。雌蕊柱頭亦有類似泌蜜孔的結(jié)構(gòu)分布，而柱頭外側(cè)和子房上則分布有蘑菇狀特化細(xì)胞，并且子房具有分泌花蜜的能力。綜合以上分析，雞肉參由于受到高山環(huán)境傳粉昆蟲(chóng)稀少的限制，為提高異花傳粉幾率，減少自身能量消耗，演化出了特有的花部結(jié)構(gòu)和訪花昆蟲(chóng)之間的協(xié)作機(jī)制。

感謝：在此對(duì)谷志佳老師和趙文正老師以及在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中熱忱幫助我的老師、朋友和同事表示感謝。