鄭晨萌,劉 星**,張 影,任秀娟,陳碧華,王 菲,申長衛(wèi),吳大付

(1.河南科技學院資源與環(huán)境學院/河南省生物藥肥研發(fā)與協(xié)同應用工程研究中心 新鄉(xiāng) 453003;2.河南科技學院園藝園林學院 新鄉(xiāng) 453003)

中國是全世界最大的設施蔬菜生產(chǎn)國,設施蔬菜栽培是農(nóng)民增收的主渠道之一,確保設施蔬菜行業(yè)的可持續(xù)發(fā)展對于促進農(nóng)戶持續(xù)增收和實現(xiàn)鄉(xiāng)村振興戰(zhàn)略目標具有重要意義。然而,隨著設施蔬菜生產(chǎn)區(qū)域集中化和種植規(guī)模擴大,長期集約化連作種植帶來的土傳病害問題已成為限制行業(yè)健康發(fā)展的重要瓶頸[1-2]。土壤是土傳致病菌棲居的大本營,病原菌在條件適宜時以土壤為媒介浸染作物根系導致病害發(fā)生。闡明發(fā)病土壤理化、生化和生物學性質與健康土壤的差異是切斷病害發(fā)生鏈條和實現(xiàn)障礙土壤修復改良的前提。

根際是作物-土壤-微生物互作的熱區(qū),這里既是土傳病害發(fā)生發(fā)展的主要場所,也是作物抵御土傳病原菌侵襲的關鍵防線[3]。連作條件下作物根際微生物組退化被認為是土傳病害發(fā)生的重要原因[4-5]。大量研究證實,與健康植株相比,病株根際土壤微生物多樣性更低、群落結構失衡,有益(生防)微生物比例減少而土傳致病菌比例增加,且微生物種間互作強度和群落穩(wěn)定性(抵抗力)變差,這些都利于致病菌的入侵[6-11]。然而,已有研究多是圍繞根際土壤總的微生物群落(即細菌和真菌)變化展開,對功能微生物(組)關注較少。土壤微生物具有高度的功能多樣性,不同的土壤生物學過程(生態(tài)功能)常常由專一或少數(shù)的功能(組)微生物驅動,目前尚不清楚發(fā)病植株根際土壤一些關鍵的功能微生物群落的多樣性和結構是否也與健康植株存在差別。

硝化過程是土壤氮循環(huán)的核心環(huán)節(jié),決定著土壤氮素有效性,對氮素高效利用和作物高產(chǎn)優(yōu)質至關重要[12-13]。硝化過程經(jīng)由兩步完成:NH3首先經(jīng)氨氧化細菌(ammonia-oxidizing bacteria,AOB)和氨氧化古菌(ammonia-oxidizing archaea,AOA)氧化為NO2—,而后亞硝酸鹽氧化細菌(nitrite-oxidizing bacteria,NOB)將NO2

—氧化為NO3—[14]。我們前期發(fā)現(xiàn),設施連作枯萎病黃瓜根際土壤氨氧化能力顯著低于健株,這是由于病株根際AOB 群落中Nitrosospira briensisClade 相對豐度降低導致[15-16]。但病株根際土壤亞硝酸鹽氧化能力和NOB 群落特征仍不明確,這限制了對病害土壤硝化過程通路和相關微生物生態(tài)學機制的理解。目前已知的NOB 隸屬于7 個細菌屬,其硝化桿菌屬(Nitrobacter)和硝化螺菌屬(Nitrospira)在土壤亞硝酸鹽氧化中起著主導作用[17-19]。鑒于此,我們以設施連作枯萎病黃瓜(Cucumis sativus)為研究對象,以同一地塊的健康植株為對照,結合熒光定量PCR 和高通量擴增子測序方法,評估病株和健株間根際土壤Nitrobacter和Nitrospira豐度和群落多樣性及結構差異,旨在增加對連作發(fā)病土壤關鍵生物學功能及其微生態(tài)過程的認識,為障礙土壤修復改良提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)域概況

研究區(qū)域位于河南省新鄉(xiāng)市牧野區(qū)牧野鎮(zhèn)(35°21′12″N,113°55′2″E,平均海拔約56 m)。供試土壤為壤質潮土。牧野鎮(zhèn)是河南省設施蔬菜種植面積最大的鄉(xiāng)鎮(zhèn),也是豫北地區(qū)重要的設施蔬菜種植基地,主要栽培黃瓜、番茄(Lycopersicum esculentum)、辣椒(Capsicum annuum)和茄子(Solanum melongena)等作物,種植結構相對單一,且大多處于長期連續(xù)種植狀態(tài),連作障礙問題突出,枯萎病、黃萎病和青枯病等土傳病害較為普遍。該區(qū)地處黃河中下游,水資源豐富,土層深厚,土壤肥沃,屬于溫帶大陸性季風氣候,四季分明。年平均降雨量約573.4 mm,多集中在7、8月,平均氣溫約14.1 ℃,全年無霜期約220 d,年均日照時數(shù)約2400 h。

1.2 樣品采集

在試驗區(qū)隨機選取一個具有代表性的設施黃瓜種植地塊,該地塊在2011年以前的種植制度為冬小麥(Triticum aestivum)和夏玉米(Zea mays)輪作,此后轉換為設施黃瓜栽培并延續(xù)至今,已出現(xiàn)明顯的連作障礙問題,枯萎病發(fā)病嚴重且感病植株在大棚內表現(xiàn)出典型的斑塊性分布特征。隨機選擇了4 個枯萎病發(fā)病嚴重的斑塊(樣方),在每個斑塊內隨機選取6 株枯萎病黃瓜植株,用鐵鍬將根部挖出,抖土法采集根際土壤樣品,每株獲得土樣約30 g,6 株病株的根際土壤去除雜物、混合均勻作為一個混合土樣;另外,在每個發(fā)病斑塊周圍隨機選取6 株黃瓜健株利用同樣方法采集根際土樣,并制作混合土壤樣品。最終,本試驗獲得同一地塊內的病株和健株根際混合土壤樣品各4 個,分別代表4 次重復。樣品采集時間為2019年4月20日(春茬黃瓜),此時正處在黃瓜結果期,是植株養(yǎng)分積累和產(chǎn)量形成的關鍵時期,也是當?shù)乜菸≈饕l(fā)生時期。區(qū)內黃瓜每年種植兩茬(春茬和秋茬),詳細的栽培、管理和施肥細節(jié)見本課題組早前報道[16]。每個新鮮的混合土壤樣品置于冰盒帶回實驗室后過1 mm 篩,等分成3 份:一份保存在—80 ℃冰箱用于后續(xù)的分子生物學分析,一份置于室內風干用于測定土壤理化性質,一份立即用于測定土壤礦質氮含量和生化性質。部分土壤理化和生化性質數(shù)據(jù)已在他刊發(fā)表[15],為避免數(shù)據(jù)重復使用,本文不再單獨展示和敘述,僅用于相關性分析。

1.3 土壤亞硝態(tài)氮含量和亞硝酸鹽氧化能力測定

土壤亞硝態(tài)氮采用2 mol·L—1KCl 溶液浸提(水土比5∶1),連續(xù)流動注射分析儀測定含量。土壤亞硝酸鹽氧化潛勢(potential nitrite oxidation rate,PNOR)測定參考Han 等[20]的方法并略有改進:將6 g 的新鮮土樣加入到50 mL 含1 mmol·L—1NaNO2的磷酸鹽緩沖液(Na2HPO40.2 g·L—1,NaH2PO40.2 g·L—1,pH 為7.4),而后于25 ℃下在震蕩培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)24 h,轉速為180 r·min—1。在培養(yǎng)0 h、6 h、12 h、18 h 和24 h 分別取2 mL 土壤懸液,離心(2000 r·min—1)后以N-(1-萘基)-乙二胺作顯色劑,在520 nm 波長下測定NO2—-N濃度。擬合培養(yǎng)液中NO2—-N 消耗量和培養(yǎng)時間的線性關系,土壤PNOR 采用擬合得到的線性方程斜率表示。

1.4 土壤DNA 提取和熒光定量PCR

稱取0.50 g 混勻土壤,采用MOBIO PowerSoil DNA 分離試劑盒,按照產(chǎn)品說明書上的步驟,提取土壤微生物總DNA。DNA 提取質量和純度采用1%瓊脂糖凝膠電泳和分光光度法檢測。提取的微生物總DNA 溶解在50 μL 洗脫緩沖液中并保存于—20 ℃冰箱備用。

采用熒光定量PCR 方法測定土壤中Nitrobacter和Nitrospira的豐度,二者的擴增靶標分別為nxrA(編碼亞硝酸鹽氧化還原酶蛋白A 亞基)和nxrB(編碼亞硝酸鹽氧化還原酶蛋白B 亞基)基因,相應的引物對分別為F1norA/R2norA[21]和nxrB169F/nxrB-638R[22]。實時定量采用ABI 7500 儀器進行,每個土樣重復3 次。PCR 擴增體系(20 μL)如下:16.4 μL ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix,正、反引物各0.8 μL(5 μmol·L—1),2 μL DNA 模板。擴增條件如下:預變性95 ℃ 3 min,95 ℃ 5 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,40 個循環(huán)。擴增產(chǎn)物專一性驗證和標準曲線制備參考Liu 等[18]的方法。nxrA和nxrB基因的擴增效率分別為95.81%和96.68%,標準曲線R2分別為0.9994和0.9998。Nitrobacter和Nitrospira的豐度分別采用每克干土中nxrA和nxrB基因拷貝數(shù)表示。

1.5 高通量擴增子測序和生物信息學分析

采用高通量擴增子測序方法評估黃瓜根際土壤Nitrobacter和Nitrospira的群落結構(Illumina Miseq PE300 平臺)。以土壤微生物總DNA 為模板進行PCR 擴增,擴增靶標分別為nxrA和nxrB基因,所用引物對與熒光定量PCR 相同。采用隨機選取的DNA 模板和不含DNA 模板的陰性對照進行初步試驗以探索最佳的PCR 擴增條件。正式試驗時PCR擴增體系(20 μL)為:4 μL FastPfu Buffer(5×),2 μL dNTPs(2.5 mmol·L—1),0.4 μL TransStart FastPfu DNA Polymerase,0.2 μL Bovine serum albumin,引物各 0.8 μL(5 μmol·L—1),10 ng 模板DNA 和11.2 μL ddH2O。PCR 擴增條件為:95℃預變性3 min,95 ℃ 30 s,55 ℃30 s,72 ℃ 45 s,37 個循環(huán),最后72 ℃延伸10 min,10 ℃保溫。每個樣本均擴增3 次,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗證后將3 次的擴增產(chǎn)物均勻混合,采用Agarose Gel DNA 試劑盒純化,并使用NanoDrop2000 進行定量,最后將各樣本等量的PCR 產(chǎn)物編碼并送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行高通量測序。測序獲得的原始序列已全部上傳至NCBI SRA 數(shù)據(jù)庫(登錄號PRJNA557592)。

參照Lu 等[23]的方法,對高通量測序下機原始序列進行質控過濾和雙端拼接,而后采用QIIME 軟件的標準流程進行生物信息學分析[24]。本研究共獲得183 794 條nxrA基因高質量序列和154 226 條nxrB基因高質量序列,平均到每個土壤樣本分別為22 974和19 278 條序列,序列平均長度分別為283 bp 和453 bp。對獲得的這些高質量序列按照97%的相似度進行可操作分類單元(Operational Taxonomic Units,OTU)聚類,每個OTU 中數(shù)量最多的序列被挑選為代表性序列。利用MEGA 6.0 軟件,將各OTU 代表性序列和早前文獻已報道的參考序列按照最大似然法構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹(Bootstrap 重復抽樣1000 次),根據(jù)進化樹分枝(即基因序列不同的聚類)確定群落組成。nxrA基因參考序列和群落成員命名參照Wertz 等[25]、Poly 等[26]和Attard 等[21]的報道;nxrB基因參考序列和群落成員命名參照Pester 等[22]和Luo 等[27]的報道。所有高質量序列按最小樣本序列數(shù)抽平后進行α 多樣性和β 多樣性分析。應用MOTHUR 軟件計算群落α 多樣性指數(shù);利用Bray-Curtis 距離主坐標分析(PCoA)比較病株和健株間微生物群落結構差異;通過相似度分析(ANOSIM)檢驗處理間微生物群落結構差異的顯著性;采用CANOCO 5.0 軟件對土壤理化性質和微生物群落結構的關系進行冗余分析(RDA),各理化因子的顯著性采用Monte Carlo 檢驗[15]。

1.6 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)計算和圖表繪制在Microsoft Excel 2016 和Sigmaplot 12.0 軟件上進行,處理間差異顯著性比較采用獨立樣本T檢驗(P＜0.05)。圖表中試驗結果采用平均值±標準差來表示(n=4)。不同數(shù)據(jù)間的相關性分析采用常見的一元回歸模型進行(斯皮爾曼線性相關)。微生物豐度采用常用對數(shù)轉換表示。

2 結果與分析

2.1 土壤亞硝態(tài)氮含量、亞硝酸鹽氧化潛勢和亞硝酸鹽氧化微生物豐度

如表1所示,健株和病株根際土壤亞硝態(tài)氮含量無顯著差別,但病株根際亞硝酸鹽硝化潛勢較健株高出約1 倍(P＜0.001)。就不同亞硝酸鹽氧化微生物(nitrite-oxidizing bacteria,NOB)的豐度而言,病株根際Nitrobacter豐度顯著高于健株(P=0.020),但二者的Nitrospira豐度無顯著差異。

表1 黃瓜健康植株(HPR)和感染枯萎病植株(DPR)根際土壤亞硝態(tài)氮含量、亞硝酸鹽氧化潛勢和亞硝酸鹽氧化微生物(NOB)豐度Table 1 Soil NO2—-N contents,potential nitrite-oxidizing rates and nitrite-oxidizing bacteria(NOB)abundances in rhizosphere soil of healthy plants(HPR)and Fusarium wilt-diseased plants(DPR)of cucumber

2.2 土壤Nitrobacter 的群落多樣性和組成結構

如表2所示,健株和病株根際間Nitrobacter群落α多樣性無顯著差異。然而,健株和病株Nitrobacter群落組成差異明顯,各有39 個非共享OTU(圖1a)。PCoA 分析和ANOSIM 測試進一步證明,二者間Nitrobacter群落結構呈現(xiàn)顯著差異(P＜0.05)(圖1c)。

圖1 黃瓜健康植株(HPR)和感染枯萎病植株(DPR)根際土壤硝化桿菌(Nitrobacter)群落組成(a)和結構(c)以及硝化螺菌(Nitrospira)群落組成(b)和結構(d)Fig.1 Community composition(a)and structure(c)of Nitrobacter as well as community composition(b)and structure(d)of Nitrospira in rhizosphere soil of healthy plants(HPR)and Fusarium wilt-diseased plants(DPR)of cucumber

表2 黃瓜健康植株(HPR)和感染枯萎病植株(DPR)根際土壤硝化桿菌(Nitrobacter)和硝化螺菌(Nitrospira)群落α 多樣性指數(shù)Table 2 The α diversity indexes of Nitrobacter and Nitrospira communities in rhizosphere soil of healthy plants(HPR)and Fusarium wilt-diseased plants(DPR)of cucumber

通過序列聚類,Nitrobacter群落中共獲得185 個OTU,其中有34 個OTU 的平均相對豐度超過1%,這34 個OTU 共占據(jù)約95%的總回收序列。將這些優(yōu)勢OTU 的代表性序列和前人已驗證報道的Nitrobacter nxrA基因參考序列一起構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹(圖2),發(fā)現(xiàn)黃瓜根際Nitrobacter群落成員包括

圖2 基于OTU 代表性序列和參考序列的Nitrobacter nxrA 基因系統(tǒng)進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of Nitrobacter nxrA genes based on representatives of OTUs detected in this study and representative sequences of major Clades

NitrobacterCluster 3、NitrobacterCluster 3-like、NitrobacterCluster 2b、NitrobacterCluster 4、NitrobacterCluster 6、NitrobacterCluster 1 和NitrobacterCluster 5。對這些群落成員統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn),Nitrobac- terCluster 2b 平均相對豐度在健株根際顯著高于病株根際,而NitrobacterCluster 6 和NitrobacterCluster 5 則與之相反(P＜0.05)(圖3a)。

圖3 黃瓜健康植株(HPR)和感染枯萎病植株(DPR)根際土壤硝化桿菌(Nitrobacter,a)和硝化螺菌(Nitrospira,b)群落成員平均相對豐度比較Fig.3 Comparisons on the relative abundances of phylogenetic Nitrobacter(a)and Nitrospira(b)groups in rhizosphere soil of healthy plants(HPR)and Fusarium wilt-diseased plants(DPR)of cucumber

2.3 土壤Nitrospira 的群落多樣性和組成結構

健株和病株根際間Nitrospira群落α 多樣性無顯著差異(表2)。然而,病株根際Nitrospira群落中存在更多的特有OTU(圖1b)。PCoA 分析和ANOSIM測試顯示健株和病株根際間Nitrospira群落結構差異顯著(P＜0.05)(圖1d)。

對于Nitrospira群落,通過序列聚類共得到147個OTU,其中33 個OTU 平均相對豐度超過1%,合計占據(jù)總回收序列約95%。這些優(yōu)勢OTU 的代表性序列和已有的Nitrospira nxrB基因參考序列的系統(tǒng)發(fā)育進化樹如圖4所示,黃瓜根際Nitrospira群落成員包括Namibia soil Cluster 1、Namibia soil Cluster 2、Namibia soil Cluster 3、NitrospiralineageⅠ、NitrospiralineageⅡ和NitrospiralineageⅤ。其中,Namibia soil Cluster 1 和Namibia soil Cluster 2 為優(yōu)勢群落成員。經(jīng)計算發(fā)現(xiàn),病株根際Namibia soil Cluster 1的平均相對豐度顯著超出健株根際約92.19%,但健株根際NitrospiralineageⅡ平均相對豐度約為病株根際的66 倍(P＜0.05)(圖3b)。

圖4 基于OTU 代表性序列和參考序列的Nitrospira nxrB 基因系統(tǒng)進化樹Fig.4 Phylogenetic tree of Nitrospira nxrB genes based on representatives of OTUs detected in the study and representative sequences of major Clades

2.4 冗余分析和相關分析

冗余分析表明,土壤理化因子共解釋了約84.37%的處理間Nitrobacter群落結構差異,RDA1和RDA2 的解釋量分別為64.85%和19.52%(圖5a)。土壤亞硝態(tài)氮含量是影響Nitrobacter群落結構最重要的理化指標(r=0.912,P=0.037),其次是硝態(tài)氮含量(r=0.853,P=0.016),且二者均達到統(tǒng)計顯著水平;而其余土壤理化因子對Nitrobacter群落結構影響不顯著。同時,土壤理化因子共解釋約81.34%的處理間Nitrospira群落結構差異,RDA1 和RDA2 的解釋量分別為65.63%和15.71%(圖5b)。在所有供試的土壤理化因子中,亞硝態(tài)氮含量是影響Nitrospira群落結構的最重要指標(r=0.887,P=0.019),其次是pH(r=0.771,P=0.027),且二者均達統(tǒng)計顯著水平;而其余土壤理化因子并不能顯著影響Nitrospira群落結構。

圖5 黃瓜健康植株(HPR)和感染枯萎病植株(DPR)根際土壤硝化桿菌(Nitrobacter,a)和硝化螺菌(Nitrospira,b)群落結構與土壤理化性質的冗余分析Fig.5 Redundancy analyses between community structures of Nitrobacter(a)and Nitrospira(b)and soil physicochemical properties of healthy plants(HPR)and Fusarium wilt-diseased plants(DPR)of cucumber

線性回歸分析證明,Nitrobacter豐度與土壤硝態(tài)氮含量和亞硝酸鹽氧化潛勢顯著正相關(P＜0.05),而與土壤基礎呼吸量顯著負相關(P＜0.05);而Nitrospira豐度與所有供試土壤的理化和生化性質均無顯著關系(圖6)。就Nitrobacter的各群落成員而言,NitrobacterCluster 2b 的平均相對豐度與土壤硝態(tài)氮含量、亞硝酸鹽氧化潛勢和全氮含量顯著負相關(P＜0.05),而與土壤基礎呼吸量和pH 顯著正相關(P＜0.05);NitrobacterCluster 6 的平均相對豐度與土壤硝態(tài)氮含量和亞硝酸鹽氧化潛勢顯著正相關(P＜0.05),而與土壤基礎呼吸量顯著負相關(P＜0.05);NitrobacterCluster 5 的平均相對豐度與土壤基礎呼吸量和pH 顯著負相關(P＜0.05)。Nitrospira的各群落成員中,Namibia soil Cluster 1 的平均相對豐度僅與土壤硝態(tài)氮含量顯著正相關(P＜0.05);NitrospiralineageⅡ的平均相對豐度僅與土壤pH 顯著正相關(P＜0.05)。

3 討論

作為土壤生態(tài)系統(tǒng)的核心成員,微生物是眾多關鍵土壤生物學過程的直接執(zhí)行者,闡明土壤功能微生物組的變化特征有助于預測不同管理實踐下土壤生態(tài)功能(服務)的響應模式[28-29]。在作物連作障礙機理研究中,早前學者將注意力更多地集中在土壤總的微生物群落特征變化,而功能微生物組的研究常被忽視。傳統(tǒng)的兩步硝化理論認為氨氧化過程是土壤氮素轉換的限速步驟,但越來越多的研究已經(jīng)證實,在土壤氮素周轉過程中亞硝酸鹽氧化與氨氧化具有同等功能重要性[30-32]。在前期研究的基礎上[15-16],本研究聚焦于Nitrobacter和Nitrospira這兩種陸地生態(tài)系統(tǒng)中主導型NOB,結合設施連作生產(chǎn)系統(tǒng)土傳病害滋生這一熱點問題,比較了病株和健株根際間兩種NOB 豐度和群落多樣性及結構差異。功能評估顯示,病株根際具有更高的亞硝酸鹽氧化潛勢,這應歸因于更高的Nitrobacter豐度(表1)。我們也確實發(fā)現(xiàn),亞硝酸鹽氧化潛勢與Nitrobacter而非Nitrospira的豐度具有顯著的正相關關系(圖6),說明Nitrobacter是土壤亞硝酸鹽氧化的主要功能執(zhí)行者。前人研究[33-34]揭示Nitrobacter和Nitrospira具有典型的生態(tài)位分異和截然不同的生活史對策,Nitrobacter是r-對策者,偏好富營養(yǎng)環(huán)境和高碳、氮供應,對底物的親和力相對較低;而Nitrospira為k-對策者,底物親和力較高,在寡營養(yǎng)環(huán)境中扮演更強的功能角色。集約化設施連作生產(chǎn)系統(tǒng)中,長期高氮肥投入可能驅使Nitrobacter功能性支配著亞硝酸鹽氧化過程[35]。此外,病株較健株根際富集更多Nitrobacter的原因可能是發(fā)病植株生長受阻,對養(yǎng)分的吸收能力變差,根際范圍累積更多的養(yǎng)分,形成了局部的富營養(yǎng)環(huán)境[8,36],有利于Nitrobacter的生長,也帶來了更高的亞硝酸鹽氧化潛勢。

Nitrobacter和Nitrospira的群落結構在病株和健株根際土壤間存在顯著差異(表1 和圖1),說明NOB的群落結構關聯(lián)著土壤亞硝酸鹽氧化性能。微生物群落內部常常具有功能冗余,單一或特定條件下功能的發(fā)揮更多依賴于少數(shù)的群落內部成員,即活性群落成員[29],對亞硝酸鹽氧化細菌而言同樣如此[37]。對于Nitrobacter群落,NitrobacterCluster 6 和NitrobacterCluster 5 的平均相對豐度在病株根際均顯著高于健株根際,特別是NitrobacterCluster 6 的相對豐度與土壤亞硝酸氧化潛勢表現(xiàn)出顯著的正相關關系(圖6),預示其為潛在的功能活性成員。由于迄今為止對NitrobacterCluster 6 這一Nitrobacter nxrA基因聚類尚無任何經(jīng)富集、純化得到的代表性菌株,因此依然限制了對其環(huán)境關聯(lián)性和行為特征的認識。在Nitrospira群落中,盡管Namibia soil Cluster 1 的平均相對豐度在病株根際更高,但并未觀察到其與亞硝酸鹽氧化潛勢具有顯著相關性,這一定程度上支持了早前學者的報道,即Namibia soil Cluster 1 在旱地土壤亞硝酸鹽氧化過程中可能并非是一個關鍵的功能執(zhí)行者[18]。此外,健株根際中NitrospiralineageⅡ平均相對豐度較病株根際大幅度降低,可能與病株根際具有更低的pH 有關(圖6)[15]。Zhang 等[30]報道證明NitrospiralineageⅡ的代表性菌株Nitrospira mo-scoviensis的相對豐度與土壤pH 呈顯著正相關關系,暗示偏酸環(huán)境不利于NitrospiralineageⅡ的生長。

圖6 土壤硝化桿菌(Nitrobacter)和硝化螺菌(Nitrospira)及其群落成員相對豐度與土壤性質的相關分析Fig.6 Correlations between the abundances of Nitrobacter and Nitrospira and average relative abundances of their community members and soil properties

冗余分析證實,土壤亞硝態(tài)氮含量是影響Nitrobacter和Nitrospira群落結構最重要的土壤因子(圖5)。這也符合我們的預期,因為亞硝態(tài)氮是亞硝酸鹽氧化微生物功能執(zhí)行的底物(通過氧化亞硝態(tài)氮獲取能量),而不同的群落成員由于自身的生理和代謝差別對底物有效性存在不同的適應性和功能差異[18]。本研究中,盡管病株和健株根際亞硝態(tài)氮含量并無統(tǒng)計學差異(P=0.113),但病株根際亞硝態(tài)氮含量確實相對高于健株根際(表1)。結合前期研究結果,有兩點必須要指出的是:1)病株和健株根際土壤微生物氨氧化能力和亞硝酸鹽氧化能力表現(xiàn)出“倒掛”現(xiàn)象,即病株根際具有低的氨氧化潛勢,但有高的亞硝酸鹽氧化潛勢,而健株恰好與之相反,這種現(xiàn)象的內在機制仍需進一步研究。相較于經(jīng)典的兩步硝化理論,已有學者報道[38-39]了全程氨氧化細菌(complete ammonia-oxidizing bacteria,CAOB)的存在,此類細菌可以同時執(zhí)行氨氧化和亞硝酸鹽氧化兩個步驟。由于目前已知的CAOB 均隸屬于NitrospiralineageⅡ[40-41],特別是本研究中我們也觀察到NitrospiralineageⅡ的平均相對豐度在處理間存在顯著差異(圖3),因此需要探索CAOB 在設施連作土壤硝化過程中的功能角色。2)Wei 等[42]研究發(fā)現(xiàn),隨著土傳致病菌青枯勞爾氏菌(Ralstonia solanacearum)的入侵,盆栽番茄根際細菌群落發(fā)生明顯改變,其中與土壤硝化過程相關的微生物(Nitrospirae)相對豐度也發(fā)生變化。相似的現(xiàn)象在露地和設施番茄種植中也被發(fā)現(xiàn)[7]。組合前期數(shù)據(jù)[15]和本研究相關測定結果,同樣觀察到黃瓜根際尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)和Nitrobacter豐度存在極顯著正相關關系(r=0.905,P=0.002,n=8)。這些結果暗示土傳病原菌富集可能通過改變相關功能微生物群落影響了作物根際土壤硝化過程和強度,但其內在機制尚需進一步研究。

4 結論

設施連作枯萎病黃瓜植株和健康植株在根際亞硝酸鹽氧化微生物(Nitrobacter和Nitrospira)豐度和群落結構上存在顯著差異,這直接導致了病株和健株根際土壤亞硝酸鹽氧化能力的不同,表明集約化設施蔬菜連作生產(chǎn)中病害土壤的功能屬性變化,其微生物生態(tài)學機制須予以更多關注。