湛佳佳，張香，胡亞平，2，張志旭，周柄屹，周泉，秦丹，2*，曾璐*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410128；2.湖南省發(fā)酵食品工程技術(shù)研究中心，湖南 長沙 410128；3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖南 長沙 410128；4.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)國家中醫(yī)藥管理局亞健康干預(yù)技術(shù)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410128；5.天下果業(yè)開發(fā)有限公司，湖南 吉首 416000）

椪柑（Citrus reticulata Blanco cv.Ponkan）又名蘆柑，屬于蕓香科柑橘屬植物果實(shí),富含氨基酸、維生素C、礦物質(zhì)等營養(yǎng)元素，以及酚類、類黃酮、胡蘿卜素等生物活性物質(zhì)，是一種營養(yǎng)價(jià)值較高的水果[1]。椪柑酒是以椪柑為原料，取汁后，經(jīng)發(fā)酵、陳釀、澄清后得到的低酒精度果酒[2]，保留了原料中的多種活性成分，適量飲用有益于身體健康[3-5]。但在主發(fā)酵過程中，椪柑原料的果膠物質(zhì)極易被轉(zhuǎn)化生成甲醇、雜醇油等副產(chǎn)物[6-7]。其中，甲醇對人體可產(chǎn)生麻醉作用，超過5 g會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重中毒，超過12.5 g就可能導(dǎo)致死亡[8-9]。雜醇油的種類較多，主要有正丙醇、異丁醇、異戊醇，在酒體中的含量分別是甲醇的3.5、8、19倍[10-12]，含量過高會(huì)使酒體產(chǎn)生異雜味[13]，且毒性較大，易使人產(chǎn)生頭部神經(jīng)疼痛、面紅耳赤、頭暈心跳、惡心嘔吐等現(xiàn)象，危害人體健康[14]。然而，目前除了在GB 15037—2006《葡萄酒》中對白、桃紅葡萄酒的甲醇含量有<250 mg/L的規(guī)定外，其他果酒尚缺失相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，對其甲醇、雜醇油的含量未有統(tǒng)一規(guī)定。所以在釀造過程中對果酒中甲醇和雜醇油進(jìn)行調(diào)控和測定顯得十分重要?，F(xiàn)階段常用的測定方法主要是比色法[15-16]，但操作繁瑣、耗時(shí)較長，難以快速及時(shí)地了解甲醇和雜醇油的含量變化情況。也有研究采用氣相色譜法對果酒中甲醇和雜醇油進(jìn)行測定，具有操作簡單、靈敏度高、檢測限高等優(yōu)點(diǎn)，物質(zhì)完全分離需要24 min左右[17-19]。本文采用氣相色譜法對主發(fā)酵期間椪柑酒中甲醇和雜醇油含量進(jìn)行檢測，以期為椪柑酒的品質(zhì)調(diào)控提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

吉品椪柑：市售，產(chǎn)自湖南湘西自治州；葡萄酒果酒酵母SY：安琪酵母股份有限公司；蔗糖：柳州市古麗冰糖有限公司；甲醇（色譜純）、正丙醇（色譜純）、異丁醇（色譜純）、異戊醇（色譜純）、乙醇（色譜純）、4-甲基-2-戊醇（色譜純）：南京化學(xué)試劑股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

廚房機(jī)械原汁機(jī)（JYZ-E8）：九陽股份有限公司；型生化培養(yǎng)箱（MJ-250B5-Ⅱ）：上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；氣相色譜儀（GC-2010plus）：日本島津公司。

1.3 椪柑酒的生產(chǎn)工藝

1.4 色譜條件

色譜柱：DB-WAX石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm,0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度250℃；檢測器溫度250℃；H2流量47 mL/min，空氣流量400 mL/min；尾吹速率30 mL/min；載氣 N2，流量 2.8 mL/min，分流比 50∶1。

升溫程序：初溫45℃，恒溫3 min；以5℃/min升至70℃，恒溫2 min；以15℃/min升至130℃，恒溫2 min；以40℃/min升至200℃，恒溫2 min。

1.5 椪柑酒中甲醇、雜醇油含量的測定

1.5.1 溶液配制

單一標(biāo)準(zhǔn)品溶液：準(zhǔn)確吸取甲醇、正丙醇、異丁醇、異戊醇2.00 mL分別于100 mL容量瓶，用40%乙醇水溶液定容。

內(nèi)標(biāo)溶液：準(zhǔn)確吸取2mL4-甲基-2-戊醇于100mL的容量瓶，用40%乙醇水溶液定容。

甲醇及雜醇油混合標(biāo)準(zhǔn)母液：準(zhǔn)確吸取甲醇、正丙醇、異丁醇、異戊醇2.00 mL于100 mL容量瓶，用40%乙醇水溶液定容。

甲醇及雜醇油混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確吸取上述混合標(biāo)準(zhǔn)母液2 mL和內(nèi)標(biāo)溶液2 mL于100 mL容量瓶，用40%乙醇水溶液定容。

1.5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別向5個(gè)10 mL容量瓶中加入0.2 mL 20 g/L的4-甲基-2-戊醇（內(nèi)標(biāo)物）溶液，再分別加入0.1、0.5、1.0、3.0、5.0 mL混合標(biāo)準(zhǔn)母液，均用40%乙醇水溶液定容。以醇和內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量濃度之比為橫坐標(biāo)，醇和內(nèi)標(biāo)物的峰面積之比為縱坐標(biāo)，繪制甲醇和雜醇油的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。定量限為信噪比的10倍。

1.5.3 甲醇、雜醇油的定性

分別吸取單一標(biāo)準(zhǔn)品溶液各進(jìn)樣1 μL，得到甲醇、正丙醇、異丁醇、異戊醇的保留時(shí)間，再吸取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣1 μL，以單一標(biāo)準(zhǔn)品溶液和混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的出峰時(shí)間為對照進(jìn)行定性，得到甲醇、正丙醇、異丁醇、異戊醇、4-甲基-2-戊醇的色譜圖。

1.5.4 氣相色譜檢測樣品準(zhǔn)備

參考GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》進(jìn)行試樣制備。吸取100 mL試樣于500 mL蒸餾瓶中，加入100 mL水和幾顆玻璃珠，緩慢加熱蒸餾，收集餾出液，吸取10 mL餾出液于試管中，加入0.10 mL 4-甲基-2-戊醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，混勻，備用。

1.5.5 精密度與重復(fù)性分析試驗(yàn)

取同一標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)進(jìn)樣5次，計(jì)算峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviatio，RSD），以考察儀器的精密度；取同一酒樣，平行測定5次，計(jì)算甲醇和雜醇油含量的RSD值，以考察重復(fù)性。

1.5.6 穩(wěn)定性分析試驗(yàn)

取同一椪柑酒樣品，分別于0、4、8、12 h進(jìn)樣測定，記錄色譜圖峰面積，計(jì)算RSD。

1.5.7 加標(biāo)回收率分析試驗(yàn)

取2 mL內(nèi)標(biāo)溶液于100 mL容量瓶，用椪柑酒定容，測定甲醇、雜醇油含量。分別取2 mL內(nèi)標(biāo)溶液和混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用同一酒樣定容至100 mL，記錄色譜圖峰面積，計(jì)算甲醇、雜醇油回收率。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

應(yīng)用Excel和SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和方差分析，使用Origin 2019軟件進(jìn)行圖表制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 椪柑酒中甲醇和雜醇油同步檢測法的建立

椪柑酒樣品及標(biāo)準(zhǔn)品甲醇、雜醇油的氣相色譜見圖1。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)溶液及椪柑酒樣品溶液中甲醇、雜醇油的氣相色譜圖Fig.1 Gas chromatograms of methanol and fusel oil in standard solution and citrus wine sample solution

由圖1可知，該方法可使甲醇、雜醇油在13 min內(nèi)完全分離。

2.2 單一醇的線性考察及定量限

甲醇、雜醇油的回歸方程和定量限見表1。

表1 甲醇、雜醇油的回歸方程和定量限Table 1 Regression equation and quantification limit of methanol and fusel oil

由表1可知，在20mg/L～1000mg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，甲醇及雜醇油的峰面積之比和濃度之比均具有較好的線性關(guān)系，且相關(guān)系數(shù)均大于0.9990。因此，該方法能夠精確地測定甲醇、正丙醇、異丁醇、異戊醇的含量。

2.3 精密度和重復(fù)性試驗(yàn)

精密度和重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果見表2和表3。

表2 精密度試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Precision test results

表3 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Repeatability test results

由表2可知，同一標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)進(jìn)樣5次，甲醇、雜醇油標(biāo)準(zhǔn)溶液的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為2.24%、1.64%、1.78%、0.91%，表明儀器精密度良好。如表3所示，對同一椪柑酒平行測定5次，樣品中甲醇、雜醇油的RSD分別為2.40%、3.55%、3.64%、2.86%，表明該方法的測定值重復(fù)性良好。

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果見表4。

表4 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Stability test results

由表4可知，分別在4個(gè)時(shí)間點(diǎn)測定椪柑酒中甲醇、正丙醇、異丁醇、異戊醇。其峰面積RSD為1.93%～2.60%，表明該方法在12 h內(nèi)的測定值穩(wěn)定性良好。

2.5 加標(biāo)回收率試驗(yàn)。

加標(biāo)回收率結(jié)果見表5。

表5 加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Results of spike and recovery test

由表5可知，在已知濃度的溶液中加入甲醇、正丙醇、異丁醇、異戊醇標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定，根據(jù)色譜圖峰面積計(jì)算回收率。椪柑酒中甲醇和雜醇油正丙醇、異丁醇、異戊醇的加標(biāo)回收率在96.29%～103.36%之間，RSD分別為0.18%、0.16%、0.12%、0.06%，回收率較高且穩(wěn)定，說明該方法準(zhǔn)確可靠，可用于椪柑酒中甲醇和雜醇油的測定。

2.6 椪柑酒主發(fā)酵過程中酒精度和殘?zhí)亲兓?guī)律

椪柑酒主發(fā)酵期間酒精度和殘?zhí)呛康淖兓Y(jié)果見圖2。

圖2 主發(fā)酵期間酒精度和殘?zhí)呛康淖兓疐ig.2 Changes in the content of alcohol and residual sugar during main fermentation

由圖2可知，主發(fā)酵過程中隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，總糖逐漸被酵母菌分解消耗，第2天總糖的消耗速率最快，酒精度迅速升高。說明這期間酵母菌的代謝活動(dòng)最旺盛，6 d后酒精度逐漸趨于平緩，9 d后殘?zhí)呛亢途凭然静蛔?，表明發(fā)酵過程已基本完成。

2.7 椪柑酒主發(fā)酵過程中甲醇和雜醇油生成規(guī)律

甲醇和雜醇油的生成規(guī)律見圖3、圖4。

圖3 主發(fā)酵期間甲醇含量變化Fig.3 Changes in the content of methanol during main fermentation

由圖3可知，主發(fā)酵期間椪柑酒甲醇含量隨著發(fā)酵時(shí)間的延長逐漸升高，前5天甲醇含量增長速度較快，第6～9天增長速度緩慢，在第8天甲醇含量達(dá)到峰值[（261.14±5.58）mg/L]后趨于穩(wěn)定。主要是因?yàn)楣z在果膠酶作用下水解生成甲醇，由于前期果膠酶活力旺盛，隨著主發(fā)酵的進(jìn)行，可迅速分解發(fā)酵體系中的果膠物質(zhì)，導(dǎo)致主發(fā)酵后期果膠含量減少，使得甲醇的生成量也逐漸降低[20]。

由圖4可知，主發(fā)酵期間前4 d正丙醇、異戊醇、異丁醇含量增長速度較快，分別在第9、11、8天達(dá)到峰值[（171.40±3.69）、（390.29±11.80）、（44.07±0.97）mg/L]。主發(fā)酵期間椪柑酒中的主要雜醇油的含量由高到低依次為異戊醇、正丙醇、異丁醇，其中異戊醇是椪柑酒中主要雜醇，占雜醇油總質(zhì)量的70.99%。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)所采用的氣相色譜檢測方法能使甲醇、雜醇油在13min內(nèi)完全分離，可在短時(shí)間內(nèi)同步測定甲醇、雜醇油的含量。測定結(jié)果表明：主發(fā)酵期間椪柑酒中甲醇、正丙醇、異戊醇、異丁醇的含量均呈先升高后趨于穩(wěn)定的規(guī)律，分別在第8、9、11、8天達(dá)到峰值[（261.14±5.58）、（171.40±3.69）、（390.29±11.80）、（44.07±0.97）mg/L]，其中甲醇含量超出國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的250 mg/L限定值，表明該酒樣還需進(jìn)行發(fā)酵優(yōu)化或陳釀處理。本試驗(yàn)結(jié)果可為椪柑酒中甲醇、雜醇油含量檢測提供有效方法，同時(shí)為后續(xù)果酒品質(zhì)優(yōu)化提供研究方向。