陳柳宏，趙春雷，王 希，李彥麗,4，丁廣洲，陳 麗

（1黑龍江大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150080；2黑龍江省甜菜工程技術(shù)研究中心，哈爾濱 150080；3國家糖料改良中心，哈爾濱 150080；4國家甜菜種質(zhì)中期庫，哈爾濱 150080）

0 引言

轉(zhuǎn)錄組廣義上指某一生理?xiàng)l件下，細(xì)胞內(nèi)所有轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的集合，包括信使RNA、核糖體RNA、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA 及非編碼RNA；狹義上指所有mRNA 的集合[1]。轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-seq)就是利用高通量測序技術(shù)將細(xì)胞或組織中全部或部分mRNA、smallRNA 和nocodingRNA進(jìn)行測序分析的技術(shù)[2]。

基本上，單個(gè)生物體內(nèi)的所有細(xì)胞都具有近乎相同的基因型，在基因的核苷酸序列不產(chǎn)生變化的情況下，基因表達(dá)的可遺傳變化成為一種突破口。多細(xì)胞生物中不同細(xì)胞類型和特定細(xì)胞功能的產(chǎn)生很大程度上是基因差異性表達(dá)的結(jié)果。常規(guī)的轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)雖然能測序大部分的細(xì)胞，但所測結(jié)果實(shí)際上是一群細(xì)胞基因表達(dá)的平均值，忽略了細(xì)胞的異質(zhì)性。此外，由于技術(shù)的局限性常導(dǎo)致RNA 純化的效率以及檢測的靈敏度不佳，在某些胚胎細(xì)胞的研究中還存在著可用前體細(xì)胞稀少等情況，在研究過程中進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析往往十分困難并在一定程度上無法收集到大量的細(xì)胞數(shù)據(jù)。因此，檢查單個(gè)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組是解釋基因表達(dá)異質(zhì)性和隨機(jī)性必不可少的過程。

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序(Single-cell RNA-seq,scRNAseq)的研究為理解不同細(xì)胞類型或單個(gè)細(xì)胞的的轉(zhuǎn)錄過程創(chuàng)造了可能性，目前已經(jīng)廣泛地被應(yīng)用與醫(yī)學(xué)與動(dòng)物研究之中，如使用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)對(duì)細(xì)胞譜系軌跡以及稀有細(xì)胞類型進(jìn)行鑒定[3]，并在疾病研究與動(dòng)物胚胎發(fā)育中取得了可觀的進(jìn)展[4-5]。高通量單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)可以識(shí)別和表征來自組織或器官中的大量細(xì)胞群體中的稀有細(xì)胞類型，目前在擬南芥中發(fā)現(xiàn)其基因型之間的表達(dá)差異性很大[6]，利用大量根表達(dá)標(biāo)記基因能夠完成罕見細(xì)胞類型（如QC細(xì)胞）的鑒定。因此，深入理解單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)可為研究細(xì)胞功能提供新的思路，有助于人類探索不同細(xì)胞類型在發(fā)育過程中的作用及細(xì)胞調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[7]。

1 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序及其發(fā)展概況

1.1 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)

細(xì)胞是生物體的基本結(jié)構(gòu)和功能單位。每一個(gè)生命體都是從一個(gè)細(xì)胞生長發(fā)育而來，每個(gè)細(xì)胞都具有獨(dú)特的表型和生物學(xué)功能。生物體中相同或者不同的組織、器官、系統(tǒng)中的細(xì)胞均存在異質(zhì)性，細(xì)胞的異質(zhì)性由其遺傳物質(zhì)所決定，其本質(zhì)差異體現(xiàn)在基因組、轉(zhuǎn)錄組、表觀組層面。因此，為了研究生物體的功能機(jī)制并避免樣本均質(zhì)化掩蓋單細(xì)胞的異質(zhì)性，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)(scRNA-seq)是指能夠獲得單個(gè)細(xì)胞內(nèi)近萬個(gè)基因表達(dá)信息，并且能夠辨別生物組織中各種細(xì)胞類型的轉(zhuǎn)錄特征以及全面揭示細(xì)胞之間基因表達(dá)異質(zhì)性的測序方法[8]。以目前應(yīng)用廣泛的10 X Genomics 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序平臺(tái)為例，該技術(shù)利用微流控、油滴包裹和baecode標(biāo)記等技術(shù)來實(shí)現(xiàn)高通量的細(xì)胞捕獲技術(shù)，能夠一次性分離、并標(biāo)記500～10000 個(gè)單細(xì)胞，從而獲得每個(gè)細(xì)胞的3’端的轉(zhuǎn)錄組信息，具有細(xì)胞通量高、建庫成本低、捕獲周期短等優(yōu)勢。該技術(shù)主要用于細(xì)胞分型和標(biāo)記因子的鑒定，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞群體的劃分與細(xì)胞群體間基因表達(dá)差異的檢測，此外該技術(shù)還可以預(yù)測細(xì)胞分化與研究發(fā)育軌跡，在當(dāng)下疾病、免疫、腫瘤領(lǐng)域以及組織、器官、發(fā)育研究中發(fā)揮越來越重要的作用。

1.2 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)展概況

最早的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組技術(shù)利用基于PCR 技術(shù)的對(duì)單個(gè)細(xì)胞cDNA 的指數(shù)擴(kuò)增和線性擴(kuò)增進(jìn)行了探索，但僅局限于檢測單個(gè)細(xì)胞中的少數(shù)基因[9]。2006年，Kurimoto 等[10-11]改進(jìn)了單細(xì)胞cDNA 擴(kuò)增方法，將定向的PCR 擴(kuò)增與線性擴(kuò)增相結(jié)合，結(jié)合芯片技術(shù)對(duì)單個(gè)胚胎干細(xì)胞進(jìn)行了分析，在高覆蓋率和準(zhǔn)確性的前提下，使細(xì)胞和基因的通量有所提升。隨著測序技術(shù)的發(fā)展，2009 年，Tang[12]首次創(chuàng)立基于高通量測序的單細(xì)胞RNA 測序分析并應(yīng)用于單個(gè)小鼠的卵裂球，使基因檢測通量大幅度提高，檢測出比芯片技術(shù)更多的轉(zhuǎn)錄本。隨后，CEL-Seq 技術(shù)的開發(fā)克服了單個(gè)細(xì)胞中由于少量起始RNA 導(dǎo)致的高通量測序受限，并應(yīng)用于秀麗隱桿線蟲胚胎姐妹細(xì)胞研究之中，成功觀察到其姐妹細(xì)胞之間轉(zhuǎn)錄物的差異性分布[13]。類似采用線性擴(kuò)增或擬線性擴(kuò)增的技術(shù)如PMA[14](phi29- mRNA amplification)， SMA[14](semirandom primed PCR- based ,RNA transcriptome amplification)，哈佛大學(xué)謝曉亮院士發(fā)明的MALBAC[15](Multiple Annealing and Looping Based Amplification Cycles)，即多次退火環(huán)狀循環(huán)擴(kuò)增技術(shù)（可以對(duì)單個(gè)細(xì)胞、單條染色體或者0.5 pg 的RNA 進(jìn)行高保真擴(kuò)增）均在研究中使用以便保留完整的轉(zhuǎn)錄組信息，并已經(jīng)進(jìn)行商業(yè)化運(yùn)作。在此基礎(chǔ)上，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)發(fā)展愈發(fā)成熟，2018 年，浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院郭國驥團(tuán)隊(duì)自主研發(fā)出高通量測序平臺(tái)Microwell-seq，并發(fā)表了世界首個(gè)小鼠細(xì)胞圖譜[16]，且在2020 年成功繪制世界首個(gè)涵蓋八大系統(tǒng)的人類細(xì)胞圖譜[17]。

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)最先運(yùn)用于對(duì)胚胎早期發(fā)育、分化以及重編過程中起作用的動(dòng)態(tài)基因的研究。Tang 等[18]利用該技術(shù)首次檢測到胚胎發(fā)育過程中microRNA 的變化，揭示了體外囊胚期內(nèi)細(xì)胞團(tuán)向多能胚胎干細(xì)胞轉(zhuǎn)變中的轉(zhuǎn)錄組重編過程。近期，Briggs 等[19]基于微流控技術(shù)對(duì)西部爪趾蛙進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序分析，推導(dǎo)出脊椎動(dòng)物中細(xì)胞狀態(tài)的詳細(xì)變化情況，闡明了脊椎動(dòng)物早期發(fā)育基因表達(dá)程序的保守性和發(fā)散性特征。除此之外，Treutlein 等[20]又將該技術(shù)運(yùn)用于遠(yuǎn)端肺上皮譜系層次建立中，實(shí)現(xiàn)了其在組織器官發(fā)育中的運(yùn)用。隨著單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)的不斷發(fā)展，之后又相繼應(yīng)用于在免疫細(xì)胞對(duì)于抗原的應(yīng)答機(jī)制中的一致性分析[21]以及腫瘤細(xì)胞之間基因突變或表達(dá)圖譜差異性的研究中[22]。在動(dòng)物中的成功運(yùn)用也為植物研究提供了新的思路，Mello等[23]在2015年對(duì)擬南芥采用流式技術(shù)進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序，并將擬南芥根尖細(xì)胞進(jìn)行分類，成功完成了植物種單細(xì)胞水平標(biāo)記基因的篩選。Shulse等[24]在2019 年對(duì)擬南芥根部細(xì)胞進(jìn)行更深入的研究，涵蓋幾乎所有主要的根組織和發(fā)育階段的細(xì)胞類型，證明了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序可用于分析植物的發(fā)育過程，并展示了外部刺激導(dǎo)致的植物根細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組變化。此外，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序也被運(yùn)用于植物保衛(wèi)細(xì)胞功能分析中，以解釋關(guān)鍵基因表達(dá)的作用機(jī)理[25]，并在玉米生殖細(xì)胞研究中解釋了減數(shù)分裂失敗情況下胚轉(zhuǎn)錄繼續(xù)進(jìn)行的原因[26]。綜上所述，人們可以通過單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)對(duì)生命體在單個(gè)細(xì)胞層面上對(duì)其內(nèi)部復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄調(diào)控和表觀遺傳進(jìn)行更深層次的分析，從而全面了解各類細(xì)胞以及其功能。

2 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)要點(diǎn)

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序的工作流程包括三個(gè)關(guān)鍵步驟：第一，單細(xì)胞的分離；第二，單細(xì)胞全轉(zhuǎn)錄組cDNA 擴(kuò)增；第三，測序和初級(jí)分析；第四，數(shù)據(jù)可視化與解讀。其中包含三個(gè)關(guān)鍵的技術(shù)要點(diǎn)[27]：單細(xì)胞分離技術(shù)、單細(xì)胞全轉(zhuǎn)錄組cDNA 擴(kuò)增技術(shù)、高通量測序技術(shù)。下文將對(duì)三個(gè)關(guān)鍵的技術(shù)要點(diǎn)進(jìn)行闡述。

2.1 單細(xì)胞分離技術(shù)

單細(xì)胞分離技術(shù)對(duì)提升細(xì)胞通量起到關(guān)鍵的作用。由于單個(gè)細(xì)胞體積微小并容易受到外界環(huán)境的影響，分離單細(xì)胞往往十分困難。分離方法從最初的人工手動(dòng)分離逐步發(fā)展至自動(dòng)化的集成流體電路、微流控技術(shù)等，實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞通量的大幅度提升，這些方法各有利弊，應(yīng)根據(jù)具體的研究內(nèi)容進(jìn)行適當(dāng)?shù)倪x用。此外，分離得到的單細(xì)胞需要進(jìn)行隔離以保證其獨(dú)有的微反應(yīng)體制。

2.1.1 微流控技術(shù) 該技術(shù)具有基于流體動(dòng)力穿梭的微流控芯片、微濾器以及微通道。由于單個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞大小、物理結(jié)構(gòu)都有所不同，可通過控制細(xì)胞的數(shù)量和密度實(shí)現(xiàn)高精度的單細(xì)胞捕獲。微流控芯片中微米級(jí)的二維或三維通道為單個(gè)細(xì)胞的操縱提供了尺寸相匹配的結(jié)構(gòu)。根據(jù)不同的研究需求，微流控芯片系統(tǒng)可以將多種單細(xì)胞研究所需的操作單元，如細(xì)胞操縱相關(guān)的微泵、微閥技術(shù)，單細(xì)胞捕獲技術(shù)以及檢測分析單元等設(shè)計(jì)并集成到微小的芯片平臺(tái)上。此外，這些物理結(jié)構(gòu)也會(huì)影響細(xì)胞培養(yǎng)和動(dòng)態(tài)活細(xì)胞的成像能力。微流體幾何捕集系統(tǒng)通過對(duì)細(xì)胞特征信息進(jìn)行成像來分離目標(biāo)單細(xì)胞，有助于闡明細(xì)胞的異質(zhì)性[28]。目前微流控技術(shù)已經(jīng)進(jìn)行了商業(yè)化的運(yùn)用。

2.1.2 稀釋法 稀釋法是得到單細(xì)胞的一種相對(duì)簡單的途徑，通過將細(xì)胞群體放入不同倍比梯度的細(xì)胞懸液中稀釋，指導(dǎo)得到單個(gè)狀態(tài)或者極少數(shù)量狀態(tài)的細(xì)胞[29,30]。這種方法操作簡單，但不易精確控制單個(gè)細(xì)胞，容易造成分離錯(cuò)誤或者丟失。因此，稀釋法可以與微流控技術(shù)相結(jié)合[31]，在微流控芯片的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)一系列復(fù)雜的梯度網(wǎng)絡(luò)實(shí)現(xiàn)連續(xù)稀釋，使最終被分離的細(xì)胞進(jìn)入芯片通道內(nèi)，更有效的控制單個(gè)細(xì)胞，該方法已經(jīng)被用于檢測抗菌藥物敏感性等實(shí)驗(yàn)中[32]。

2.1.3 顯微操作法 顯微操作法是使用光學(xué)顯微鏡直接進(jìn)行顯微操作分選的方法，能成功地分理出單個(gè)細(xì)胞，但其不適用于大量樣品的分離[33]。該方法易于操作并且能夠?qū)渭?xì)胞進(jìn)行直觀觀察，但容易損傷細(xì)胞，造成識(shí)別錯(cuò)誤。

2.1.4 熒光激活細(xì)胞分選法 熒光激活細(xì)胞分選法是將表面具有特定標(biāo)記的靶細(xì)胞進(jìn)行富集或簡單分選的方法[34]。但在其分解流體過程中，容易造成細(xì)胞的損壞甚至導(dǎo)致mRNA 或DNA 的丟失。此外，使用此方法需要較大的樣品量[35]。

2.1.5 光學(xué)鑷子法 光學(xué)鑷子法是顯微操作中的一種方法[36]，通過高度聚焦的激光束夾取細(xì)胞。其缺點(diǎn)是不能直接接觸細(xì)胞，因?yàn)槠鋵?duì)細(xì)胞產(chǎn)生的光損傷和熱損傷是無法避免的[37]。

2.1.6 集成流體電路法 集成流體電路法通過與微流控芯片技術(shù)相結(jié)合，可以設(shè)計(jì)出集成單細(xì)胞捕獲的介電泳連續(xù)分離微流控芯片,并利用介電泳原理，對(duì)外部施加非均勻電場，使細(xì)胞受到的不同大小或方向的介電泳力而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞分離,利用微捕獲結(jié)構(gòu)來捕獲單細(xì)胞[38]。該方法具有高通量、低成本等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞捕獲和排列[39]、細(xì)胞聚焦[40]等領(lǐng)域中。

2.2 單細(xì)胞全轉(zhuǎn)錄組cDNA擴(kuò)增技術(shù)

單細(xì)胞全轉(zhuǎn)錄組擴(kuò)增是進(jìn)行后續(xù)單細(xì)胞測序的前提，傳統(tǒng)的擴(kuò)增方法如引物延伸與擴(kuò)增法，簡并寡核苷酸引物PCR 技術(shù)對(duì)溫度等條件要求較高，且擴(kuò)增片段較短，變異系數(shù)高，容易造成非特異性擴(kuò)增，導(dǎo)致擴(kuò)增產(chǎn)物不均勻并出現(xiàn)擴(kuò)增偏好性[41-42]。近年來，隨著擴(kuò)增技術(shù)的發(fā)展，多重置換擴(kuò)增技術(shù)和多次退火環(huán)狀循環(huán)擴(kuò)增技術(shù)被廣泛應(yīng)用于全轉(zhuǎn)錄組cDNA 擴(kuò)增中。

2.2.1 多重置換擴(kuò)增技術(shù) 多重置換擴(kuò)增(multiple displacement amplification, MDA)是一種等溫?cái)U(kuò)增方式，由Dean 于2002 年發(fā)明[43]。其對(duì)整個(gè)基因組覆蓋廣泛，并且在各個(gè)位點(diǎn)上產(chǎn)生的擴(kuò)增偏移最小[44]，在全基因組擴(kuò)增中應(yīng)用廣泛。該方法先由隨機(jī)6 堿基引物在多個(gè)位點(diǎn)與模板DNA 進(jìn)行復(fù)性，然后在phi29DNA 聚合酶的作用下在DNA 的多個(gè)位點(diǎn)同時(shí)開始復(fù)制；復(fù)制合成的DNA 取代模板的互補(bǔ)鏈，同時(shí)被置換的互補(bǔ)鏈又成為新的模板進(jìn)行擴(kuò)增[45]。該方法具有高通量和能獲取高質(zhì)量DNA 的優(yōu)點(diǎn)，但MDA往往存在與模板無關(guān)的擴(kuò)增。為了解決此問題，2017年，Wang 等[46]對(duì)MDA 進(jìn)行改進(jìn)，創(chuàng)造了僅以模板依賴為方式的等溫?cái)U(kuò)增(template-dependent MDA,tdMDA)，通過5’端封閉的隨機(jī)無聚體引物開展逆轉(zhuǎn)錄和MDA，以便消除與模板無關(guān)的擴(kuò)增，并在人類循環(huán)RNA擴(kuò)增中應(yīng)用。

2.2.2 多次退火環(huán)狀循環(huán)擴(kuò)增技術(shù) 多次退火環(huán)狀循環(huán)擴(kuò)增技術(shù)(multiple annealing and looping-based amplification cycles, MALBAC)是謝曉亮等[42]在2012年發(fā)明全新的全基因組擴(kuò)增方法。該方法引入了類似線性預(yù)擴(kuò)增的方式以減少與非線性擴(kuò)增相關(guān)的偏差，使用pg 級(jí)的DNA 片段作為擴(kuò)增模板并使用隨機(jī)引物進(jìn)行擴(kuò)增，引物由固定的27個(gè)核苷酸序列和8個(gè)可在0℃下與模板均勻結(jié)合的可變核苷酸組成；在溫度升至65℃下，在具有鏈置換活性的DNA 聚合酶作用下產(chǎn)生長度不一(0.5 k～1.5 kb)的半擴(kuò)增子；半擴(kuò)增子在94℃下離開模板，并以其為模板擴(kuò)增產(chǎn)生兩端具有互補(bǔ)末端(27 nt)的完整擴(kuò)增子。隨后降溫至58℃使完整擴(kuò)增子環(huán)化，防止進(jìn)一步的擴(kuò)增和交叉雜交，因此可以在很大程度上保證其發(fā)生線性擴(kuò)增。在經(jīng)過線性擴(kuò)增循環(huán)后，使用27 nt 通用引物對(duì)得到的大量的全擴(kuò)增子進(jìn)行指數(shù)PCR 反應(yīng)，產(chǎn)生下一代測序所需的微克級(jí)別DNA。

MALBAC 擴(kuò)增效率高，能實(shí)現(xiàn)全基因組覆蓋并克服了PCR 放大過程中產(chǎn)生的偏差，并在輔助生殖[47]等領(lǐng)域發(fā)揮了重要的作用，為研究染色體疾病提供了工具。

2.3 高通量測序技術(shù)

高通量測序技術(shù)(High- throughput RNA Sequencing)是以Roche 公司的454 技術(shù)、lllumina 公司的Hi Seq 和Mi Seq 測序平臺(tái)以及Solexa 技術(shù)為基礎(chǔ)的測序技術(shù)。相對(duì)于傳統(tǒng)的桑格測序而言，高通量測序技術(shù)能一次對(duì)幾十萬到幾百萬條DNA 分子進(jìn)行序列測定，能對(duì)絕大多數(shù)的轉(zhuǎn)錄表達(dá)進(jìn)行精準(zhǔn)地定量。其原理是酶級(jí)聯(lián)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，將PCR 擴(kuò)增的單鏈DNA 與引物雜交，并在DNA 聚合酶、底物熒光素酶等酶的作用下共同孵育形成單分子簇；擴(kuò)增達(dá)到測序所需模板量后加入帶有特異熒光的堿基(dNTP)，每次只添加一個(gè)，通過其可逆止的特性，依次添加激發(fā)不同顏色的熒光基團(tuán)，轉(zhuǎn)化得到結(jié)果，最終完成測序[48]。

3 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)在植物研究中的應(yīng)用

3.1 植物單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)目前已被生物學(xué)與醫(yī)學(xué)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，由于植物細(xì)胞存在細(xì)胞壁，進(jìn)行單細(xì)胞測序存在一定的難度，但其在植物研究中存在著巨大的潛力。不同的scRNA-seq 技術(shù)適用于不同的范圍，多孔板法和液滴法是目前植物研究中應(yīng)用最廣泛的技術(shù)，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮椭参飿颖绢愋瓦x擇合適的技術(shù)方法[49]。在樣本量較少以及樣本稀有的情況下，使用多孔板法；對(duì)于樣本量高的實(shí)驗(yàn)，可采用微流控芯片，利用液滴分選單個(gè)細(xì)胞，該方法具有高通量的特性，可獲得大量的細(xì)胞。

3.2 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序在植物中的應(yīng)用

3.2.1 研究基因表達(dá)模式和細(xì)胞功能區(qū)域特性 不同細(xì)胞內(nèi)不同基因的表達(dá)影響著植物的生長與代謝，研究基因表達(dá)模式有助于判斷調(diào)控植物體內(nèi)反應(yīng)的基因類型，以便對(duì)植物本身以及和外部環(huán)境之間的反應(yīng)進(jìn)行更好的研究與改良，提高了優(yōu)化目的性狀的靶向性與可操作性。2008 年，Lieckfeldt 等[50]對(duì)擬南芥的基底細(xì)胞、表皮細(xì)胞和表皮毛細(xì)胞進(jìn)行了研究，通過RT-PCR 將三類細(xì)胞的基因表達(dá)進(jìn)行了分類，并從中定位參與代謝的基因。2015 年，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)嚴(yán)建兵團(tuán)隊(duì)實(shí)現(xiàn)了玉米單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序，通過對(duì)玉米四分體的每個(gè)小孢子進(jìn)行測序，加深了對(duì)減數(shù)分裂的理解[51]。Ryu 等[52]在2019 年對(duì)超過10000 個(gè)擬南芥根細(xì)胞以液滴微流控技術(shù)為基礎(chǔ)進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序，集中分析了單個(gè)細(xì)胞的發(fā)育軌跡，同時(shí)從根表皮突變體中獲得單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組，對(duì)其基因表達(dá)進(jìn)行比較分析，完成了擬南芥根的第一代基因表達(dá)圖譜，為研究突變基因的影響提供了新的視角。

3.2.2 解釋植物發(fā)育過程與生理特性 通過對(duì)細(xì)胞類型特異性表達(dá)差異的研究，能夠解釋新的細(xì)胞類型和細(xì)胞譜系的發(fā)育軌跡，2019 年，Jean-Baptiste 等[53]通過對(duì)擬南芥跟細(xì)胞的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析排序，鑒定了數(shù)百種具有細(xì)胞異質(zhì)性表達(dá)的基因；此外，對(duì)總RNA 表達(dá)在發(fā)育軌跡中的變化進(jìn)行評(píng)估闡明了其發(fā)展方向；最后對(duì)擬南芥幼苗進(jìn)行高溫脅迫，研究了長期存在的對(duì)非生物脅迫響應(yīng)中細(xì)胞異質(zhì)性可能存在的影響，檢測出除熱休克基因主導(dǎo)跨細(xì)胞類型的表達(dá)外，其他基因之間也存在著細(xì)微但顯著的差異，證明單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)對(duì)植物發(fā)育與植物生理有著重要的研究意義。此外，Denyer 等[54]通過高通量單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)構(gòu)建了擬南芥單細(xì)胞RNA 表達(dá)圖譜，揭示了擬南芥發(fā)育中關(guān)鍵的發(fā)育調(diào)節(jié)因子和下游基因，這些基因決定了不同細(xì)胞獨(dú)特的形狀和功能，證明了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序應(yīng)用于植物的能力。

3.2.3 對(duì)植物細(xì)胞類型進(jìn)行鑒定 基因的選擇性表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞分化成不同的類型，不同類型的細(xì)胞具有其獨(dú)特的功能。對(duì)植物細(xì)胞類型進(jìn)行鑒定，有利于進(jìn)一步研究各類別細(xì)胞對(duì)植物生命活動(dòng)的影響。Zhang等[55]收獲了擬南芥根組織細(xì)胞，并將其轉(zhuǎn)化為原生質(zhì)體進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序，將得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行線性維數(shù)縮減并得到100 個(gè)近似主成分，對(duì)其進(jìn)行分析，成功將擬南芥根細(xì)胞分為24 個(gè)細(xì)胞簇；通過富集簇基因與已知的跟細(xì)胞類型和相關(guān)系數(shù)分析，進(jìn)一步驗(yàn)證了每個(gè)簇的細(xì)胞類型。此外Ryu 等[52]也根據(jù)擬南芥細(xì)胞的原生質(zhì)體測定了每個(gè)原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)錄組，通過聚類分析將10000 個(gè)擬南芥根細(xì)胞分成了九個(gè)簇并進(jìn)行了細(xì)胞亞群和罕見的細(xì)胞類型鑒定?？梢?，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)能有效地運(yùn)用于細(xì)胞類型鑒定之中。

4 展望

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)能夠?qū)χ参锏幕虮磉_(dá)、發(fā)育過程以及細(xì)胞類型進(jìn)行測序分析，是從細(xì)胞水平解釋動(dòng)植物生命活動(dòng)的有效工具。但是，在植物研究中仍存在以下兩點(diǎn)問題：（1）由于植物細(xì)胞存在細(xì)胞壁，目前在植物中進(jìn)行的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序僅能通過原生質(zhì)體進(jìn)行測序。（2）在植物基因表達(dá)模式的研究中常存在數(shù)據(jù)結(jié)果精度較低的情況。盡管如此，許多單細(xì)胞組學(xué)工具已經(jīng)存在或正在開發(fā)中[56-57]，可以通過檢測染色質(zhì)的可及性[58]和映射細(xì)胞的基因組情況[59]來解決這些問題，同時(shí)使該技術(shù)能更好的運(yùn)用于植物研究中并建立相關(guān)抗病機(jī)制遺傳圖譜，為理解植物細(xì)胞提供更好的技術(shù)支撐。