史敏晶，丁 歡，田維敏

（中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所，農(nóng)業(yè)部橡膠樹生物學(xué)與遺傳資源利用重點實驗室，省部共建國家重點實驗室培育基地-海南省熱帶作物栽培生理學(xué)重點實驗，?？?570100）

0 引言

巴西橡膠樹（Hevea brasiliensisMuell.Arg.，以下簡稱橡膠樹）是最重要的人工栽培產(chǎn)膠植物，提供了世界所需98%以上的天然橡膠。乳管作為天然橡膠合成和儲存的特異組織，與天然橡膠的生產(chǎn)息息相關(guān)。割膠是當(dāng)前從橡膠樹乳管組織中獲取天然橡膠的唯一途徑，人們通過切割橡膠樹樹干樹皮中的次生乳管，收集乳管中排出的膠乳，作為提煉天然橡膠的原料。割膠后橡膠樹維持較高的排膠速度和較長的排膠時間是膠乳產(chǎn)量的保證。作為天然橡膠生產(chǎn)中最后的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，割膠后的排膠機理一直受到研究者的極大重視，而對排膠機理的正確認(rèn)識又對割膠生產(chǎn)產(chǎn)生了極大的正向推進(jìn)作用。

人們最早通過刀劈法，即用刀斧砍削一大塊樹皮來獲取膠乳，這種方法簡單而粗暴，對橡膠樹產(chǎn)生了嚴(yán)重的傷害。隨著對橡膠樹樹皮的結(jié)構(gòu)特征尤其是乳管結(jié)構(gòu)的科學(xué)認(rèn)識，1889年新加坡植物園主任Ridlry發(fā)明了有規(guī)律的割線割膠法，這一新的割膠方法極大地提高了橡膠樹的產(chǎn)量和延長了橡膠樹的經(jīng)濟(jì)壽命，為現(xiàn)代割膠制度的建立奠定了基礎(chǔ)。1968年，人們發(fā)現(xiàn)乙烯對乳管排膠產(chǎn)生高效的刺激作用，進(jìn)而將乙烯利作為排膠刺激劑應(yīng)用于割膠生產(chǎn)，這是現(xiàn)代割膠制度快速發(fā)展的重要里程碑。1966年，Boatman等人經(jīng)典的乳管傷口堵塞物實驗使得人們對膠乳的停排有了全新的認(rèn)識，排膠生物學(xué)研究的重點也從排膠動力轉(zhuǎn)向了排膠阻力。截止1989年，在過去的100多年里，人們從形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理、生化層面，對排膠動力、阻力以及排膠調(diào)節(jié)劑等多個方面展開了較為系統(tǒng)的研究，取得了一系列的研究成果，是排膠生物學(xué)飛速發(fā)展的階段。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的興起，從分子水平更深層次解析橡膠樹排膠機制的研究相對欠缺，相對于橡膠樹乳管分化以及橡膠合成等方面的研究也是滯后的。為了全面解析橡膠樹的排膠機制，本文擬從乳管的細(xì)胞學(xué)、乳管排膠初動力和繼動力、乳管傷口堵塞形成阻力及其調(diào)控等多個方面來闡述橡膠樹排膠機制當(dāng)前取得的主要進(jìn)展，并對該領(lǐng)域存在的問題和發(fā)展方向提出思考，旨在為本領(lǐng)域的后續(xù)研究提供參考依據(jù)。

1 橡膠樹乳管細(xì)胞學(xué)研究

橡膠樹中的乳管根據(jù)其來源和組織學(xué)的位置，可分為初生乳管和次生乳管兩種類型[1]。與割膠生產(chǎn)密切相關(guān)的是成齡樹中的次生乳管，其乳管列的多少直接決定著產(chǎn)膠的潛力。次生乳管細(xì)胞是由維管形成層中的紡錘狀原始細(xì)胞分化而來，同一層的乳管細(xì)胞自上而下連接，細(xì)胞間的端壁融解后形成的一條貫通的管道，即乳管[2]。相鄰乳管間能形成彼此連接的接合管，最終同列所有的乳管連接在一起形成完整的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，這種同層乳管相通的結(jié)構(gòu)特征也是現(xiàn)代割膠制度出現(xiàn)的生物學(xué)基礎(chǔ)。

1.1 乳管細(xì)胞壁

乳管是多核的活細(xì)胞，幼嫩的乳管細(xì)胞與周圍的薄壁細(xì)胞以胞間連絲相聯(lián)系[3],細(xì)胞壁薄，但成熟的乳管細(xì)胞壁明顯加厚，缺乏胞間連絲，與周圍薄壁細(xì)胞之間僅以“質(zhì)子泵”的方式交換物質(zhì)[4]。這種相對孤立的結(jié)構(gòu)使得成熟的乳管形成了一個相對封閉的獨立體系。乳管細(xì)胞壁內(nèi)面存在向腔內(nèi)突出的部分，是融合的乳管細(xì)胞留下的殘留橫壁，因此，乳管并不是一條孔徑一致的平滑管道，這些內(nèi)突的縊縮影響了膠乳在乳管中流動的通暢性，也影響了排膠。

1.2 乳管細(xì)胞器

乳管細(xì)胞內(nèi)含有一般薄壁細(xì)胞所具有的細(xì)胞核和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體、核糖體、高爾基體等細(xì)胞器以及3種特殊的細(xì)胞器——橡膠粒子、黃色體和F-W復(fù)合體[5]。橡膠粒子由半個單位膜包被而成，是合成和儲存天然橡膠的特殊細(xì)胞器，也是構(gòu)成膠乳的最主要成分。關(guān)于橡膠粒子的起源目前尚無定論，但其起源于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是當(dāng)前較為認(rèn)同的一種觀點[6-8]。一些參與天然橡膠分子合成的蛋白質(zhì)，如橡膠延伸因子、橡膠轉(zhuǎn)移酶和小橡膠粒子膜蛋白等都位于橡膠粒子膜上[9-13]，而天然橡膠的直接來源-橡膠烴則包被在膜內(nèi)[6,14]。橡膠粒子表面帶負(fù)電荷，這一特征被認(rèn)為是膠乳形成穩(wěn)定膠體系統(tǒng)的主要原因。

黃色體是一種具有液泡和溶酶體性質(zhì)的小泡，由一層單位膜包被而成，它是膠乳中除橡膠粒子之外的數(shù)量最多的細(xì)胞器[15]。黃色體膜具有良好的流動性和通透性，且對壓力和滲透敏感，在低滲條件下容易膨脹破裂。黃色體膜上含有多種重要的蛋白質(zhì)[16-18]，大量磷脂酸可能是黃色體表面帶負(fù)電荷的主要原因[19-20]。黃色體內(nèi)含物為酸性，含有大量的陽離子小分子物質(zhì)和可溶性蛋白質(zhì)，其中標(biāo)志性蛋白是酸性磷酸酶，由于該酶不存在于膠乳細(xì)胞質(zhì)（即C-乳清）中，通常通過檢測C-乳清中該酶的活性來衡量黃色體的破裂程度[21-22]。黃色體破裂指數(shù)是橡膠樹排膠生物學(xué)研究中的一個重要參數(shù)。由于黃色體的內(nèi)膜及內(nèi)含物中具有促發(fā)橡膠粒子凝集的因子[17,23-25]，所以黃色體通常被認(rèn)為是膠乳的凝固系統(tǒng)；這些蛋白質(zhì)中含有大量的幾丁質(zhì)酶、橡膠素等抗菌蛋白，所以黃色體也被認(rèn)為是乳管傷口防御病原物入侵的生化防御系統(tǒng)[24,26]。

F-W復(fù)合體為雙層單位膜包被的細(xì)胞器。根據(jù)FW復(fù)合體具有雙層單位膜、嗜鋨粒子、類胡蘿卜素和多酚氧化酶等特點，結(jié)合乳管分化過程中F-W復(fù)合體的發(fā)育特征，F(xiàn)-W復(fù)合體被認(rèn)為是由一般的質(zhì)體特化而來[2]，但目前對其功能尚不是很清楚。

對于乳管細(xì)胞和其他薄壁細(xì)胞共有的細(xì)胞器在此則不再贅述。

1.3 乳管細(xì)胞質(zhì)

橡膠粒子、黃色體和F-W復(fù)合體以及其他細(xì)胞器都懸浮在乳管細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)即C-乳清中。C-乳清中含有大量的蛋白質(zhì)，目前認(rèn)為與橡膠生物合成相關(guān)的一些蛋白酶[11,14,27]以及與膠乳凝集相關(guān)的一些蛋白質(zhì)[23,28]也存在于其中。C-乳清中還含有大量可溶性的其他低分子量有機物和無機礦物質(zhì)[29]，如蔗糖、硫醇、抗壞血酸、核苷酸、無機磷、鉀和鎂離子等，這些成分含量的高低與膠乳代謝密切相關(guān)，也與膠乳的滲透勢形成相關(guān)，是膠乳重要的生理參數(shù)[30]。

C-乳清的pH值為6.5 ～7.3[15]，近中性，但也受乙烯利刺激以及黃色體穩(wěn)定性等其他因素的影響。膠乳的pH值是一個重要的生理參數(shù)，許多生化反應(yīng)都受其調(diào)節(jié)。膠乳的pH值升高，即發(fā)生堿化(pH 7.0 ～7.5)時，能促進(jìn)橡膠的生物合成[16,31]，也影響膠乳的排膠[24]。

乳管的細(xì)胞學(xué)知識是理解天然橡膠形成的生化基礎(chǔ)，也是理解排膠生物學(xué)的基礎(chǔ)。正確認(rèn)識乳管對于割膠制度的改進(jìn)和產(chǎn)量刺激技術(shù)的發(fā)展都是必不可少的。

2 橡膠樹乳管排膠動力的研究

橡膠樹的排膠是一個由急到緩的過程，排膠對膠乳產(chǎn)量的影響主要表現(xiàn)在膠乳流速和排膠延續(xù)時間兩個方面。乳管內(nèi)的高膨壓是排膠的初動力，促使膠乳在割膠后以高速流出乳管。隨后大量水分進(jìn)入乳管形成稀釋效應(yīng)，即不僅稀釋膠乳降低粘度，而且增大乳管的膨壓，保持一定的排膠壓力，因此構(gòu)成了乳管排膠的繼動力。

2.1 乳管膨壓是排膠初動力

成熟乳管的封閉性結(jié)構(gòu)和特殊的內(nèi)含物導(dǎo)致了完整的乳管內(nèi)部存在極高的膨壓，高達(dá)10 ～15個大氣壓[32-33]。當(dāng)割膠切開乳管時，乳管的封閉結(jié)構(gòu)被破壞，開放的割口壓力與外界大氣壓相同，但離開割口的組織內(nèi)部仍然存在不同的壓力，并且由外到內(nèi)逐步增加形成一個壓力梯度。這一壓力梯度驅(qū)動膠乳向外涌流，形成了膠乳外排初始階段的主動力。

Buttery和Boatman對橡膠樹韌皮部的膨壓進(jìn)行研究[34-35]，發(fā)現(xiàn)不同品種、樹干不同高度以及不同的氣溫和空氣濕度都對膨壓存在影響。一天中橡膠樹韌皮部的膨壓也存在明顯的規(guī)律變化，通常清晨膨壓處于7.9 ～15個大氣壓，但隨后逐步降低，到晚上又逐漸恢復(fù)，因此，生產(chǎn)中割膠時間通常在凌晨也是基于在這一時間段膨壓最高的緣故[36]。膨壓的高低以及在高值維持時間的長短對排膠無疑是存在明顯影響的[35,37-38]，但由于當(dāng)前膨壓測定技術(shù)存在一定缺憾[36]，目前對乳管膨壓的研究受到明顯的限制，近年對膨壓的研究極少，因此取得的進(jìn)展也少。An等[39]對壓力探針進(jìn)行了改進(jìn)，開發(fā)了一種能實時監(jiān)測韌皮部膨壓的技術(shù)，為獲取橡膠樹排膠中膨壓變化的可靠數(shù)據(jù)提供了可能。

2.1.1 細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)與膨壓的關(guān)系 細(xì)胞壁的硬度與剛性都與膨壓的形成密切相關(guān)[40-41]，而剛性與硬度則由細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)特征來決定。高等植物的細(xì)胞壁根據(jù)結(jié)構(gòu)可以劃分為初生壁，次生壁和胞間層。次生壁主要在植物細(xì)胞停止伸長進(jìn)行次生加厚時在初生壁的內(nèi)側(cè)沉積形成，主要存在于植物的機械強度高的組織當(dāng)中，由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素等組成[42]。木質(zhì)素與植物細(xì)胞壁中纖維素、半纖維素等相互交聯(lián)形成復(fù)雜的網(wǎng)格結(jié)構(gòu)，強化了細(xì)胞壁抵抗細(xì)胞膨壓的能力，特別是在木質(zhì)部傳輸水分的過程，為細(xì)胞提供強有力的物理支撐，防止因膨壓變化導(dǎo)致的細(xì)胞塌陷[43-44]，而且作為屏障結(jié)構(gòu)可以加強對細(xì)胞壁的保護(hù)從而使植物體免受各種病原物的侵害。木質(zhì)素在維持植物正常結(jié)構(gòu)、運輸水分和養(yǎng)料以及抵抗不良環(huán)境的侵襲中起重要作用[45-48]。

橡膠樹的膨壓與排膠密切相關(guān)，而細(xì)胞壁的主要成分木質(zhì)素含量的高低與膨壓相關(guān)[49-51]，因此，研究橡膠樹木質(zhì)化的過程及其調(diào)控將為從細(xì)胞壁物理性能為切入點來研究排膠奠定基礎(chǔ)。近年來，隨著分子生物學(xué)和基因組學(xué)等學(xué)科的發(fā)展，植物細(xì)胞木質(zhì)化及其分子調(diào)控研究成為植物學(xué)領(lǐng)域研究的熱點，并取得了多方面的進(jìn)展[52-55]。木質(zhì)素單體的生物合成途徑已經(jīng)較清晰，在細(xì)胞的胞質(zhì)中，從苯丙氨酸脫氨開始，隨后發(fā)生一系列的羥基化、甲基化和還原反應(yīng)，主要包括3個步驟：第一，苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia lyase,PAL)、肉桂酸羥化酶(cinnamate 4-hydroxylase,C4H)、羥基苯乙烯CoA連接酶(4-coumaric acid:coenzyme a ligase,4CL)參與的苯丙烷途徑；第二，咖啡酸-O-轉(zhuǎn)甲基酶(catechol-O-methyltransferase,COMT)、阿魏酸鹽5-羥化酶(ferulate 5-hydroxylase,F5H)參與的單體甲基化反應(yīng)；第三，肉桂酰-CoA還原酶(cinnamoyl CoA reduc-tase,CCR)、肉桂醇脫氫酶(cinnamyl alcohol dehydro-genase,CAD)參與的單體合成。由于木質(zhì)素單體的合成是發(fā)生在胞質(zhì)中，還需要從合成部位穿過細(xì)胞膜并進(jìn)入發(fā)育中的細(xì)胞壁這一轉(zhuǎn)運過程。因此，細(xì)胞壁的木質(zhì)化是一個復(fù)雜的生命過程。目前，人們以楊樹為模式植物，通過文庫篩選分離出與楊樹木質(zhì)素生物合成有關(guān)的酶基因和一些啟動子[56]，其中主要包括PAL、COMT、4CL、CCR、CAD和咖啡酰輔酶A/5-羥基阿魏酰輔酶A-O-甲基轉(zhuǎn)移酶(Caffeoyl-coenzymeAO-methyltransferase,CCoAOMT)。人們發(fā)現(xiàn)木質(zhì)素的合成和聚合途徑還受轉(zhuǎn)錄因子、microRNA以及激素等多種因素的調(diào)控[48]，其中以NAC-MYB轉(zhuǎn)錄因子家族成員為主體的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)目前研究得較為清楚[57-59]。關(guān)于木質(zhì)素合成以及調(diào)控等相關(guān)分子研究目前主要是針對楊樹、擬南芥以及苜蓿等植物展開的，有關(guān)橡膠樹的研究極少。晁金泉等[50]對橡膠樹HbCCoAOMT基因進(jìn)行了克隆及表達(dá)分析，認(rèn)為在橡膠樹中木質(zhì)素含量降低有利于維持高膨壓而促進(jìn)排膠，HbCCoAOMT基因表達(dá)高低與乳管細(xì)胞壁的木質(zhì)素含量有關(guān)；劉彤和仇鍵等[60-61]則利用轉(zhuǎn)基因擬南芥對橡膠樹HbMYB52、HbMYB20基因進(jìn)行了分析，認(rèn)為這些轉(zhuǎn)錄因子基因與細(xì)胞次生壁形成調(diào)控相關(guān)。橡膠樹木質(zhì)素的相關(guān)研究還處在起步階段，進(jìn)行系統(tǒng)而深入的研究對闡述排膠動力以及分析橡膠樹植物細(xì)胞的形態(tài)建成都是很有必要的。

2.1.2 細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含物與膨壓的關(guān)系 乳管細(xì)胞內(nèi)的水勢除了與細(xì)胞壁的組成和結(jié)構(gòu)有關(guān)外，還與其細(xì)胞內(nèi)特殊的膠體組成有關(guān)。橡膠粒子外層帶有負(fù)電荷，能吸附水分子，在細(xì)胞中形成穩(wěn)定的膠體。由于橡膠粒子在乳管細(xì)胞中數(shù)量最多，粒子表面積極大，吸附的水分子數(shù)量極其龐大，因此具有顯著的束縛水分的功能[62]。除此之外，胞質(zhì)中其他的溶質(zhì)分子都參與了滲透勢的形成，而高的滲透勢也導(dǎo)致了細(xì)胞內(nèi)高的膨壓[30,63-64]。胞質(zhì)中細(xì)胞器尤其是橡膠粒子的生成，內(nèi)含物的合成和運輸以及水分代謝無疑對膨壓的形成都有明顯的影響。

2.2 水分運輸及其稀釋效應(yīng)是排膠的繼動力

目前，普遍認(rèn)為橡膠樹是通過水分的滲透來調(diào)節(jié)和控制排膠速度，這種“滲透調(diào)節(jié)”導(dǎo)致的“稀釋效應(yīng)”是排膠的主要繼動力。

水分在植物體內(nèi)的大量運輸是通過維管系統(tǒng)長距離運輸而實現(xiàn)，在植物體內(nèi)的跨膜運輸則主要是通過水通道蛋白。植物水通道蛋白(Aquaporin，AQP)是廣泛存在于原核和真核細(xì)胞膜上轉(zhuǎn)運水的特異蛋白孔道[65-66]，作為質(zhì)膜和液泡膜上專一、高效的水分跨膜雙向運輸通道[67]，它可以快速靈敏地調(diào)節(jié)細(xì)胞間和細(xì)胞內(nèi)的水分流動，維持細(xì)胞內(nèi)滲透平衡和粒子平衡，從而調(diào)節(jié)植物的生長代謝。AQP的表達(dá)和活性受植物體內(nèi)乙烯、pH、Ca2+、活性氧等多種因素調(diào)節(jié)[68-72]，與逆境響應(yīng)也密切相關(guān)，可以抵抗植物由于水分缺失造成的危害，應(yīng)對植物遭受的離子脅迫、滲透脅迫和氧化脅迫等非生物脅迫[73-74]。Kim等[75]利用細(xì)胞壓力探針研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞膨壓也是AQP活動的調(diào)節(jié)因素之一，可見膨壓和水分的運輸也是密切相關(guān)的。

橡膠樹中乳管的水分稀釋效應(yīng)是乳管排膠的繼動力，但成熟的乳管細(xì)胞間沒有胞間連絲,乳管和周圍薄壁細(xì)胞間水分的快速交換主要是通過AQP途徑進(jìn)行，因此分析AQP表達(dá)對于研究橡膠樹的排膠動力以及膠乳產(chǎn)量高低具有重要意義。Fotiadis等[76]認(rèn)為質(zhì)膜水通道蛋白(PIPs)負(fù)責(zé)水分的吸收和外排，液泡膜內(nèi)在蛋白(TIPs)負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)膨壓。Tungngoen等[77]推測橡膠樹內(nèi)部樹皮液泡膜水通道蛋白(TIP)參與了韌皮部組織細(xì)胞膨壓的調(diào)節(jié)，與排膠密切相關(guān)。Tungngoen等[78]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)乙烯利刺激后，HbPIP2;1在橡膠樹韌皮部組織和乳管中均上調(diào)，HbTIP1;1在韌皮部中下調(diào)而在乳管中上調(diào)，由此推測橡膠樹樹皮韌皮部HbPIP2;1的上調(diào)和HbTIP1;1的顯著下調(diào)促進(jìn)了橡膠樹木質(zhì)部與韌皮部的水分循環(huán)。莊海燕[79]克隆了HbPIP1和HbPIP2，發(fā)現(xiàn)橡膠樹中乙烯利處理對HbPIP1和HbPIP2具有明顯的時效性，HbPIP1和HbPIP2基因受乙烯利的誘導(dǎo)表達(dá)，其表達(dá)量均在乙烯利處理6 h后達(dá)到最高，認(rèn)為乙烯利刺激短時間內(nèi)可能增強了AQP基因的顯著表達(dá)，從而加強了乳管水分的供應(yīng)，有利于膠乳的稀釋，加大排膠動力從而有利于增產(chǎn)。乙烯利作為一種高效刺激劑可大幅提高橡膠樹的產(chǎn)量，但目前對其刺激增產(chǎn)的確切機制仍不清楚，人們推測乙烯利刺激橡膠樹增產(chǎn)可能與其對橡膠樹割面附近部分AQP的調(diào)控相關(guān)。通過乙烯利刺激增長系統(tǒng)，可以得出AQP與排膠繼動力相關(guān)?？傮w來看，橡膠樹AQP的相關(guān)研究目前尚不系統(tǒng)，為加深對排膠動力的理解，有必要對其進(jìn)一步深入解析。

3 橡膠樹乳管排膠阻力的研究

割膠是獲取膠乳產(chǎn)量的最后環(huán)節(jié)，割膠后維持較長的排膠時間和較高的排膠速度是膠乳產(chǎn)量的保證，但是割膠后必然存在排膠速度降低、割口封閉終止排膠這一現(xiàn)象。乳管到底是怎樣停止排膠的，有哪些因素對排膠形成了阻礙，從排膠阻力的角度對排膠生物學(xué)進(jìn)行研究一直受到人們的關(guān)注。

3.1 乳管傷口堵塞物的形成是影響排膠的重要因素

乳管傷口停止排膠的假說最初是由Arisz[80]和Frey-Wyssling[63]提出的，他們認(rèn)為在排膠的過程中乳管會因為膨壓的降低而收縮，尤其在割口的末端收縮后的乳管內(nèi)徑可能很窄而足以阻礙排膠。Gooding等[38]研究發(fā)現(xiàn)割膠后割口下方乳管直徑的確出現(xiàn)收縮，每根乳管直徑減少3.5 ～5.7 μm，但乳管的平均直徑超過20 μm，所以乳管的這種局部微量收縮可能會減緩膠乳排出的速度，但不可能導(dǎo)致膠乳停排。Southorn[81]利用更精密的儀器對割口下方的測量結(jié)果支持了Gooding的結(jié)論，即乳管直徑局部微量縮減對排膠造成了障礙但不足以導(dǎo)致膠乳停排。

3.1.1 乳管傷口堵塞物的發(fā)現(xiàn) 在沒有更充分的證據(jù)下，人們普遍認(rèn)為排膠最后停止的原因是當(dāng)排膠速度逐漸減緩時膠乳在割口凝固造成的。Boatman等[82]的實驗改變了這一觀點。他們在同一株橡膠樹上連續(xù)割膠幾次，即每次割去大約1 mm厚的樹皮而割膠間隔時間僅10 min，結(jié)果得到一個每一次割膠后排膠速度顯著回升的“階梯式”排膠速度曲線，說明在2次割膠的間隔期間乳管傷口末端很快形成了一種排膠障礙物-稱之為堵塞物，并且這種堵塞物十分靠近乳管割口（割去1 mm厚的樹皮就能把它除去）。這一堵塞物的厚度不大，但它導(dǎo)致了排膠速度的降低和最終的停排，對排膠速度和時間起決定作用。這一實驗是排膠生理學(xué)研究中最重要的實驗之一，使得人們認(rèn)識到乳管傷口堵塞物的形成才是排膠的主要阻力。

3.1.2 乳管傷口堵塞物的性質(zhì)及其作用 乳管傷口堵塞物作為最主要的排膠阻力，其形成和調(diào)控機制成為了排膠生理學(xué)中研究的重點。目前關(guān)于乳管傷口堵塞物的性質(zhì)及其在乳管傷口中的作用主要有兩種觀點。

第一種觀點認(rèn)為，乳管傷口堵塞物是凝固的橡膠粒子即橡膠凝塊組成的，其作用是堵塞乳管傷口，防止膠乳流失。以Southorn[83]提出的“膠蓋-膠塞”模型為基礎(chǔ)，人們提出了“電中和”假說[20]、“酶”假說[84-85]、“凝集素”假說[86]以及有黃色體膜參與的“凝集素”假說[25,28,87]。黃色體的內(nèi)膜及內(nèi)含物中具有促發(fā)橡膠粒子凝集的因子[25,86]，包括大量的陽離子蛋白和其他的無機陽離子，人們認(rèn)為，在乳管排膠過程中由于膨壓和滲透壓的改變，對壓力、滲透勢敏感的黃色體在乳管傷口破裂，黃色體的促凝集因子得以釋放，最終導(dǎo)致了與這些因子空間隔離的橡膠粒子發(fā)生凝集并最終凝固。橡膠粒子凝固形成的橡膠塊是堵塞物的核心，而黃色體是膠乳的促凝固系統(tǒng)。

第二種觀點認(rèn)為，乳管傷口堵塞物是“蛋白質(zhì)網(wǎng)”、細(xì)胞骨架和橡膠粒子聚集物組成的，其作用不僅是防止膠乳流失的物理屏障，而且是防御病原物入侵的生化屏障。郝秉中等[88]最早發(fā)現(xiàn)，割膠后很短的時間內(nèi)在乳管傷口末端會形成一種蛋白質(zhì)性質(zhì)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，隨著排膠的進(jìn)行，“蛋白質(zhì)網(wǎng)”變得更加明顯，并且其主要分布在割口下0.7 mm范圍內(nèi)。超顯微觀察發(fā)現(xiàn)，“蛋白質(zhì)網(wǎng)”間隙中被聚集的橡膠粒子填充，直到停排時，橡膠粒子仍然保持膜結(jié)構(gòu)的完整性而未發(fā)生凝固。乳管傷口處的橡膠凝塊是在乳管傷口堵塞、停排后發(fā)生的[89]，可見橡膠凝塊的形成不是乳管堵塞的原因。

最近，筆者揭示了“蛋白質(zhì)網(wǎng)”形成和積累的生化機制以及“蛋白質(zhì)網(wǎng)”的主要成分對橡膠粒子的凝集效應(yīng)。Shi等[24]證明了構(gòu)成“蛋白質(zhì)網(wǎng)”的主要成分是來自黃色體破裂釋放出的幾種主要蛋白質(zhì)—橡膠素、橡膠素前體、β-1,3-葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶，這些蛋白質(zhì)在中性偏堿性的pH條件下發(fā)生相互作用，形成“蛋白質(zhì)網(wǎng)”。通過β-1,3-葡聚糖酶與細(xì)胞骨架肌動蛋白互作，“蛋白質(zhì)網(wǎng)”在乳管傷口末端逐漸積累[24,90]。關(guān)于細(xì)胞骨架，高政權(quán)等[91]研究早就發(fā)現(xiàn)乳管傷口末端在排膠過程中會逐漸積累肌動蛋白，這些研究都表明肌動蛋白也參與了乳管傷口的堵塞。膠乳流經(jīng)“蛋白質(zhì)網(wǎng)”時，橡膠粒子以及破裂的黃色體膜碎片與“蛋白質(zhì)網(wǎng)”結(jié)合[17,23]，可見“蛋白質(zhì)網(wǎng)”在堵塞物的形成中起到了核心和橋梁的作用。

乳管傷口堵塞物的逐漸形成和積累是一個復(fù)雜的生化過程，堵塞物中“蛋白質(zhì)網(wǎng)”的主要組分橡膠素、β-1,3-葡聚糖酶、幾丁質(zhì)酶以及肌動蛋白都與植物抗性有關(guān)[92-96]，因此，可以認(rèn)為堵塞物是乳管傷口防御病原物入侵的一道生化屏障。Hao等[89]發(fā)現(xiàn)橡膠樹乳管傷口缺乏“蛋白質(zhì)網(wǎng)”時更易發(fā)展成死皮樹證明了這一觀點。

3.2 堵塞物形成的調(diào)控因子

雖然對堵塞物的性質(zhì)和作用目前存在不同的看法，但黃色體在堵塞物的形成中起到至關(guān)重要的作用這一觀點是共同的。膠乳的pH值、活性氧及其清除系統(tǒng)等影響黃色體穩(wěn)定性的因子被認(rèn)為對堵塞物的形成起調(diào)節(jié)作用。最近研究認(rèn)為C-乳清中的一些蛋白質(zhì)以及激素乙烯也與堵塞物形成有關(guān)。堵塞物的形成和調(diào)控是一個復(fù)雜的過程，目前相關(guān)研究還較少，對其深入的研究將為闡明排膠機理奠定基礎(chǔ)。

3.2.1 膠乳pH值 橡膠樹排出的膠乳是乳管細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，其pH值實際上反映的是細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)即C-乳清的pH值。C-乳清pH值中性偏堿，而懸浮在基質(zhì)中的黃色體內(nèi)含物pH值為酸性（約5.5）[97]，在黃色體破裂后，空間隔離被打破，其內(nèi)含物釋放后對膠乳pH值存在明顯影響。史敏晶等[98]研究表明在C-乳清pH值條件下，黃色體膜碎片和β-1,3-葡聚糖酶可以結(jié)合，適當(dāng)提高環(huán)境的pH值，二者的結(jié)合進(jìn)一步增強。Shi等[24]發(fā)現(xiàn)“蛋白質(zhì)網(wǎng)”中的蛋白質(zhì)之間發(fā)生互作通常需要在中性偏堿性的pH值條件下進(jìn)行，因此認(rèn)為pH值對“蛋白質(zhì)網(wǎng)”的形成存在影響。Brzozowska-Hanower等[99]研究表明膠乳產(chǎn)量與C-乳清pH值正相關(guān)，與黃色體內(nèi)含物pH值負(fù)相關(guān)，與它們的差值正相關(guān)。可見，膠乳pH值對堵塞物的形成有影響進(jìn)而影響了排膠。

3.2.2 活性氧及其清除系統(tǒng) 活性氧是引起膜系統(tǒng)不穩(wěn)定的一個因子，膠乳活性氧水平提高，通常伴隨黃色體破裂指數(shù)升高[100-101]。黃色體的破裂有利于乳管傷口堵塞物的形成，所以，活性氧的大量產(chǎn)生為堵塞物的形成提供了大量原料。另外，“蛋白質(zhì)網(wǎng)”中主要的蛋白成分，如橡膠素等，含有相當(dāng)數(shù)量的半胱氨酸殘基，由此推測活性氧也有利于“蛋白質(zhì)網(wǎng)”的形成。

橡膠樹中存在 SOD、CAT、POD、R-SH（硫醇類化合物）、抗壞血酸等活性氧清除系統(tǒng)[102]。SOD、CAT、POD等酶促系統(tǒng)能將體內(nèi)產(chǎn)生的活性氧轉(zhuǎn)化分解，除去其對乳管細(xì)胞產(chǎn)生的毒害。R-SH等非酶促系統(tǒng)能夠防止不飽和脂肪酸受氧自由基的進(jìn)攻而發(fā)生一系列自由基反應(yīng)，從而保護(hù)黃色體及其他細(xì)胞器的完整性[103]。因為R-SH的含量與黃色體的穩(wěn)定性、排膠時間和膠乳產(chǎn)量正相關(guān)，R-SH很早就被認(rèn)為是黃色體的穩(wěn)定劑，是乳管系統(tǒng)的保護(hù)劑[104-105]，所以，R-SH很可能是堵塞物形成的負(fù)調(diào)控因子。

3.2.3 乙烯 人們發(fā)現(xiàn)乙烯能夠刺激橡膠樹增產(chǎn)后，乙烯利（一種乙烯釋放劑）被廣泛應(yīng)用于割膠生產(chǎn)，乙烯利刺激技術(shù)極大的提高了天然橡膠的產(chǎn)量并減少了勞動用工，使得橡膠事業(yè)的發(fā)展進(jìn)入一個新的里程。人們對乙烯利刺激橡膠樹增產(chǎn)的機制進(jìn)行了大量的研究[106-107]，認(rèn)為乙烯利刺激增產(chǎn)主要包括促進(jìn)產(chǎn)膠和促進(jìn)排膠兩個方面，但其中最主要的是促進(jìn)排膠[108]。目前，關(guān)于乙烯利促進(jìn)排膠也主要有兩種觀點，一種認(rèn)為乙烯通過增加黃色體的穩(wěn)定性而延緩乳管傷口堵塞物形成[16,109]；另一種認(rèn)為黃色體的穩(wěn)定性與乙烯利延長排膠時間沒有太大關(guān)系，尤其發(fā)現(xiàn)在乙烯氣體刺激和短線割膠條件下或者高濃度乙烯利刺激條件下，排膠持續(xù)時間顯著長于低濃度乙烯利刺激，而此時的黃色體大量破裂這一現(xiàn)象，說明乙烯利刺激延長排膠時間不是通過提高黃色體穩(wěn)定性實現(xiàn)的[100,110-111]。王冬冬等[112]研究發(fā)現(xiàn)乙烯利刺激后增加了排膠過程中“蛋白質(zhì)網(wǎng)”的積累，降低了排膠初速度。Shi等[23]發(fā)現(xiàn)乙烯可通過調(diào)節(jié)C-乳清中的3-磷酸-甘油醛脫氫酶以及Hev b7等蛋白的表達(dá)來影響堵塞物形成。由此可見，乙烯參與了調(diào)節(jié)堵塞物的形成，但其作用是促進(jìn)還是抑制尚有爭議。

3.2.4 膠乳過敏原蛋白Hev b7黃色體作為促凝集系統(tǒng)，誘發(fā)橡膠粒子凝集的因子通常被隔離在黃色體中，所以懸浮在乳管細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中的橡膠粒子處于穩(wěn)定的去凝集狀態(tài)。一旦黃色體破裂，這些因子被釋放出來與橡膠粒子相互作用，導(dǎo)致橡膠粒子凝集以及隨后發(fā)生膜融合進(jìn)而發(fā)生膠乳凝固。從乙烯利刺激促進(jìn)黃色體大量破裂但顯著延長排膠持續(xù)時間的效應(yīng)來看，還存在橡膠粒子凝集的抑制因子。法國學(xué)者認(rèn)為，這種抑制因子是黃色體中的幾丁質(zhì)酶[86]，但是，Wang等[17]證明黃色體中的幾丁質(zhì)酶有增強β-1,3-葡聚糖酶對橡膠粒子凝集的效應(yīng)。黃色體破裂后這些蛋白是同時釋放的，幾丁質(zhì)酶的效應(yīng)是促進(jìn)橡膠粒子凝集更為合理。泰國學(xué)者認(rèn)為，膠乳凝集的抑制因子是C-乳清中的一種40 kDa蛋白質(zhì)[28]，Shi等[23]從C-乳清中分離鑒定到一種44 kDa的膠乳過敏原蛋白Hev b7，該蛋白和40 kDa蛋白是同一種蛋白，并證明其能有效拮抗由黃色體膜碎片、B-乳清、橡膠素、β-1,3-葡聚糖酶以及C-乳清中的一種3-磷酸-甘油醛脫氫酶促發(fā)的橡膠粒子凝集，并且該蛋白的表達(dá)量受乙烯利調(diào)控。膠乳過敏原蛋白Hev b7是一種橡膠粒子凝集的廣譜性抑制因子，對堵塞物的形成起負(fù)調(diào)控作用，但目前關(guān)于Hev b7如何調(diào)控橡膠粒子的凝集尚不清楚。

除上述主要調(diào)控因子之外，研究者還發(fā)現(xiàn)多酚氧化酶(PPO)也具有凝集橡膠粒子的作用[113-115]。植物中的PPO與抗病蟲害密切相關(guān)，也是非常重要的一種防御蛋白[116-117]，PPO參與堵塞物的形成調(diào)控進(jìn)一步證明了堵塞物具有生化防御功能。在橡膠樹中，是否還有其他未知的因子對乳管堵塞物的形成起調(diào)控作用，值得進(jìn)一步探索。

4 展望

割膠生產(chǎn)是橡膠生產(chǎn)的中心環(huán)節(jié)和關(guān)鍵技術(shù)，勞動投入占整個橡膠生產(chǎn)勞動的70%以上。膠工短缺和老齡化問題已成為中國天然橡膠產(chǎn)業(yè)生存和發(fā)展的瓶頸。提高割膠效率，降低膠工勞動強度，增加勞動收入以期緩解膠工短缺是當(dāng)前割膠制度改革的基本要求，而對排膠機制系統(tǒng)全面的科學(xué)認(rèn)識是新的割膠技術(shù)研發(fā)的基礎(chǔ)。

橡膠樹排膠機制的研究一直受到國內(nèi)外研究者的重視，并取得了一系列有意義的研究結(jié)果，但目前關(guān)于排膠機制的研究相對緩慢和滯后。隨著科學(xué)技術(shù)手段的日益更新，從分子生物學(xué)層面解析排膠動力、阻力的形成以及調(diào)節(jié)，并篩選排膠通暢的分子標(biāo)記對全面解析排膠機制并研發(fā)新的割膠制度顯得尤為重要。筆者根據(jù)當(dāng)前的研究現(xiàn)狀，對本領(lǐng)域未來研究提出以下幾點看法：

（1）從細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的形成來解析乳管膨壓。乳管膨壓作為排膠的初動力，不同的品系存在差異[34]，可見膨壓的高低是具有種質(zhì)特性的。雖然已有研究表明，乳管胞質(zhì)對膨壓也有影響[30,63-64]，但胞質(zhì)的高滲透勢主要與水分運輸和代謝有關(guān)；根據(jù)細(xì)胞壁的硬度與剛性都與膨壓的形成密切相關(guān)[40-41]，所以應(yīng)優(yōu)先解析橡膠樹樹皮組織尤其是乳管細(xì)胞壁的形成。作為細(xì)胞壁主要成分的木質(zhì)素，其含量的高低與膨壓相關(guān)[49-51]，但有關(guān)橡膠樹乳管細(xì)胞壁木質(zhì)素的生物合成與調(diào)控的相關(guān)研究目前基本處于空白，利用分子生物學(xué)手段，從木質(zhì)素形成調(diào)控等方面來研究橡膠樹膨壓這一排膠初動力形成的分子機理，不僅能為闡明排膠機制奠定基礎(chǔ)，補充目前這一研究的空白，而且也能為高排膠動力的種質(zhì)篩選提供分子標(biāo)記。

（2）從水通道蛋白的表達(dá)以及乙烯對其表達(dá)的調(diào)控方面來解析排膠繼動力-水稀釋效應(yīng)。水分運輸不僅影響排膠初動力膨壓，而且是排膠繼動力的主要來源。乳管細(xì)胞不具備胞間連絲，因此研究水通道蛋白的表達(dá)對于分析這一特異結(jié)構(gòu)的水分運輸具有重要的意義[76-77]。乙烯利刺激顯著增產(chǎn)也有研究表明與水通道蛋白的表達(dá)有關(guān)[78-79]。但迄今為止，橡膠樹水通道蛋白的相關(guān)研究并不系統(tǒng)，也不深入。比較分析不同排膠特性種質(zhì)的水通道蛋白表達(dá)并對其活性進(jìn)行分析，篩選水稀釋效應(yīng)相關(guān)的分子標(biāo)記，同時，探尋乙烯利刺激對水通道蛋白表達(dá)的影響，闡明乙烯刺激增產(chǎn)的機理，這些都將是我們未來值得研究的方向。

（3）從以“蛋白質(zhì)網(wǎng)”為核心的乳管傷口堵塞物的形成和調(diào)控方面來解析排膠的阻力。對“蛋白質(zhì)網(wǎng)”具有生化屏障作用的堵塞理論的提出對研究乳管傷口排膠阻力提出了一條新的方向?！暗鞍踪|(zhì)網(wǎng)”的形成，橡膠粒子凝集和去凝集的調(diào)控機制是乳管傷口堵塞研究的核心問題[88-90]，一直受到關(guān)注，但其細(xì)節(jié)至今仍不清楚?！暗鞍踪|(zhì)網(wǎng)”的核心組分是如何實現(xiàn)互作的，又受到哪些因素的調(diào)節(jié)？細(xì)胞骨架肌動蛋白在“蛋白質(zhì)網(wǎng)”的積累中起到錨定作用[24]，如何通過調(diào)節(jié)這種錨定而調(diào)節(jié)堵塞物的形成？橡膠粒子如何被捕獲而粘附在“蛋白質(zhì)網(wǎng)”的間隙中？為何一種膠乳過敏原蛋白Hev b7能有效拮抗不同的促進(jìn)因子蛋白質(zhì)對橡膠粒子的凝集效應(yīng)?對這些問題的思考和研究不僅能從理論上完善排膠機制，而且可從減緩或者解除堵塞物的形成角度為橡膠生產(chǎn)中研發(fā)新型的排膠調(diào)節(jié)劑提供理論支持。

利用細(xì)胞生物學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、分子生物學(xué)以及基因組學(xué)等學(xué)科技術(shù)，對橡膠樹的乳管排膠動力和阻力進(jìn)行系統(tǒng)深入的研究，利用不同的分子標(biāo)記篩選排膠通暢的優(yōu)良種質(zhì)，為現(xiàn)代分子育種奠定基礎(chǔ)；研發(fā)調(diào)節(jié)排膠的生化因子，最后實現(xiàn)人為調(diào)節(jié)排膠，這些將是我們未來的目標(biāo)，這些研究對于天然橡膠產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展具有深遠(yuǎn)的意義。