雷亞琴，羅靜思，歐陽魯平，楊祚建，黃朋，易賞，費冬梅，何升*

胎兒頸部淋巴水囊瘤(cervical cystic hygroma，CCH)是淋巴管瘤的一種，主要由于胎兒淋巴系統(tǒng)發(fā)育異常，導致淋巴管阻塞擴張所形成的水囊狀淋巴管瘤。這種淋巴管發(fā)育畸形多于孕早期發(fā)生，是孕早期胎兒頸部透明層(nuchal translucency，NT)篩查中最常見的超聲異常[1]。CCH的發(fā)生與染色體異常及Noonan 綜合征、胎兒酒精綜合征等遺傳性綜合征相關[2]。染色體核型分析可檢測出染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)異常，是診斷胎兒染色體異常的“金標準”，但無法檢測小于5 Mb的拷貝數(shù)變異(copy number variation，CNV)。染色體微陣列技術(shù)(chromosome microarray analysis，CMA)因其高分辨率的檢測能力，可以檢出亞微觀的CNV，同時，也可以檢出染色體非整倍體、大片段缺失與重復，目前已常規(guī)應用于產(chǎn)前診斷，其主要技術(shù)包括單核苷酸多態(tài)性微陣列(single nucleotide polymorphism array,SNP array)、比較基因組雜交微陣列(array comparative genomic hybridization,aCGH)和低深度全基因組拷貝數(shù)變異測序(copy number variation sequencing,CNV-seq)[3]。與其他兩種技術(shù)相比，SNP array還能檢出多倍體、雜合性缺失和單親二倍體，近年來已經(jīng)廣泛應用于胎兒超聲結(jié)構(gòu)異常的產(chǎn)前診斷[4]。本研究采用SNP array和染色體核型分析對 170 例經(jīng)產(chǎn)前超聲診斷為胎兒CCH的孕婦進行產(chǎn)前診斷，探討胎兒CCH與染色體異常的關系，并分析SNP array聯(lián)合染色體核型分析在胎兒CCH產(chǎn)前診斷中的應用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年1月至2021年5月在廣西壯族自治區(qū)婦幼保健院經(jīng)超聲診斷為CCH的胎兒170例納入本研究，其中單胎樣本155例，15例為雙胎樣本。經(jīng)孕婦知情同意后，采集絨毛、羊水或臍血樣本進行遺傳學分析，所有樣本均進行了SNP array檢測，由于細胞培養(yǎng)失敗，有5例樣本未進行染色體核型分析。所有納入研究的孕婦年齡19～47歲，平均(31±6)歲，中位數(shù)為31歲；孕周11～32周，平均(16±5)周，中位數(shù)為13周。

1.2 CCH的超聲檢查

使用彩色多普勒超聲診斷儀，根據(jù)英國胎兒醫(yī)學基金會(Fetal Medicine Foundation,FMF)產(chǎn)前超聲檢查方法[5]，對孕婦腹部進行超聲掃查，測量胎兒頂臀長、NT厚度、胎兒頸項部軟組織厚度，同時按胎兒標準化超聲篩查切面運用連續(xù)順序追蹤超聲掃查法進行掃查及觀察胎兒顱內(nèi)結(jié)構(gòu)、鼻骨、心臟、胃泡、膀胱、臍帶腹壁入口、雙側(cè)上下肢等大體結(jié)構(gòu)。

1.3 染色體核型分析

針對超聲檢查診斷為CCH的胎兒，孕婦知情并簽署同意書后，對于孕早期孕婦，在B超引導下，經(jīng)腹部穿刺獲取胎兒絨毛；對于孕17～22周的孕婦，經(jīng)腹羊膜腔穿刺術(shù)抽取20 mL羊水，其中，10 mL直接進行DNA提取，另外10 mL用于染色體核型分析；對于孕周>22周者，經(jīng)皮臍靜脈穿刺術(shù)獲取1～2 mL臍帶血，0.5 mL直接進行DNA提取，剩下的用于染色體核型分析。對獲取的胎兒樣本進行細胞培養(yǎng)，以秋水仙素阻斷細胞有絲分裂，獲取中期細胞分裂相，收獲制片后進行染色體 G 顯帶分析。每份標本計數(shù)20個分裂相，分析5個核型，若出現(xiàn)嵌合體，計數(shù)分析至50個分裂相。參照人類遺傳學國際命名體制(ISCN 2016)對染色體核型命名。

1.4 SNP array檢測

采用廈門致善生物科技有限公司生產(chǎn)的Lab-Aid 820核酸提取Midi試劑盒(200116)，根據(jù)試劑盒說明書，提取臍帶血中的基因組DNA；利用天根生化科技(北京)有限公司生產(chǎn)的微量樣品基因組DNA提取試劑盒(DP316)提取絨毛和羊水中的基因組DNA。DNA采用Nanodrop2000分光光度計測定DNA濃度及純度。采用illumina公司的HumanCytoSNP-12芯片進行SNP array分析，根據(jù)標準操作流程對基因組DNA依次進行全基因組擴增、片段化、雜交和熒光染色，采用illumina公司的iScan芯片掃描儀對制備的基因芯片進行掃描，獲得的數(shù)據(jù)通過KaryoStudio1.4.3軟件進行分析。通過與DGV、ISCA、OMIM、DECIPHER、ClinVar等數(shù)據(jù)庫進行比對分析，根據(jù)染色體微陣列分析相關指南，將所檢出CNV進行致病性分類：① 致病性CNV；② 可能致病性CNV；③ 臨床意義不明CNV；④ 可能良性CNV；⑤ 良性CNV。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22軟件進行數(shù)據(jù)分析，孕婦年齡和孕周采用平均值、標準差和中位數(shù)進行描述,率的比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 染色體核型分析結(jié)果

165例CCH胎兒中，6例檢出核型多態(tài)，61例檢出染色體異常。染色體異常包括：57例染色體數(shù)目異常(34.5%，57/165)：26例特納綜合征(15.8%，26/165)，其中1例伴有7p22q22的倒位，1例為特納綜合征嵌合體(嵌合比例約為10%)；16例21-三體綜合征(9.7%，16/165)；12例18-三體綜合征(7.3%，12/165)；1例13-三體綜合征(0.6%，1/165)；1例47,XXX綜合征(0.6%，1/165)；1例為15號染色體三體的嵌合(嵌合比例約為4%)。4例染色體結(jié)構(gòu)異常(2.4%，4/165)：3例易位；1例為18號染色體長臂的等臂染色體的嵌合。詳見表1。

2.2 SNP array檢測結(jié)果

170例CCH胎兒中，71例檢出染色體異常，包括：59例染色體數(shù)目異常(34.7%，59/170)：27例特納綜合征(15.9%，27/170)，其中1例伴有致病性CNV(arr[hg19]16p11.2(29656093_30332203)x1)，1例為特納綜合征嵌合體(嵌合比例約為60%～80%)；17例21-三體綜合征(10%，17/170)，其中1例伴有8號染色體三體的嵌合(嵌合比例約為10%～20%)；12例18-三體綜合征(7%，12/170)；1例13-三體綜合征(0.6%，1/170)；1例47,XXX綜合征(0.6%，1/170)；1例為15號染色體三體的嵌合(嵌合比例約為10%～20%)。

除1例特納綜合征伴有致病性CNV外，在12例CCH胎兒中檢出了12種不同的CNV(7.1%，12/170)，其中有10例為致病性CNV，檢出率為5.9%(10/170)，2例為臨床意義不明的CNV。詳見表1。

10例致病性CNV的胎兒中，有3例均檢測到兩個致病性CNV；3例檢測到16p13.3區(qū)域約0.05 Mb的純合缺失，包含HBA1基因與HBA2基因，可導致α地中海貧血癥；1例DiGeorge綜合征；1例為3q22.1q29區(qū)域約65.2 Mb的重復；1例檢測到Xp21.1區(qū)域約0.16 Mb的純合缺失，包含DMD基因第46-50號外顯子，可導致假肥大性肌營養(yǎng)不良；1例檢測到20p13p12.3區(qū)域約6.8Mb的嵌合重復，但由于嵌合比例較低，且樣本為絨毛，孕中期重新抽羊水檢測，結(jié)果正常。另有2例胎兒檢測到的微缺失或微重復被評估為臨床意義不明CNV，1例為17p11.2區(qū)域約1.6 Mb的微重復，包含GRAP、ALDH3A2、AKAP10和B9D1等OMIM數(shù)據(jù)庫中明確致病的基因和13個未明確疾病的OMIM基因，以及其他30多個蛋白質(zhì)編碼基因；另1例為16p13.3區(qū)域約0.6 Mb的微缺失，包含1個OMIM致病基因RBFOX1，該基因的pHI分值為0.33%，提示其可能為單倍劑量不足基因。

2.3 兩種方法檢測結(jié)果的比較

170例樣本均成功進行了SNP array檢測。染色體核型分析中，5例樣本細胞培養(yǎng)失敗，因此只有165例進行了G顯帶的染色體核型分析。所以單獨采用SNP array對染色體異常的檢出率為41.8%(71/170)，而單獨采用染色體核型分析的異常檢出率為37.0%(61/165)，兩者比較差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.351，P>0.05)。兩者聯(lián)合對染色體異常的檢出率為41.8%(71/170)，與單獨SNP array和染色體核型分析相比，差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.119、0.231，P>0.05)。

除了細胞培養(yǎng)失敗的樣本外，兩種方法都成功檢出所有的染色體數(shù)目異常，但存在嵌合比例的差異。對于1例核型分析為特納綜合征的胎兒，SNP array除了檢測到特納綜合征外，還檢測到1個致病性CNV。此外，染色體核型分析檢出的3例易位及1例等臂染色體，SNP array均檢測到致病性CNV。

對于5例細胞培養(yǎng)失敗的樣本，SNP array檢測到2例為染色體數(shù)目異常，分別為特納綜合征和21-三體綜合征。同時，在98例染色體核型分析未見異常的CCH胎兒中，SNP array檢出8例CNV，增加了4.7%(8/170)的檢出率。

3 討論

胎兒的淋巴系統(tǒng)自孕6周由原始淋巴囊開始發(fā)育，至孕9～10 周，所有原始淋巴囊貫通，形成淋巴體系，從淋巴主干上向各個方向生長出淋巴管，淋巴管隨著血管系統(tǒng)進入各組織[6]。由于淋巴系統(tǒng)發(fā)育缺陷，或其他原因?qū)е绿红o脈壓升高，淋巴回流障礙時，可引起胎兒NT顯著增厚，表現(xiàn)為胎兒頸部直至全身的水囊樣改變[7]。CCH在胎兒發(fā)育異常中較為常見，其在出生的胎兒中發(fā)病率約為1/1 000～1/6 000，在流產(chǎn)胎兒中發(fā)病率高達1/750[8]。目前的研究顯示，CCH的預后不良，與胎兒染色體異常、先天性結(jié)構(gòu)異常、圍產(chǎn)期死亡顯著相關[9]。隨著超聲技術(shù)的廣泛開展，越來越多的淋巴水囊瘤胎兒得以在妊娠早期被檢出，同時及時行介入性產(chǎn)前診斷查找可能的病因，為是否終止妊娠提供最有力的依據(jù)。本研究采用染色體G顯帶和SNP array技術(shù)對170例CCH胎兒進行介入性產(chǎn)前診斷，染色體異常率為41.8%。其中，染色體非整倍體異常率為34.7%，以特納綜合征最常見，其他的非整倍體分別為21-三體綜合征、18-三體綜合征、13-三體綜合征、47,XXX綜合征和15號染色體三體的嵌合，與相關文獻報道的數(shù)據(jù)基本一致[9-10]。

染色體亞顯微層面結(jié)構(gòu)異常引發(fā)的出生缺陷，臨床表型的嚴重性不亞于染色體顯微層面上數(shù)目或者結(jié)構(gòu)異常，而CMA的革命性發(fā)展，為檢測這種亞顯微染色體異常提供了一種新方法[11]。本研究采用SNP array技術(shù)對170例CCH胎兒進行檢測，除1例為特納綜合征伴有致病性CNV外，還在12例CCH胎兒中檢出了12種不同的CNV。其中有4例樣本的染色體核型分析也檢出了異常核型，2例胎兒的染色體核型分析檢測到易位，但對其大小和致病性無法評估，而SNP array檢測到相應2個片段的缺失和重復，均被評估為致病性CNV；1例檢出46,XN,der(20)t(3,20)(q22,p13)的胎兒，但其SNP array只檢測到3q22.1q29區(qū)域約65.2 Mb的重復，包含3q29微重復綜合征所在區(qū)域；1例胎兒的染色體結(jié)果提示長臂的等臂染色體的嵌合(46,XN,i(18)(q10)[22]/46,XN[28])，而SNP array發(fā)現(xiàn)兩處異常，18p11.32p11.21片段的微缺失包含單倍劑量敏感的TGIF1基因，與前腦無裂畸形相關，18p11.21q23片段的嵌合重復在數(shù)據(jù)庫中可查詢到大量類似片段重復的病例報道，但由于嵌合比例較低，在進行遺傳咨詢時，應謹慎評估其臨床表型。因此，對于胎兒染色體異常情況，SNP array不僅可以準確地定位，還可以準確地判讀其大小，進一步明確該異常是否包含劑量敏感性基因，是否會打斷編碼基因，從而精準地評估胎兒的臨床表現(xiàn)和預后，為遺傳咨詢和臨床干預提供了可靠的信息。

同時，另外8例存在CNV的CCH胎兒中，染色體核型分析未檢出異常。因此，SNP array增加了4.7%的檢出率。在這8例胎兒中，6例胎兒檢出的為致病性CNV，2例胎兒檢測到的微缺失或微重復被評估為臨床意義不明CNV，但因為其包含的基因可能與疾病相關，對于遺傳咨詢和進一步追蹤隨訪提供了理論依據(jù)。

本研究中，單獨使用染色體核型分析在CCH胎兒中的檢出率為37.0%；單獨使用SNP array的檢出率為41.8%，兩種方法的檢出率差異無統(tǒng)計學意義。SNP array與染色體核型分析聯(lián)合檢測雖然未顯著增加染色體異常的檢出率，但兩者的聯(lián)合使用可進一步了解染色體的異常。如染色體核型分析可檢出易位、倒位和等臂染色體等染色體結(jié)構(gòu)異常，可幫助詳細了解CCH胎兒的染色體異常，為遺傳咨詢提供可靠的依據(jù)；而SNP array可檢出小片段(<5 Mb)的微缺失與微重復，增加一定的檢出率[12]。同時，對于染色體核型分析發(fā)現(xiàn)的結(jié)構(gòu)異常，采用SNP array可以進一步明確染色體異常區(qū)帶拷貝數(shù)的變化及可能包含的致病基因等。此外，對于細胞培養(yǎng)失敗的胎兒樣本，無法進行染色體核型分析，但SNP array不需要進行細胞培養(yǎng)，因此，可以為生長較差的細胞以及存在嵌合體的細胞提供真實的檢測結(jié)果[13]。因此，染色體核型分析與SNP array的聯(lián)合使用，可以相互彌補各自的不足。

綜上所述，經(jīng)B超檢測到CCH的胎兒，染色體異常發(fā)生率較高，以非整倍體為主，但也存在染色體核型分析才能檢出的易位等染色體結(jié)構(gòu)異常，以及需要SNP array等染色體微陣列分析才能檢測到的致病性CNV。因此，針對B超診斷為CCH的胎兒，同時進行染色體核型分析和SNP array檢測，可以使檢測到的染色體異常結(jié)果得到驗證，同時，又能夠互為補充，從而為CCH胎兒的遺傳咨詢、預后評估以及臨床干預提供全面和準確的信息。