萬磊，劉健，黃傳兵，趙磊，孫廣瀚，朱子衡，李舒，馬熙檬，程靜，胡賽賽，李方澤，陳瑩瑩

1 安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 安徽合肥 230031

2 美國希望之城國家醫(yī)學(xué)中心和貝克曼研究所癌癥生物學(xué)系 美國加州 91010

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的主要臨床特征包括關(guān)節(jié)腫脹﹑發(fā)熱﹑疼痛﹑功能障礙和變形，這些都會(huì)導(dǎo)致關(guān)節(jié)殘疾和生活質(zhì)量下降[1-2]。盡管我們對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)有了很大的提高，但對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)仍受疾病異質(zhì)性的限制，靶向治療仍不理想。表觀遺傳學(xué)的作用，特別是 RNA 修飾在關(guān)節(jié)炎中的作用引起極大的關(guān)注[3]。已經(jīng)證明DNA和組蛋白的表觀遺傳修飾參與了類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制，但探討是否涉及RNA中N6-甲基腺苷（m6A）的修飾研究較少[4]。參與m6A調(diào)節(jié)的酶主要包括m6A甲基轉(zhuǎn)移酶（methyltransferase）﹑去甲基化酶（demethylase）﹑m6A結(jié)合蛋白（m6A-binding proteins）。它們對(duì)細(xì)胞生命的調(diào)控至關(guān)重要。對(duì)M6A甲基化機(jī)制的廣泛研究表明[5]，與m6A相關(guān)的RNA水平的調(diào)控是復(fù)雜多樣的。研究表明[6-7]，m6A修飾對(duì)于包括免疫應(yīng)答在內(nèi)的多種生物過程是必需的。并且有越來越多的證據(jù)表明，其失調(diào)與許多人類疾病有關(guān)。進(jìn)一步研究m6A甲基化在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中的作用機(jī)制，將對(duì)免疫性疾病的治療產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。

m6A甲基化修飾基因

1 甲基轉(zhuǎn)移酶

m6A甲基化修飾在天然免疫應(yīng)答和抗腫瘤免疫中起著不可或缺的作用。m6A甲基轉(zhuǎn)移酶促進(jìn)m6A對(duì)RNA的甲基化修飾。最早發(fā)現(xiàn)的m6A甲基轉(zhuǎn)移酶是METTL3﹑METTL14和Wilms腫瘤1相關(guān)蛋白（WTAP）[8]。這些蛋白并不是各自孤立的，而是會(huì)形成復(fù)合物共同行使催化功能。METTL3是一種腫瘤抑制因子，因?yàn)樗鼘?duì)m6A修飾具有上調(diào)作用。METTL3在一些腫瘤疾病中表達(dá)增加，并介導(dǎo)增殖﹑轉(zhuǎn)移和癌細(xì)胞的集落形成[9]。METTL3在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中的作用機(jī)制尚不清楚。在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者中METTL3的表達(dá)顯著升高，METTL3通過NF-kB途徑影響類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎炎癥因子的分泌[10]。因此，METTL3可能具有治療免疫疾病的潛力。研究表明[11]，METTL14的缺失依賴于mTOR信號(hào)誘導(dǎo)的自噬。METTL3和METTL14這兩種蛋白有關(guān)鍵的催化結(jié)構(gòu)域，兩者之間會(huì)形成雜絡(luò)物。其中METTL3是具有催化活性的亞基，而METTL14會(huì)在底物識(shí)別上起到關(guān)鍵作用。WTAP是一種在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的m6A甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物。WTAP在招募METTL3和METTL14起到十分重要的作用。WTAP表達(dá)降低時(shí)METTL3的RNA結(jié)合能力顯著減弱。這表明WTAP調(diào)節(jié)m6A甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物向mRNA靶的募集并影響其結(jié)合能力[12]。WTAP的功能沒有甲基化活性，但它與METTL3和METTL14復(fù)合物相互作用，顯著影響功能細(xì)胞m6A的沉積[13]。

2 去甲基化酶

m6A去甲基化酶是從RNA中去除m6A甲基化基團(tuán)。最常見的去甲基化酶是肥胖相關(guān)蛋白（FTO）和烷基化修復(fù)同源蛋白5（ALKBH5）。

FTO被認(rèn)為是一種調(diào)節(jié)肥胖的蛋白。 屬于Alkb蛋白家族中的一員并且與肥胖相關(guān)。FTO的過度激活會(huì)增加食物攝入，從而導(dǎo)致肥胖。無論是在DNA還是RNA中，F(xiàn)TO蛋白都是一種十分重要的去甲基化酶。FTO去除m6A修飾并調(diào)節(jié)mRNA的穩(wěn)定性，這最終導(dǎo)致各種類型的疾病發(fā)生。FTO對(duì)疾病免疫逃逸至關(guān)重要。FTO蛋白在核心結(jié)構(gòu)域上與Alkb蛋白家族相似，但是C端獨(dú)有的長(zhǎng)loop與Alkb家族其他蛋白有所不同。正是這種特有的結(jié)構(gòu)域使得FTO蛋白能夠?qū)Πl(fā)生甲基化的單鏈DNA或單鏈RNA進(jìn)行去甲基化修飾。一旦FTO基因轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生異常，會(huì)引起多種風(fēng)濕免疫性疾病如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等[14]。ALKBH5是另一種重要的去甲基化酶，能夠?qū)?xì)胞核中的mRNA進(jìn)行去甲基化修飾，在N端有丙氨酸富集區(qū)和獨(dú)有的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)。在細(xì)胞系中敲低ALKBH5后，mRNA上m6A修飾水平顯著上升。ALKBH5缺失通過YTHDF2依賴的方式降低單核-巨噬細(xì)胞上炎癥因子的表達(dá)[15]。m6A去甲基化酶FTO和ALKBH5通過調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移﹑侵襲和轉(zhuǎn)移來抑制細(xì)胞增殖。如果通過FTO和ALKBH5減少滑膜細(xì)胞的增殖和遷移，則可以延遲類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎炎癥反應(yīng)的發(fā)生。因此，m6A去甲基化酶FTO和ALKBN5有可能成為在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎治療的靶點(diǎn)。

3 閱讀蛋白

m6A修飾的mRNA行使特定的生物學(xué)功能需要一種特定的RNA結(jié)合蛋白，RNA結(jié)合蛋白通過與RNA中的m6A甲基化位點(diǎn)結(jié)合而發(fā)揮特定作用，其編碼基因被稱為閱讀蛋白。閱讀蛋白包括YTH結(jié)構(gòu)域的蛋白﹑核不均一核糖蛋白以及真核起始因子（eIF）等。具有YTH結(jié)構(gòu)域的蛋白包括YTHDC1-2和YTHDF1-3等[16]。這些閱讀蛋白的功能主要包括特異性結(jié)合m6A甲基化區(qū)域，削弱與RNA結(jié)合蛋白同源結(jié)合以及改變RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)從而改變蛋白與RNA的互作。YTHDF1-3主要在胞漿中特異性識(shí)別m6A修飾的mRNA[17]。YTHDF1通過與起始因子相互作用增強(qiáng)mRNA翻譯和蛋白質(zhì)合成。YTHDF2通過選擇性結(jié)合并募集m6A-修飾的mRNA至mRNA衰變位點(diǎn)。YTHDF3已被認(rèn)為是第一個(gè)閱讀蛋白。YTHDF3通過與其他因子相互作用增強(qiáng)RNA翻譯[18]。YTHDC1-2的作用部位主要在細(xì)胞核內(nèi)。eIF3蛋白能夠與RNA 5’端UTR上發(fā)生m6A修飾的堿基相結(jié)合，從而促進(jìn)mRNA的翻譯[19]。

m6A甲基化修飾對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的影響

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎 特征在于免疫細(xì)胞浸潤(rùn)﹑成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞過度增殖以及軟骨和骨骼破壞。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎關(guān)鍵的病理變化是巨噬細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子，包括 IL-1﹑IL-6 和 TNF[20]。大量研究表明調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞是治療 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎 的關(guān)鍵靶點(diǎn)之一。m6A甲基化通過控制基因表達(dá)在各種生物過程中發(fā)揮重要作用。m6A甲基化修飾參與對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎疾病的過程。m6A甲基轉(zhuǎn)移酶MetTL3通過調(diào)節(jié)細(xì)胞因子變化減輕類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎炎癥反應(yīng)[21]。

研究發(fā)現(xiàn)[22]，在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者中，外周血中MetTL3的表達(dá)顯著增加，但其他RNA m6A甲基轉(zhuǎn)移酶沒有明顯的變化。通過LPS刺激可以上調(diào)巨噬細(xì)胞中的MetTL3來增加總m6A含量，并且MetTL3相關(guān)的m6A修飾與細(xì)胞因子IL-6和TNF-a相關(guān)。研究表明，在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者m6A調(diào)節(jié)的甲基轉(zhuǎn)移酶﹑去甲基酶和閱讀蛋白表達(dá)發(fā)生變化[23]。也有研究發(fā)現(xiàn)[24]， m6A甲基轉(zhuǎn)移酶MetTL3通過激活NF-kB信號(hào)通路促進(jìn)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎 FLs的炎癥反應(yīng)。

DNA異常甲基化可能參與了類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展，異常甲基化的基因可能成為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎評(píng)估發(fā)病﹑疾病進(jìn)展和疾病嚴(yán)重程度的生物標(biāo)記物或預(yù)測(cè)因子，也有望成為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎治療的潛在靶點(diǎn)[25]。 研究發(fā)現(xiàn)[26]，METTL3 表達(dá)在人類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜組織和大鼠 AIA 模型中顯著上調(diào)。METTL3敲低抑制了人 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎-FLS 和大鼠 AIA-FLS中的白介素 （IL）-6﹑基質(zhì)金屬蛋白酶 （MMP）-3 和MMP-9 水平。相反，它們因 METTL3 過表達(dá)而增加。此外，在 FLS 中，METTL3 可能激活核因子 （NF）-κB信號(hào)通路。研究表明，METTL3可能通過NF-κB信號(hào)通路促進(jìn)FLS激活和炎癥反應(yīng)。

通過c-Myc基因啟動(dòng)子甲基化在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病中的作用研究發(fā)現(xiàn)[27]，c-Myc基因低甲基化可能與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)病相關(guān)，且c-Myc（chr8:127736502）甲基化率與IL-17水平呈負(fù)相關(guān)。

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者中ALKBH5﹑FTO和YTHDF2表達(dá)顯著變化[28]。YTHDF2 降低顯著增加了 LPS 誘導(dǎo) 的 IL-6 ﹑TNF-α﹑IL-1 β 和 IL-12水 平 表 達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)[29]，與對(duì)照組相比，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎 患者中ALKBH5﹑FTO 和 YTHDF2 的 mRNA 表達(dá)顯著降低。在接受常規(guī)治療的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者中，ALKBH5的mRNA表達(dá)顯著增加。 FTO 的 mRNA 表達(dá)與疾病活動(dòng)性評(píng)分 28 （DAS28）﹑補(bǔ)體 3 （C3）﹑免疫球蛋白G （IgG） 和淋巴細(xì)胞與單核細(xì)胞比率 （LMR） 相關(guān)。YTHDF2 的 mRNA 表達(dá)與 RBC﹑L%﹑N%﹑NLR 和LMR 相關(guān)。邏輯回歸分析顯示，外周血中 ALKBH5﹑FTO 和 YTHDF2 的表達(dá)降低是 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎 的危險(xiǎn)因素。此外，與對(duì)照組相比，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎 患者外周血整體 m6A 含量顯著增加，并且 m6A 含量增加與 FTO mRNA 表達(dá)降低呈負(fù)相關(guān)。研究說明了 ALKBH5﹑FTO 和 YTHDF2 在 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎 中的關(guān)鍵作用，這為認(rèn)識(shí)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎 的發(fā)病機(jī)制提供了新的見解，同時(shí)也是一種新型的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎 生物標(biāo)志物。

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎DNA甲基化干預(yù)研究

劉喜德等[30]運(yùn)用real time PCR﹑反義寡核苷酸技術(shù)﹑細(xì)胞培養(yǎng)﹑轉(zhuǎn)染等方法進(jìn)行體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)，基于miRNA-146a對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者DNA甲基化調(diào)控作用研究中藥溫化蠲痹方治療活動(dòng)期類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎增效的分子機(jī)制。了解ras-MAPKs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是否介導(dǎo)了miRNA-146a對(duì)DNA甲基化調(diào)控作用，研究溫化蠲痹方對(duì)miRNA-146a調(diào)控DNA甲基化作用的影響，闡釋其治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎增效的分子機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)中藥溫化蠲痹方具有下調(diào)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者外周血PBMC 微小RNA-146a表達(dá)，上調(diào)DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶表達(dá)，可能通過ras-MAPKs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路影響微小RNA-146a調(diào)控類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者DNA甲基化作用而達(dá)到治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎目的。

劉煥興等[31]通過觀察甲氨蝶呤片（MTX）治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎對(duì)Th17細(xì)胞DNA甲基化的影響及其機(jī)制。結(jié)果顯示，治療后ESR﹑CRP及PLT水平顯著降低（P＜0.05），Th17細(xì)胞比例及IL-17水平顯著降低（P＜0.001），DNMT1基因mRNA表達(dá)水平顯著升高（P＜0.001），ROR-γt基因mRNA表達(dá)水平顯著降低（P＜0.001），ROR-γt基因甲基化比例顯著增加（P＜0.05）;Th17細(xì)胞比例與IL-17水平呈正相關(guān)，ROR-γt基因甲基化程度與IL-17水平呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。說明甲氨蝶呤可通過提高類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者Th17細(xì)胞ROR-γt基因甲基化程度抑制體內(nèi)IL-17分泌改善和延緩疾病進(jìn)程，同時(shí)此過程有DNMT1酶參與。

劉亞飛等[32]利用風(fēng)寒濕刺激類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型，觀察風(fēng)寒濕因素刺激對(duì)關(guān)節(jié)炎的DNA甲基化水平影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常組相比，風(fēng)寒濕病證結(jié)合模型組關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分≥5分的比例顯著升高。大鼠踝關(guān)節(jié)直徑顯著增加。與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型組相比，風(fēng)寒濕病證結(jié)合模型組單個(gè)核細(xì)胞 DNA甲基化水平顯著下降。單個(gè)核細(xì)胞組蛋白H3乙?；接兴?，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論風(fēng)寒濕因素可能通過下調(diào)單個(gè)核細(xì)胞DNA甲基化水平，從而影響類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重程度。

John等[33]人通過對(duì) 早期類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎DNA 甲基化水平的測(cè)定，觀察緩解疾病的抗風(fēng)濕藥（DMARD） 是否與調(diào)節(jié)DNA 甲基化水平有關(guān)。結(jié)果顯示 DNA 甲基化與早期 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎 中改善疾病的抗風(fēng)濕藥物治療反應(yīng)有關(guān)。

綜上所述，m6A甲基化修飾蛋白是否參與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎疾病的發(fā)生和發(fā)展全過程需進(jìn)一步研究。m6A 甲基轉(zhuǎn)移酶可以甲基化非編碼 RNA。然而，關(guān)于非編碼 RNA 與 m6A 在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎疾病中相互作用的研究很少。此外，m6A在T細(xì)胞穩(wěn)態(tài)或其他免疫細(xì)胞分化中的作用研究偏少。同時(shí)，關(guān)于藥物對(duì)m6A甲基化修飾蛋白的干預(yù)研究尤為不足。因此，需要進(jìn)一步的研究來確定 m6A 在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中的潛在作用靶點(diǎn)和分子機(jī)制。