陳森敏 劉四喜 陳芬 王春艷 麥惠容 袁秀麗 文飛球

（深圳市兒童醫(yī)院血液腫瘤科，廣東深圳 518038）

人體微生物群落主要分布于黏膜器官，包括腸道、口腔和陰道。腸道菌群在人體許多生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用，包括協(xié)助宿主免疫功能的成熟及發(fā)育、抵抗病原微生物的過(guò)度生長(zhǎng)、影響宿主細(xì)胞的增殖和新生血管形成等。因此，腸道菌群被認(rèn)為是早期生命發(fā)育和終生健康的關(guān)鍵因素。腸道菌群在多種疾病中可能起推動(dòng)或阻礙的作用［1］。研究發(fā)現(xiàn)，影響免疫細(xì)胞的疾病，如急性淋巴細(xì)胞白血?。╝cute lymphoblastic leukemia，ALL）、炎癥性腸病和幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎與腸道微生物組成的變化（生態(tài)失調(diào)）有關(guān)［2-4］。但腸道菌群在ALL發(fā)病時(shí)及化療前后的變化研究尚不充分，且存在不一致的研究結(jié)果［5-7］。因此，本研究采集ALL患兒糞便標(biāo)本檢測(cè)腸道菌群的微生物組成，探討化療對(duì)ALL患兒腸道菌群的影響，以期能在ALL及其化療相關(guān)并發(fā)癥的診治中發(fā)現(xiàn)新的靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象與分組

前瞻性選取2018 年1～9 月在深圳市兒童醫(yī)院確診的ALL 患兒40 例納入ALL 組；另選取ALL 患兒的健康同胞10 例納入健康對(duì)照組。兩組研究對(duì)象的體重指數(shù)均在正常范圍內(nèi)，年齡1～10 歲，在取樣前2個(gè)月內(nèi)均未使用益生菌，且在取樣前1個(gè)月內(nèi)均無(wú)腹瀉。ALL 組患兒納入標(biāo)準(zhǔn)：初次診斷ALL；入組前未化療。排除標(biāo)準(zhǔn)：復(fù)發(fā)的ALL；合并有營(yíng)養(yǎng)不良或肥胖等其他疾病的患兒。健康對(duì)照組兒童均無(wú)胃腸道疾病，采集樣本前1個(gè)月內(nèi)無(wú)抗生素接觸史。

收集ALL組患兒化療前、化療后2周、化療后1 個(gè)月及化療后2 個(gè)月4 個(gè)時(shí)間點(diǎn)的糞便；同期采集ALL患兒的健康同胞糞便1次。

本研究已獲得深圳市兒童醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，并獲得所有參與實(shí)驗(yàn)研究的兒童監(jiān)護(hù)人的知情同意。

1.2 ALL的診斷、化療方案及危險(xiǎn)度分級(jí)

ALL的診斷基于形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)及分子生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)［8］。根據(jù)廣東地區(qū)ALL-GD-2008方案（以BFM2002為基礎(chǔ)）［9］按序化療。以初診時(shí)年齡、白細(xì)胞總數(shù)、免疫分型、口服潑尼松第8天外周血幼稚細(xì)胞數(shù)及治療第15天、第33天骨髓象作為早期化療敏感性評(píng)估指標(biāo)，分為標(biāo)危、中危、高危3組。標(biāo)危及中危組化療階段分為VDLD誘導(dǎo)緩解、CAM 鞏固治療、MTX 鞏固治療、VALD 再誘導(dǎo)緩解及CAM鞏固治療。高危組將MTX鞏固治療換為Block1、Block2及Block3強(qiáng)化治療。化療第15 天開始所有患者均予復(fù)方磺胺甲噁唑口服預(yù)防卡氏肺孢子蟲病。各階段化療藥物及時(shí)間見表1。

表1 化療方案、藥物及時(shí)間

表1 （續(xù)）

1.3 糞便DNA提取

采集ALL 患兒及健康對(duì)照組兒童的新鮮糞便至少2 g，放入滅菌的一次性大便常規(guī)管內(nèi)，置于冰盒中轉(zhuǎn)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室分裝后轉(zhuǎn)移入-80℃冰箱保存。用糞便DNA 提取試劑盒（Omega Bio-Tek，美國(guó)）從糞便樣本中分離提取DNA。

1.4 16S rDNA基因的擴(kuò)增及測(cè)序

采用熒光定量PCR 擴(kuò)增16S rDNA 基因的V3～V4 區(qū)，選擇特異性引物（前端引物為：338F-5'-CTACGGGAGGCAGCAG-3'；后端引物為：806R-5'-GACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）。 反 應(yīng) 體 系（25 μL）： Pusion Hot Start Flex 2×Master Mix（NEB，美國(guó)）12.5 μL、Forward Primer（1 μmol/L）2.5 μL、 Reverse Primer （1 μmol/L） 2.5 μL、Template DNA 50 ng，加入ddH2O 至總體積為25 μL。反 應(yīng) 條 件：98℃30 s；98℃10 s，54℃30 s，72℃45 s，35 個(gè)循環(huán)；72℃10 min。隨后將PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)目標(biāo)片段進(jìn)行回收，回收后使用AMPure XP beads 回收試劑盒（Beckman，美國(guó)）進(jìn)行純化。使用MiSeq 測(cè)序儀（Illumina，美國(guó)） 進(jìn)行2×300 bp 的雙端測(cè)序，相應(yīng)試劑為MiSeq Reagent Kit V3（Illumina，美國(guó)），獲得各模板DNA 片段的測(cè)序序列，即讀數(shù)。

1.5 生物信息分析

去除原始數(shù)據(jù)中低質(zhì)量的Reads，通過(guò)97%相似度的標(biāo)準(zhǔn)聚類，得到操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）。然后使用Mothur 軟件，構(gòu)建稀釋性曲線。分別從每個(gè)聚類單元挑選1條代表性序列，以Greengene13.8的數(shù)據(jù)庫(kù)為模板注釋物種名稱組成OTUs。歸類后根據(jù)每個(gè)OTU 中序列的條數(shù)計(jì)算OTU豐度表，根據(jù)該物種豐度表進(jìn)行α多樣性分析、β多樣性分析及物種分類與豐度分析。根據(jù)分類學(xué)組成對(duì)樣本按照不同的分組條件用LEfSe軟件進(jìn)行線型判別分析，找出有顯著性差異的類群。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。符合正態(tài)分布計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用兩樣本t檢驗(yàn)；ALL患兒化療前后比較采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)。不符合正態(tài)分布計(jì)量資料采用中位數(shù)（四分位數(shù)間距）［M（P25，P75）］表示，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本W(wǎng)ilcoxon秩和檢驗(yàn)，ALL患兒化療前后比較采用Wilcoxon符號(hào)秩和檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料

40 例ALL 患兒，男25 例，女15 例，男∶女1.7∶1；T系4例（10%），B系36例（90%）；標(biāo)危8 例（20%），中危21 例（52%），高 危11 例（28%）；初診時(shí)平均年齡（5.2±2.4）歲。對(duì)照組中，男6例，女4例，平均年齡（5.8±2.1）歲。兩組之間男女比例及年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 糞便樣本菌群測(cè)序結(jié)果分析

本研究總共收集了122個(gè)糞便樣本，總共獲得3907880個(gè)讀數(shù)，平均每個(gè)樣品為32032個(gè)讀數(shù)，最小值和最大值分別為13531和57106，中位讀數(shù)為33092?；熀? 周組30 個(gè)樣品共1048652 個(gè)讀數(shù)，化療后1 個(gè)月組35 個(gè)樣品共1046014 個(gè)讀數(shù)，化療后2 個(gè)月組15 個(gè)樣品共405956 個(gè)讀數(shù)，化療前組32 個(gè)樣品共1134937 個(gè)讀數(shù)，健康對(duì)照組10個(gè)樣品中共272321個(gè)讀數(shù)。

2.3 ALL 患兒不同時(shí)期腸道菌群的豐度及多樣性分析

基于高通量測(cè)序數(shù)據(jù)，對(duì)每組樣本的菌群豐度和多樣性進(jìn)行進(jìn)一步檢測(cè)。其中，豐度由OTU數(shù)目和Chao1值體現(xiàn)，多樣性由PD值、Shannon指數(shù)和Simpson 指數(shù)體現(xiàn)，覆蓋率指數(shù)由Good's coverage值體現(xiàn)。

各樣本Good's coverage 值均在0.98 以上，覆蓋率較好，測(cè)序結(jié)果可代表各樣本腸道菌群實(shí)際組成。與健康對(duì)照組相比，ALL 組化療前腸道菌群OTUs、Chao1及PD值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但Shannon 指數(shù)及Simpson 指數(shù)明顯降低（P＜0.05）；ALL 組化療后1 個(gè)月及2 個(gè)月的腸道菌群OTUs、Chao1及PD值顯著下降（P＜0.05），在化療后2 周、1 個(gè)月、2 個(gè)月Shannon 指數(shù)及Simpson指數(shù)仍明顯低于健康對(duì)照組（P＜0.05）。見表2～5。

表2 化療前ALL患兒腸道菌群豐度和多樣性與健康對(duì)照組比較 （±s）

表2 化療前ALL患兒腸道菌群豐度和多樣性與健康對(duì)照組比較 （±s）

組別健康對(duì)照組化療前ALL組t值P值n 1032 OTUs 754±418723±5040.1770.860 Good's coverage 0.986±0.0040.990±0.005-1.9850.054 Chao11183±5671122±7020.2460.806 PD 46±1744±220.1880.852 Shannon 5.0±1.04.0±1.82.2660.032 Simpson 0.90±0.070.75±0.243.1300.003

表3 化療后2周ALL患兒腸道菌群豐度和多樣性與健康對(duì)照組比較 （±s）

表3 化療后2周ALL患兒腸道菌群豐度和多樣性與健康對(duì)照組比較 （±s）

組別健康對(duì)照組化療后2周ALL組t值P值n 1030 OTUs 754±418586±3431.2740.210 Good's coverage 0.986±0.0040.991±0.004-3.2960.002 Chao11183±567918±5311.3420.187 PD 46±1737±171.3990.169 Shannon 5.0±1.03.8±1.52.3350.025 Simpson 0.90±0.070.77±0.212.8360.007

表4 化療后1個(gè)月ALL患兒腸道菌群豐度和多樣性與健康對(duì)照組比較 （±s）

表4 化療后1個(gè)月ALL患兒腸道菌群豐度和多樣性與健康對(duì)照組比較 （±s）

組別健康對(duì)照組化療后1個(gè)月ALL組t值P值n 1035 OTUs 754±418407±1983.7220.001 Good's coverage 0.986±0.0040.993±0.003-6.080＜0.001 Chao11183±567625±2974.201＜0.001 PD 46±1730±103.691＜0.001 Shannon 5.0±1.03.5±1.23.5420.001 Simpson 0.90±0.070.77±0.182.1670.036

表5 化療后2個(gè)月ALL患兒腸道菌群豐度和多樣性與健康對(duì)照組比較 （±s）

表5 化療后2個(gè)月ALL患兒腸道菌群豐度和多樣性與健康對(duì)照組比較 （±s）

組別健康對(duì)照組化療后2個(gè)月ALL組t值P值n 1015 OTUs 754±418401±3192.3940.025 Good's coverage 0.986±0.0040.993±0.005-3.7820.001 Chao11183±567627±4822.6300.015 PD 46±1729±152.6090.016 Shannon 5.0±1.03.4±1.43.0900.005 Simpson 0.90±0.070.75±0.182.8240.010

和化療前相比，ALL 組化療后1 個(gè)月及2 個(gè)月的腸道菌群Chao1 及PD 值顯著下降（P＜0.05），盡管化療后2 個(gè)月OTUs 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.066），但仍有下降趨勢(shì)；總體趨勢(shì)來(lái)看，ALL患兒腸道菌群物種豐度在化療后2個(gè)月最低，其次是化療后1個(gè)月和2周。見表6～8。

表6 ALL患兒化療前與化療后2周腸道菌群豐度和多樣性比較 （±s）

表6 ALL患兒化療前與化療后2周腸道菌群豐度和多樣性比較 （±s）

組別化療前化療后2周t值P值n 2525 OTUs 677±508622±3430.5370.597 Good's coverage 0.989±0.0060.991±0.005-1.4520.159 Chao11166±749959±5081.3570.187 PD 45±2339±161.1990.242 Shannon 4.0±1.83.9±1.40.2670.792 Simpson 0.76±0.220.78±0.21-0.3790.708

表7 ALL患兒化療前與化療后1個(gè)月腸道菌群豐度和多樣性比較 （±s）

表7 ALL患兒化療前與化療后1個(gè)月腸道菌群豐度和多樣性比較 （±s）

組別化療前化療后1個(gè)月t值P值n 2929 OTUs 668±485386±1863.1500.004 Good's coverage 0.990±0.0060.993±0.003-3.1290.004 Chao11122±715632±3053.942＜0.001 PD 44±2230±103.6800.001 Shannon 4.0±1.83.5±1.31.3550.186 Simpson 0.74±0.250.76±0.20-0.3480.731

表8 ALL患兒化療前與化療后2個(gè)月腸道菌群豐度和多樣性比較 （±s）

表8 ALL患兒化療前與化療后2個(gè)月腸道菌群豐度和多樣性比較 （±s）

組別化療前化療后2個(gè)月t值P值n 1212 OTUs 609±467374±246-2.0340.066 Good's coverage 0.991±0.0050.993±0.004-1.5330.154 Chao1976±689578±3492.2060.050 PD 40±2228±132.2800.044 Shannon 3.4±1.73.4±1.3-0.0950.926 Simpson 0.66±0.260.75±0.19-1.1410.278

基于weighted unifrac距離算法對(duì)所有樣品進(jìn)行主坐標(biāo)分析（principal co-ordinates analysis，PCoA分析）。盡管化療前及化療后2周、1個(gè)月、2個(gè)月ALL 組與健康對(duì)照組的樣本差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（R=0.035，P=0.041），但各組的腸道菌群結(jié)構(gòu)總體分離不明顯。如圖1所示。

2.4 ALL患兒腸道菌群組成分析及比較

在門水平上，處于前5位的腸道菌群分別為厚壁菌門、放線菌門、變形菌門、擬桿菌門、疣微菌門（圖2）。分析ALL 組與健康對(duì)照組及ALL 患兒化療前后腸道菌群相對(duì)豐度的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與健康對(duì)照組相比，ALL患兒化療前變形菌門的相對(duì)豐度有升高趨勢(shì)，并在化療后1個(gè)月及2個(gè)月顯著升高（P＜0.05）；ALL 患兒化療前放線菌門的相對(duì)豐度有降低趨勢(shì)，并在化療后2 周、1 個(gè)月及2 個(gè)月顯著降低（P＜0.05）；ALL 患兒僅在化療后1 個(gè)月擬桿菌門的相對(duì)豐度明顯降低（P=0.009）（表9～12）。與化療前相比，ALL 患兒化療后放線菌門的相對(duì)豐度有降低趨勢(shì)，變形菌門的相對(duì)豐度有升高趨勢(shì)，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；疣微菌門的相對(duì)豐度在化療后1 個(gè)月顯著降低（P=0.001）（表13～15）。

表9 化療前ALL患兒腸道菌群前5門相對(duì)豐度與健康對(duì)照組比較 ［M（P25，P75）］

表10 化療后2周ALL患兒腸道菌群前5門相對(duì)豐度與健康對(duì)照組比較 ［M（P25，P75）］

表11 化療后1個(gè)月ALL患兒腸道菌群前5門相對(duì)豐度與健康對(duì)照組比較 ［M（P25，P75）］

表12 化療后2個(gè)月ALL患兒腸道菌群前5門相對(duì)豐度與健康對(duì)照組比較 ［M（P25，P75）］

表13 ALL患兒化療前與化療后2周腸道菌群前5門相對(duì)豐度比較 ［M（P25，P75）］

表14 ALL患兒化療前與化療后1個(gè)月腸道菌群前5門相對(duì)豐度比較 ［M（P25，P75）］

表15 ALL患兒化療前與化療后2個(gè)月腸道菌群前5門相對(duì)豐度比較 ［M（P25，P75）］

在屬水平上，處于前7位的腸道菌群分別為雙歧桿菌屬、腸球菌屬、鏈球菌屬、埃希氏菌-志賀氏菌屬、活潑瘤胃球菌屬、克雷伯菌屬和Faecalibacterium（圖3）。分析ALL組與健康對(duì)照組及ALL 患兒化療前后腸道菌群相對(duì)豐度的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與健康對(duì)照組和ALL患兒化療前相比，ALL患兒化療后2 周、1 個(gè)月和2 個(gè)月腸球菌屬、鏈球菌屬和克雷伯菌屬的相對(duì)豐度有增加趨勢(shì)，雙歧桿菌屬、Faecalibacterium相對(duì)豐度有降低趨勢(shì)。雙歧桿菌屬相對(duì)豐度在ALL 患兒化療后2 周、1 個(gè)月及2 個(gè)月均較健康對(duì)照組顯著降低（P＜0.05）?？死撞鷮傧鄬?duì)豐度在ALL患兒化療后1個(gè)月及2個(gè)月均較健康對(duì)照組顯著升高，并且在化療后1個(gè)月時(shí)較化療前顯著升高（P＜0.05）；盡管在化療后2個(gè)月與化療前比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.069），但仍有升高趨勢(shì)。 與健康對(duì)照組比較，F(xiàn)aecalibacterium相對(duì)豐度在ALL患兒化療前后均顯著降低，并且在化療后2周及1個(gè)月時(shí)相對(duì)豐度顯著低于化療前（P＜0.05）。腸球菌屬相對(duì)豐度在ALL 患兒化療后1 個(gè)月及2 個(gè)月較健康對(duì)照組及化療前均明顯升高（P＜0.05）。鏈球菌屬僅在化療后2周時(shí)較化療前明顯升高（P=0.021）。見表16～22。

表16 化療前ALL患兒腸道菌群前7屬相對(duì)豐度與健康對(duì)照組比較 ［M（P25，P75）］

表17 化療后2周ALL患兒腸道菌群前7屬相對(duì)豐度與健康對(duì)照組比較 ［M（P25，P75）］

表18 化療后1個(gè)月ALL患兒腸道菌群前7屬相對(duì)豐度與健康對(duì)照組比較 ［M（P25，P75）］

表19 化療后2個(gè)月ALL患兒腸道菌群前7屬相對(duì)豐度與健康對(duì)照組比較 ［M（P25，P75）］

表20 ALL患兒化療前與化療后2周腸道菌群前7屬相對(duì)豐度比較 ［M（P25，P75）］

表21 ALL患兒化療前與化療后1個(gè)月腸道菌群前7屬相對(duì)豐度比較 ［M（P25，P75）］

表22 ALL患兒化療前與化療后2個(gè)月腸道菌群前7屬相對(duì)豐度比較 ［M（P25，P75）］

2.5 ALL 患兒化療前后不同時(shí)間點(diǎn)糞便中特異性差異腸道菌群

LEfSe 分析發(fā)現(xiàn)在ALL 患兒化療不同時(shí)間點(diǎn)的部分腸道菌群在相對(duì)豐度上存在一定差異（圖4）?；熐?、化療后2 周、1 個(gè)月和2 個(gè)月從門到種水平上的特異性腸道菌群分別有37、22、11 和20個(gè)?；熐跋鄬?duì)豐度較高的腸道菌群分布在放線菌門、放線菌綱、雙歧桿菌屬等?；熀?周時(shí)相對(duì)豐度較高的腸道菌群分布在有乳桿菌目、極小韋永氏球菌種、瘤胃球菌屬等?；熀?個(gè)月時(shí)相對(duì)豐度較高的腸道菌群分布在s_Streptococcus_sanguinis_SK36、g_Fusicatenibacter 等?；熀? 個(gè)月時(shí)相對(duì)豐度較高的腸道菌群分布在丹毒絲菌目、丹毒絲菌科、葡萄球菌屬等。

3 討論

近年來(lái)的研究表明，腫瘤的發(fā)生發(fā)展可能與菌群的多樣性和穩(wěn)定性失調(diào)有關(guān)。影響免疫細(xì)胞的疾病，如ALL、炎癥性腸病和幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎與腸道微生物組成的變化有關(guān)，其發(fā)生的原因是微生物多樣性的減少［2-4］。本研究發(fā)現(xiàn)，和健康對(duì)照組比較，ALL 患兒化療前、化療后1 個(gè)月及2 個(gè)月腸道菌群alpha 多樣性均低于健康對(duì)照組，與先前的研究結(jié)果一致［6-7］。已發(fā)表的幾項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，ALL患兒的糞便菌群中富含擬桿菌門、腸球菌科和卟啉單胞菌科等細(xì)菌，而缺乏厚壁菌門、毛螺菌科和梭菌門等細(xì)菌［2］。本研究對(duì)ALL 患兒化療前糞便樣本的腸道菌群分析結(jié)果與上述報(bào)道不完全一致，可能與人種、地域、飲食結(jié)構(gòu)等因素不同有關(guān)。

Zwielehner 等［10］發(fā)現(xiàn)化療后腸道菌群組成發(fā)生了改變。一項(xiàng)小鼠模型研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)腹腔注射環(huán)磷酰胺后腸道細(xì)菌多樣性減少，并誘導(dǎo)了腸桿菌科、假單胞菌科（變形菌門）和腸球菌科（厚壁菌門）等潛在致病菌群優(yōu)勢(shì)生長(zhǎng)［11］。有研究發(fā)現(xiàn)兒童ALL 患者在強(qiáng)化誘導(dǎo)和再誘導(dǎo)化療后腸道菌群多樣性顯著下降［12］。在本研究中，ALL 患兒糞便微生物在化療后物種豐富度降低，但化療前和化療后的alpha 多樣性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這與上述報(bào)道不一致，可能與樣本量小有關(guān)。但我們觀察到化療后不同時(shí)間點(diǎn)腸道菌群的微生物組成與化療前存在不同，與以往研究結(jié)果一致［2］。

通過(guò)分析ALL 患兒化療后與化療前的腸道菌群相對(duì)豐度差異，我們發(fā)現(xiàn)變形菌門的相對(duì)豐度有升高趨勢(shì)，放線菌門的相對(duì)豐度有降低趨勢(shì)。屬水平上，雙歧桿菌和Faecalibacterium相對(duì)豐度在ALL 患兒化療后顯著降低，克雷伯菌相對(duì)豐度升高。Faecalibacterium prausnitzii可發(fā)酵膳食纖維，是有益的短鏈脂肪酸丁酸鹽的主要來(lái)源，并具有改善結(jié)腸炎的抗炎特性，因此是一種保護(hù)性細(xì)菌，對(duì)腸道健康不可或缺［13］。Faecalibacterium的相對(duì)豐度在兒童ALL 患者成年后仍降低，并與炎癥標(biāo)志物IL-6 和C 反應(yīng)蛋白呈負(fù)相關(guān)［10］。雙歧桿菌對(duì)人體健康的有益作用主要是防治腸道疾病和免疫紊亂［14］。而克雷伯菌為公認(rèn)的人類病原體。因此，本研究結(jié)果提示，化療部分降低了患者腸道有益菌的豐度，引起了ALL 患兒腸道有益菌和有害菌的失衡。

對(duì)ALL 化療前后腸道菌群的結(jié)構(gòu)分析表明，來(lái)源于同一個(gè)病人的腸道菌群在化療前后各時(shí)間點(diǎn)的分布較分散（存在明顯的差異）。雖然化療前后各組樣本分布總體上分離不明顯，但腸道菌群結(jié)構(gòu)差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。屬水平上，ALL患兒化療前相對(duì)豐度較高的差異物種為雙歧桿菌，化療后2 周、1 個(gè)月和2 個(gè)月相對(duì)豐度較高的差異物種分別為瘤胃球菌、g_Fusicatenibacter 和葡萄球菌屬。

本研究中ALL 患兒化療后樣本采集時(shí)間均在化療后2個(gè)月以內(nèi)，對(duì)應(yīng)的化療階段是在VDLD誘導(dǎo)緩解與鞏固治療之間，均處于較強(qiáng)的化療期?；熀?周均在VDLD期間，化療后1個(gè)月均在第1個(gè)CAM 期間，多數(shù)患者的化療后2 個(gè)月在第2 個(gè)CAM方案后。本研究對(duì)象大部分在化療后2周進(jìn)入骨髓抑制期，故化療后1個(gè)月和2個(gè)月的時(shí)間點(diǎn)基本可以代表化療后骨髓抑制的狀態(tài)，在化療后2個(gè)月時(shí)都有抗生素治療史。故本研究中ALL 患兒化療后腸道菌群的變化除與化療有關(guān)外，還可能受到宿主免疫狀態(tài)及抗生素的影響。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ALL患兒腸道菌群多樣性明顯低于健康兒童，化療后腸道菌群豐度顯著降低，部分有益菌豐度下降、病原菌豐度增加。但腸道菌群作為一個(gè)動(dòng)態(tài)整體，受各種因素的影響，如年齡、壓力、飲食、健康狀態(tài)等［15］。對(duì)于ALL 患者的腸道菌群及其調(diào)節(jié)因素及對(duì)化療效果的影響，我們的認(rèn)識(shí)依然有限。本研究分析了10 例健康兒童樣本和40 例ALL 患兒在化療前后不同時(shí)間點(diǎn)的糞便樣本，未來(lái)尚需增加樣本并按疾病危險(xiǎn)度、免疫分型等因素繼續(xù)分層對(duì)腸道菌群進(jìn)行分析研究并構(gòu)建動(dòng)物模型驗(yàn)證。