張曉靜，陳延松，唐經(jīng)緯，陳晨，劉元，金功圣，劉先富

(蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腫瘤外科，安徽 蚌埠 233000)

盡管在過去的幾十年中，乳腺癌診斷和治療取得了長足進步，但其仍是全世界女性中最常見的癌癥之一，嚴(yán)重威脅著女性身心健康[1]。雖然早期發(fā)現(xiàn)和診斷的乳腺癌患者擁有較高的治愈率，但易復(fù)發(fā)和高轉(zhuǎn)移特性是其治療失敗的主要原因[2]。許多誘因能夠?qū)е碌娜橄侔┌l(fā)生，包括家族病史、遺傳因素和激素水平等[3]。不幸的是，與乳腺癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移相關(guān)的分子靶標(biāo)仍然知之甚少，特別是目前轉(zhuǎn)移性乳腺癌的診斷和治療方法仍然非常有限[4-5]。因此，迫切需要尋找和闡明與乳腺癌轉(zhuǎn)移有關(guān)的治療靶點和作用機制。賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(SETD8)是催化組蛋白H4第20位賴氨酸單甲基化(H4K20me1)修飾的唯一賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶。目前國內(nèi)外對于SETD8在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用研究較少，本研究將探究SETD8在乳腺癌轉(zhuǎn)移中的作用及其分子機制，為乳腺癌的臨床治療提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1主要試劑 乳腺癌組織芯片(貨號：BRD481)購于上海卓灝生物公司；Trizol溶液，Lipofectamine 3000購自美國Invitrogen公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco公司；qRT-PCRMix、HiScript Ⅱ Q RT SuperMix逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自南京諾唯贊公司；Western blot(WB)蛋白裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、染色質(zhì)免疫共沉淀(Chromatin co-immunoprecipitation，ChIP)試劑盒購自上海碧云天生物公司；SETD8 siRNA購于上海吉瑪公司；SETD8、Slug抗體購自美國Abcam公司；GAPDH抗體購自武漢三鷹生物技術(shù)公司；實驗中所有引物均由安徽通用生物公司合成。

1.2免疫組化實驗步驟及結(jié)果判讀 將組織芯片置于60 ℃烘箱中烤片60 min，分別放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中浸泡10 min，乙醇梯度脫水2 min，去離子水沖洗干凈，放入0.01 M的檸檬酸鈉溶液(pH 6.0)使用高壓鍋進行抗原修復(fù)，待自然冷卻后置于3% H2O2溶液中避光孵育15 min，PBS溶液洗滌3次，10分鐘/次。組織芯片上加入5% BSA稀釋的SETD8抗體置于4 ℃冰箱中過夜孵育，PBS溶液洗滌3次，10分鐘/次；二抗室溫45 min，PBS溶液洗滌3次，10分鐘/次。加入DAB溶液顯色10 min，PBS溶液洗滌后加入蘇木素復(fù)染，PBS洗去殘留的蘇木素溶液；最后使用梯度乙醇脫水并加入中性樹脂封片，用于后續(xù)拍照觀察。使用高倍顯微鏡進行標(biāo)本染色情況觀察，統(tǒng)計陽性細(xì)胞比例和陽性強度，根據(jù)陽性腫瘤細(xì)胞數(shù)目分為5組：無陽性細(xì)胞組(0分)、25%以下組(1分)、26%～50%組(2分)、51%～75%組(3分)、75%以上組(4分)；根據(jù)染色強度將樣本劃分為4組：不著色組(0分)、淡黃色組(1分)、棕黃色組(2分)、棕褐色組(3分)，計算二者乘積作為樣品染色結(jié)果。

1.3細(xì)胞培養(yǎng) 人乳腺癌MCF-7細(xì)胞購于北納生物，使用含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，并置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中。

1.4細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組 將生長狀態(tài)良好的MCF-7細(xì)胞接種于6孔板中過夜培養(yǎng)，待細(xì)胞達(dá)到60%融合時，使用Lipofectamine 3000將SETD8的小干擾RNA(SETD8 siRNA-1、SETD8 siRNA-2)和siRNA陰性對照(Control)轉(zhuǎn)染到MCF-7細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染方法根據(jù)Lipofectamine 3000說明書操作。

1.5Western blot檢測SETD8、Slug的蛋白表達(dá)量 收集轉(zhuǎn)染后的MCF-7細(xì)胞，使用RIPA裂解液冰上裂解10 min，低溫離心機13 000×g離心30 min，收集蛋白上清，隨后使用BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度，進行定量和蛋白變性處理。樣品準(zhǔn)備好后通過SDS-PAGE膠電泳分離蛋白，并轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上。室溫下用5%的脫脂牛奶封閉2 h，4 ℃轉(zhuǎn)盤上過夜孵育一抗，PBST洗滌3次，15分鐘/次，室溫條件下孵育對應(yīng)的二抗1 h，再次洗滌3次，使用ECL發(fā)光液顯影、曝光。

1.6qRT-PCR檢測SETD8、Slug、Zeb1、Zeb2、Twist1、Snail的mRNA表達(dá)量 收集轉(zhuǎn)染后的MCF-7細(xì)胞，Trizol法提取總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄。依據(jù)qRT-PCR試劑盒說明書配制反應(yīng)體系，隨后使用熒光定量PCR儀進行擴增。PCR程序為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃預(yù)變性10 s；60 ℃退火、延伸30 s，循環(huán)40次。GAPDH作為內(nèi)參，使用2-ΔΔct計算基因相對表達(dá)量。所有引物序列見表1。

1.7Transwell實驗檢測細(xì)胞的遷移、侵襲能力 將轉(zhuǎn)染后的MCF-7細(xì)胞消化、計數(shù)，使用無血清培養(yǎng)基重懸，遷移實驗直接在transwell小室上室接種4×104個細(xì)胞；下室加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，取出細(xì)胞進行固定、染色，去離子水洗滌干凈用于拍照。侵襲實驗需要提前在小室加入100 μL稀釋好的基質(zhì)膠，并放在37 ℃培養(yǎng)箱凝固1 h，其余步驟同遷移實驗。

表1 引物序列

1.8ChIP實驗檢測H4K20me1在基因啟動子上的富集情況 將MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)于10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞長滿使用37%甲醛交聯(lián)，收集細(xì)胞并加入SDS裂解緩沖液進行超聲，將基因組DNA大部分剪切在200～1000 bp，隨后加入抗體4 ℃過夜孵育進行免疫沉淀，使用多種緩沖液仔細(xì)洗滌，隨后加入洗脫緩沖液65 ℃洗脫，將蛋白質(zhì)和DNA分離開，使用DNA提取試劑抽提DNA用于PCR檢測。詳細(xì)步驟可參考碧云天ChIP assay kit(貨號：P2078)說明書。

2 結(jié)果

2.1SETD8在乳腺癌組織中高表達(dá) qRT-PCR結(jié)果顯示：與癌旁正常組織相比，乳腺癌組織中SETD8的mRNA表達(dá)顯著升高(P<0.001)，見圖1A。免疫組化實驗(immunohistochemistry，IHC)結(jié)果證實：與癌旁正常組織比較，SETD8在乳腺癌組織中顯著高表達(dá)(P<0.05)，見圖1B。

注：與癌旁正常組織比較，*P<0.05。

2.2SETD8 siRNA敲低效果驗證 MCF-7細(xì)胞中轉(zhuǎn)染SETD8 siRNA后，WB結(jié)果表明：相比于Control組，siRNA-1、siRNA-2組SETD8蛋白表達(dá)明顯減少，見圖2A。qRT-PCR實驗結(jié)果證實：相比于Control組，敲低組中SETD8 mRNA水平顯著降低，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.0001)，見圖2B。

注：與Control組比較，****P<0.0001。

2.3敲低SETD8對細(xì)胞遷移、侵襲的影響 MCF-7細(xì)胞轉(zhuǎn)染SETD8 siRNA后，Transwell實驗表明：相比于Control組，siRNA-1、siRNA-2組的遷移、侵襲細(xì)胞數(shù)目均明顯減少，見圖3。

注：與Control組比較，***P<0.001，****P<0.0001。

2.4SETD8對Slug的調(diào)控作用 敲低SETD8表達(dá)后，qRT-PCR結(jié)果顯示：相比于Control組，敲低組的Slug mRNA水平顯著降低(P<0.01)，而Zeb1、Zbe2、Twist1、Snail的mRNA水平基本不變，見圖4A。WB結(jié)果也證實，相比于Control組，siRNA-1、siRNA-2組的Slug蛋白表達(dá)水平明顯減少，見圖4B。

注： 與Control組比較，**P<0.01，***P<0.001。

2.5組蛋白H4K20me1修飾能夠結(jié)合在Slug的啟動子上 ChIP實驗結(jié)果顯示：相比于陰性對照IgG組，H4K20me1修飾能夠顯著富集在Slug的啟動子上(P<0.001)，且結(jié)合位置在轉(zhuǎn)錄起始位點(TSS)上游1500～2000 bp之間，見圖5。

3 討論

組蛋白是生物體中染色質(zhì)的重要組成成分，它由4個核心組蛋白亞基(H2A、H2B、H3、H4)外圍包裹著147個堿基對長度的DNA形成八聚體結(jié)構(gòu)，其中在組蛋白亞基的氨基末端會產(chǎn)生伸向核小體外的組蛋白尾巴[6]。組蛋白尾巴上的氨基酸殘基普遍帶有正電荷，使得其可被多種酶催化修飾，這些修飾包括甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化等[7]。

注：與IgG組比較，***P<0.001。

組蛋白甲基化是最為常見的翻譯后修飾之一，它在染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)、基因組穩(wěn)定性、細(xì)胞有絲分裂，基因轉(zhuǎn)錄和細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等生理生化反應(yīng)中起到了關(guān)鍵作用[8-10]。組蛋白甲基化主要發(fā)生在賴氨酸和精氨酸這兩種氨基酸殘基上，其中賴氨酸殘基較為常見。組蛋白賴氨酸甲基化可以增加氨基酸殘基的疏水性，更容易招募其他蛋白來識別甲基化的賴氨酸進而調(diào)控生物學(xué)進程[11-12]。賴氨酸殘基的甲基化反應(yīng)根據(jù)甲基基團的數(shù)目可分為3類：單甲基化、雙甲基化和三甲基化，每一種形式的甲基化都可被特定蛋白質(zhì)賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(protein lysine methyltransferase，KMT)所催化[13]。KMT可將S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl-L-methionine，SAM)的甲基基團催化轉(zhuǎn)移到賴氨酸殘基側(cè)鏈的ε-胺基上。大多數(shù)的KMT都有SET[Su(var)，Enhancer of zeste，Trithorax]結(jié)構(gòu)域[14]，但有些不含有SET結(jié)構(gòu)域的蛋白也擁有賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶的活性，如DOT1L、METTL等[15]。

SET結(jié)構(gòu)域最早是在黑腹果蠅體內(nèi)被發(fā)現(xiàn)的一段包含3個蛋白質(zhì)的保守序列，這3種蛋白分別是花斑位置效應(yīng)的調(diào)節(jié)蛋白，zeste基因的染色質(zhì)調(diào)節(jié)增強子和三空腔蛋白質(zhì)染色質(zhì)調(diào)節(jié)蛋白[16]。SET結(jié)構(gòu)域擁有130個氨基酸，并且在多種真核生物體內(nèi)廣泛發(fā)現(xiàn)。含有SET結(jié)構(gòu)域的蛋白被稱為SET蛋白家族，其有SETD1、SETD2、SETD7、SETD8等9個主要的成員，它們在調(diào)控基因表達(dá)，基因組印記，干細(xì)胞成熟等方面起到重要作用[17]。SETD8催化的H4K20me1可以招募53BP1蛋白至DNA雙鏈斷裂處進行損傷修復(fù)，它在DNA復(fù)制，染色質(zhì)沉默，細(xì)胞周期，轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[18-19]。SETD8被發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤，如非小細(xì)胞肺癌、肝癌、膀胱癌等中高表達(dá)且與不良預(yù)后有關(guān)，說明SETD8在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。本研究證實SETD8在乳腺癌組織中高表達(dá)，且敲低SETD8能夠抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲遷移能力，說明SETD8對于乳腺癌轉(zhuǎn)移具有重要作用。Slug又名鋅指蛋白Snai2，是Snail轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，是上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中一個重要的轉(zhuǎn)錄因子。研究表明Slug可以介導(dǎo)RAF1誘導(dǎo)的對于閉鎖蛋白的轉(zhuǎn)錄抑制，導(dǎo)致上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，在EMT過程中Slug可以結(jié)合在CXCL12、BSG、E-cadherin等基因的啟動子的E-box序列上(CAGGTG)調(diào)控基因表達(dá)，促使細(xì)胞向間質(zhì)狀轉(zhuǎn)化，提高細(xì)胞的侵襲和遷移能力[20-22]。本研究證實SETD8催化的H4K20me1修飾能夠直接富集在Slug基因的啟動子區(qū)域，進而調(diào)控其轉(zhuǎn)錄。

綜上所述，本研究證實SETD8在乳腺癌組織中高表達(dá)，且在MCF-7細(xì)胞中敲低SETD8表達(dá)能夠抑制細(xì)胞的侵襲、遷移能力，其機制可能與SETD8調(diào)控Slug基因轉(zhuǎn)錄相關(guān)。