李宇佳，孫萍，張翔宇，徐宗軍，王清爽，王宗靈

（1.長春理工大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長春 130022；2.自然資源部海洋生態(tài)環(huán)境科學(xué)與技術(shù)重點實驗室 自然資源部第一海洋研究所，青島 266061）

海洋浮游植物是海水中隨波逐流的單細(xì)胞藻類，是海洋中最主要的初級生產(chǎn)者，為海洋生物提供了必要的生態(tài)學(xué)功能，同時在海洋碳循環(huán)中起著至關(guān)重要的作用［1］。隨著塑料應(yīng)用的迅速發(fā)展，造成海洋水體污染［2］。因此，關(guān)于海洋環(huán)境中微塑料對海洋浮游植物影響研究對于海洋環(huán)境保護(hù)有重要意義。

大量陸源、海源和大氣污染物中的塑料，通過各種渠道進(jìn)入海洋，導(dǎo)致海洋中微塑料含量增高，影響海洋浮游植物生長。因微塑料遮蔽效應(yīng)，降低藻類光合作用效率，從而抑制微藻類生長［3］。微塑料和微藻的理化特性產(chǎn)生相互吸附，阻礙微藻光合作用并促進(jìn)活性氧（ROS）的產(chǎn)生［4］，而且，吸附在微藻細(xì)胞表面的微塑料可能在表面包裹功能區(qū)，限制細(xì)胞與環(huán)境之間能量與物質(zhì)交換或轉(zhuǎn)移，阻礙營養(yǎng)物質(zhì)、光、CO2和O2從培養(yǎng)基進(jìn)入藻細(xì)胞內(nèi)。有害藻代謝產(chǎn)物被鎖定在細(xì)胞內(nèi)擾亂藻細(xì)胞生長［5］。微藻培養(yǎng)物中微塑料的分布與微藻種類和生理狀態(tài)有關(guān)［6］，對微藻的毒性與其粒徑大小有關(guān)［7］，如小粒徑（0.1 μm）聚苯乙烯可抑制小球藻的光合作用［8］。一般來說，微塑料粒徑越小對微藻毒作用越顯著，研究發(fā)現(xiàn)小粒徑聚苯乙烯（0.05μm）可顯著抑制杜氏鹽藻生長，但當(dāng)粒徑增加至6μm時卻無明顯影響［9］。

基于上述研究成果，搭載向陽紅18船于2020年11月在黃渤海執(zhí)行科考期間完成微塑料對浮游植物群落影響海上實驗。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)裝置與實驗條件

向陽紅18船在黃渤海執(zhí)行“中國近海綜合開放航次”任務(wù)中，現(xiàn)場采集表層海水進(jìn)行培養(yǎng)，采樣站點為黃海海域NSA-1站（121.5°E，36.5°N），水深25 m，表層海水溫度為18.24℃，表層海水鹽度為31.63。

將海水按照實驗設(shè)計添加營養(yǎng)鹽和微塑料進(jìn)行培養(yǎng)，每個桶（培養(yǎng)瓶）為一個培養(yǎng)體系，如圖1所示。

圖1 海上現(xiàn)場培養(yǎng)實驗照片

1.2 實驗試劑與儀器設(shè)備

實驗中添加3μm和0.3μm兩種粒徑聚苯乙烯（PS）微塑料。按f/2培養(yǎng)基配方添加營養(yǎng)鹽，按照預(yù)先配制1 000倍儲備液。用過濾海水分別配制儲備液，高壓滅菌器中120℃滅菌30 min備用。

實驗過程中使用的儀器和設(shè)備如表1所示。

表1 實驗所需儀器和設(shè)備表

1.3 實驗設(shè)計與培養(yǎng)方式

在甲板上安裝圍隔裝置，微塑料為帶熒光標(biāo)記的聚苯乙烯（PS），分為1個對照組和8個實驗組。對照組只添加營養(yǎng)鹽，實驗組兩個不同粒徑微塑料添加濃度分別為1 mg/L、5 mg/L、20 mg/L及50 mg/L，如表2所示，添加f/2培養(yǎng)基儲備液進(jìn)行培養(yǎng)。每個對照組和實驗組設(shè)三個重復(fù)，共27個培養(yǎng)瓶。

表2 海上現(xiàn)場培養(yǎng)實驗微塑料添加濃度

1.4 取樣參數(shù)與取樣頻次

浮游植物分為小型（20～200 μm）、微型（2～20μm）和微微型（＜2μm）。

取樣參數(shù)：葉綠素a、分粒級葉綠素a、營養(yǎng)鹽（硝酸鹽、亞硝酸鹽、銨鹽、活性磷酸鹽和活性硅酸鹽）、微微型浮游植物、微型和小型浮游植物［10］。

取樣頻次：實驗期間，初期每2天取樣一次，第6天起每天取樣，取樣前將培養(yǎng)水桶混合均勻，分別取樣并裝入預(yù)先標(biāo)記編號的取樣瓶中。

1.5 樣品采集與分析方法

1.5.1 葉綠素a樣品采集與測定

葉綠素a樣品的采集：從取樣瓶中取100 mL培養(yǎng)后的海水，經(jīng)200μm篩絹預(yù)過濾和GF/F玻璃纖維濾膜過濾，負(fù)壓＜0.03 MPa，保存于超低溫冰箱（-80℃）中。

葉綠素a濃度測定：采用萃取熒光法，按照《海洋調(diào)查規(guī)范 第6部分：海洋生物調(diào)查》（GB/T 12763.6-2007）（中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會，2008b）進(jìn)行測定。

1.5.2 分粒級葉綠素a樣品采集與測定

分析測定細(xì)胞粒徑分別為20～200μm、2～20μm以及0.7～2μm各組分的浮游植物藻對總?cè)~綠素a的貢獻(xiàn)。

從各培養(yǎng)瓶中取100 mL用200μm篩絹濾過的培養(yǎng)海水，依次用20μm篩絹、2μm核孔濾膜和玻璃纖維濾膜分級過濾，濾膜上截留的浮游植物即為各粒級組分，取樣頻次為實驗培養(yǎng)起始（0 d）、生長旺盛期（5 d）及實驗結(jié)束（8 d）時各取樣1次。

葉綠素a各粒級組分含量及百分比計算：依次通過3個規(guī)格濾膜所截留的浮游植物測定結(jié)果即為各粒級組分，對濾膜進(jìn)行葉綠素a萃取后測定結(jié)果即為葉綠素a各粒級組分含量，以mg/m3表示，三者分別占其累加值比例即為各粒級組分百分比。

1.5.3 營養(yǎng)鹽樣品采集與測定

葉綠素a樣品采集時，將過濾后的海水分裝到干凈容器中，做好標(biāo)記，放入-20℃冰箱冷凍保存，用以測定營養(yǎng)鹽濃度變化。

基于分光光度法檢測營養(yǎng)鹽濃度。實驗采用連續(xù)流動分析儀進(jìn)行5項營養(yǎng)鹽指標(biāo)測定［11］，如表3所示。

表3 五項營養(yǎng)鹽檢測方法

1.5.4 微微型浮游植物樣品采集與測定

樣品采集：從各培養(yǎng)瓶中取少量培養(yǎng)海水，經(jīng)20μm篩絹過濾后取4.5 mL置于5 mL凍存管，加入0.5 mL固定液（10%多聚甲醛+0.5%戊二醛）固定混勻避光常溫靜置10 min，充分反應(yīng)后放入液氮速凍0.5 h，轉(zhuǎn)至-80℃超低溫冰箱保存。按培養(yǎng)起始（0 d）、生長旺盛期（5 d）及實驗結(jié)束（8 d）各取樣1次。

測定：采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行微微型浮游植物分類和計數(shù)，如圖2所示。

圖2 流式細(xì)胞儀測定微微型浮游植物雙參數(shù)圖

樣品采集：各培養(yǎng)瓶中60 mL，裝入干凈塑料瓶中，加入濃度2%魯哥氏碘液常溫下避光保存，沉降24 h以上去除上清液，濃縮至一定體積后，用于鏡檢。

細(xì)胞豐度、物種組成、優(yōu)勢種測定：浮游植物的形態(tài)學(xué)物種鑒定和計數(shù)在熒光倒置顯微鏡下進(jìn)行。浮游植物細(xì)胞豐度用單位水體內(nèi)細(xì)胞數(shù)（cells/L）表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 浮游植物各參數(shù)初始值

2.1.1 浮游植物葉綠素a及粒級結(jié)構(gòu)

實驗初始浮游植物葉綠素a的濃度平均值為0.68 mg/m3。經(jīng)分粒級過濾后累加法計算的總?cè)~綠素 a濃度平均為 1.018 mg/m3，0.7～2 μm、2～20μm及20～200μm粒級所占百分比平均值分別25.75%、39.71%及34.54%，如表4所示。

表4 對照組實驗初始葉綠素a粒級結(jié)構(gòu)統(tǒng)計表

2.1.2 微微型浮游植物豐度

微微型浮游植物測定結(jié)果包括微微型光合浮游植物和異養(yǎng)細(xì)菌。微微型光合浮游植物主要包括原綠球藻、聚球藻和微微型真核藻，測定結(jié)果如表5所示。

表5 對照組實驗初始微微型浮游植物豐度統(tǒng)計表

2.1.3 微型和小型浮游植物種類組成與優(yōu)勢種

1.2.1 醫(yī)務(wù)工作者職業(yè)幸福感調(diào)查問卷 該問卷由李桂華等[6]編制，包含5個維度24個條目：身心健康狀況(6個條目)；價值/能力體現(xiàn)(6個條目)；社會支持(5個條目)；工作環(huán)境(4個條目)；經(jīng)濟(jì)收入(3個條目)。采用Likert 5級評分法：1分為完全不符合，2分為基本不符合，3分為不確定，4分為基本符合，5分為完全符合?？偡?20分，分?jǐn)?shù)越高表示職業(yè)幸福感越強(qiáng)。

經(jīng)顯微鏡下鑒定，實驗初始時浮游植物物種組成如表6所示。共鑒定出浮游植物54種，包含38種硅藻、14種甲藻、2種金藻。

表6 培養(yǎng)初始浮游植物群落組成

培養(yǎng)初始時浮游植物優(yōu)勢種中以細(xì)胞粒徑較大甲藻門類的三角角藻占總細(xì)胞豐度為23.2%，百分比最高，其次是硅藻門類的柔弱角毛藻和旋鏈角毛藻，總細(xì)胞豐度的百分比分別為15.9%和11.0%，如表7所示。

表7 培養(yǎng)初始優(yōu)勢種組成

2.2 培養(yǎng)實驗過程中營養(yǎng)鹽濃度的變化

對照組和實驗組均添加f/2培養(yǎng)基，跟蹤測定各培養(yǎng)體系中各營養(yǎng)鹽濃度變化趨勢，如圖3、圖4及圖5所示。結(jié)果顯示，營養(yǎng)鹽的消耗與添加的微塑料粒徑大小和濃度高低間并沒有明顯的差異性和規(guī)律性。但隨著培養(yǎng)時間的增加，磷酸鹽濃度逐漸降低，對磷酸鹽消耗較為明顯，而硝酸鹽和硅酸鹽僅在微塑料添加濃度為50 mg/L時呈明顯下降趨勢。

圖3 各培養(yǎng)體系中硝酸鹽濃度變化曲線

圖4 各培養(yǎng)體系中磷酸鹽濃度變化曲線

圖5 各培養(yǎng)體系中硅酸鹽濃度變化曲線

2.3 浮游植物葉綠素a及粒級結(jié)構(gòu)的變化

2.3.1 葉綠素a的變化

培養(yǎng)實驗前期，對照組和各實驗組葉綠素含量的累積均不明顯，第2天葉綠素a略有增加，第4天葉綠素a緩慢升高，6天起增長較快（圖6和圖7）。對照組三個重復(fù)培養(yǎng)瓶中葉綠素a濃度平均值在6天達(dá)到9.73 mg/m3，7天和8天分別升至16.00 mg/m3和17.31 mg/m3；與對照組相比，各處理組葉綠素a濃度在4天時開始出現(xiàn)差異，6～8天期間差異明顯，且與微塑料粒徑和濃度有關(guān)。

3μm聚苯乙烯添加實驗結(jié)果：1 mg/L和5 mg/L較低濃度聚苯乙烯對浮游植物生長有較為明顯的促進(jìn)作用，葉綠素a濃度6天開始，相較于對照組迅速積累，至8天平均值高達(dá)34.33 mg/m3。20 mg/L和50 mg/L較高濃度聚苯乙烯對浮游植物生長有一定抑制作用，7天兩個實驗組的葉綠素a濃度分別為14.89 mg/m3和12.22 mg/m3，抑制不明顯，至8天葉綠素a分別為17.21 mg/m3和17.97 mg/m3，該種抑制呈現(xiàn)削弱趨勢，如圖6所示。

圖6 不同濃度梯度的3μm聚苯乙烯影響下葉綠素含量隨時間的變化

0.3μm聚苯乙烯添加實驗結(jié)果與3μm相比呈現(xiàn)明顯不同規(guī)律，低濃度時沒有促進(jìn)作用，而小粒徑聚苯乙烯對浮游植物生長抑制作用隨著濃度增加而增加。微塑料濃度越高抑制作用越明顯，如圖7所示。

圖7 不同濃度梯度的0.3μm聚苯乙烯影響下葉綠素含量隨時間的變化

2.3.2 葉綠素a粒級結(jié)構(gòu)的變化

在實驗培養(yǎng)起始（0 d）、生長旺盛期（5 d）及實驗結(jié)束（8 d）時均進(jìn)行了分粒級葉綠素a測定，對照組和各實驗組各粒級葉綠素a濃度統(tǒng)計如表8所示，不同培養(yǎng)期浮游植物各粒級葉綠素a濃度柱形圖（圖8和圖10）和百分比堆積柱形圖（圖9和圖11）。不同實驗組各粒級葉綠素a濃度變化與微塑料粒徑大小和添加濃度均有關(guān)。

表8 對照組和實驗組培養(yǎng)過程中不同粒級葉綠素a濃度的統(tǒng)計表

圖8 3μm聚苯乙烯實驗組浮游植物各粒級葉綠素a濃度柱形圖

圖9 3μm聚苯乙烯實驗組浮游植物各粒級葉綠素a百分比堆積柱形圖

圖10 0.3μm聚苯乙烯實驗組浮游植物各粒級葉綠素a濃度柱形圖

圖11 0.3μm聚苯乙烯實驗組浮游植物各粒級葉綠素a百分比堆積柱形圖

上述研究表明，營養(yǎng)鹽加富情況下，在對照組中各粒徑浮游植物生長均有促進(jìn)作用，更利于2～20μm粒級微型浮游植物生長。較大粒徑（3μm）聚苯乙烯在低濃度（1 mg/L和5 mg/L）時可促進(jìn)浮游植物生長，其次是20～200μm小型浮游植物。而對0.7～2μm微微型浮游植物影響不大；較大粒徑（3μm）聚苯乙烯在高濃度（20 mg/L和50 mg/L）時抑制浮游植物生長，2～20μm微型浮游植物和20～200μm小型浮游植物抑制作用明顯，但隨著培養(yǎng)天數(shù)延長抑制作用減弱；較小粒徑（0.3μm）聚苯乙烯對浮游植物生長抑制作用隨著濃度增加而增加，但培養(yǎng)天數(shù)延長，低濃度下（1 mg/L和5 mg/L）抑制作用減弱；較高濃度下（20 mg/L和50 mg/L）抑制作用越發(fā)明顯。

2.4 微微型浮游植物的變化

在實驗培養(yǎng)起始（0 d）、生長旺盛期（5 d）及實驗結(jié)束（8 d）時采用流式細(xì)胞儀法進(jìn)行了微微型浮游植物測定，對照組和各實驗組各類群微微型浮游植物豐度和細(xì)菌數(shù)量統(tǒng)計如表9所示。

表9 對照組和各實驗組各類群微微型光合浮游植物豐度和細(xì)菌數(shù)量統(tǒng)計表/（103cells/cm3）

對照組初始微微型光合浮游植物以原綠球藻（Pro）為主［12］，營養(yǎng)鹽加富條件下，Pro豐度略有降低，聚球藻（Syn）和微微型真核藻（PEuk）生長較為明顯，8 d其豐度分別為31.61×103cells/cm3和 82.96×103cells/cm3。

直徑為3μm和0.3μm聚苯乙烯添加實驗結(jié)果：PEuk受到影響相對較??；Syn生長均受到了明顯抑制作用，且隨濃度增加抑制作用明顯加強(qiáng)；Pro在5 d時受到明顯抑制，而8 d時各實驗組Pro豐度均超過了對照組，表明抑制作用隨培養(yǎng)天數(shù)增加消失，甚至進(jìn)而轉(zhuǎn)變?yōu)榇龠M(jìn)，如圖12和圖13所示。

圖12 3μm聚苯乙烯添加實驗中微微型光合浮游植物豐度堆積柱形圖

圖13 0.3μm聚苯乙烯添加實驗中微微型光合浮游植物豐度堆積柱形圖

采用流式細(xì)胞儀法測定的細(xì)菌數(shù)量結(jié)果顯示，浮游植物生長受到抑制的實驗組細(xì)菌數(shù)量較對照組高，而生長受到促進(jìn)的實驗組細(xì)菌數(shù)量較對照組低，如圖14和圖15所示。

圖14 3μm聚苯乙烯添加實驗中細(xì)菌數(shù)量柱形圖（流式細(xì)胞儀法）

圖15 0.3μm聚苯乙烯添加實驗中細(xì)菌數(shù)量柱形圖（流式細(xì)胞儀法）

2.5 微型和小型浮游植物優(yōu)勢種

在實驗培養(yǎng)起始（0 d）、生長旺盛期（5 d）及實驗結(jié)束（8 d）時采集浮游植物種類分析鑒定樣品，顯微鑒定分析結(jié)果統(tǒng)計如表10所示。與初始值相比，經(jīng)過5 d和8 d時間的培養(yǎng)，對照組和各實驗組甲藻類均不再成為優(yōu)勢種；優(yōu)勢種全部為硅藻，且以柔弱角毛藻、旋鏈角毛藻、扁面角毛藻為主，在8 d時部分實驗組中尖刺偽菱形藻可成為前二優(yōu)勢種。優(yōu)勢種組成及其所占比例的變化同聚苯乙烯微塑料粒徑大小和添加濃度均無明顯關(guān)聯(lián)性。

表10 培養(yǎng)實驗不同時期浮游植優(yōu)勢種統(tǒng)計表

3 結(jié)論

通過實地采集并培養(yǎng)了黃海海域表層海水中自然浮游植物群落，開展了不同濃度（1 mg/L、5 mg/L、20 mg/L和50 mg/L）、不同粒徑（3μm和0.3μm）聚苯乙烯微塑料對微微型、微型和小型浮游植物優(yōu)勢種生物量（葉綠素a）及其粒級結(jié)構(gòu)（分粒級葉綠素a）的影響研究。結(jié)果表明：聚苯乙烯粒徑越小，濃度越高，對浮游植物群落生長抑制作用越明顯；粒徑相對較大（3μm）聚苯乙烯在低濃度（1 mg/L和5 mg/L）時一定程度上促進(jìn)其生長；2～20μm微型和20～200μm小型浮游植物，更易受到微塑料添加的影響；而0.7～2μm微型浮游植物中真核藻受到微塑料添加的影響相對較小。例如，聚球藻生長受到抑制作用明顯，且隨濃度增加而加強(qiáng)；原綠球藻抑制作用隨培養(yǎng)天數(shù)增進(jìn)而轉(zhuǎn)變?yōu)榇龠M(jìn)作用。