周 力,高占紅,張峰碩,侯生珍,桂林生*
(1.青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院,西寧 810016;2.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院,銀川 750021)
伴隨我國養(yǎng)羊業(yè)規(guī)模化持續(xù)推進(jìn),對能量(重點(diǎn)是玉米)飼料原料需求也日益增加。我國玉米資源稀缺,主要依賴進(jìn)口且需求量極大。小麥價(jià)格低廉且蛋白質(zhì)、氨基酸含量較高,是替代玉米的理想能量飼料資源[1]。使用小麥替代飼料中部分玉米,可緩解玉米短缺壓力,增加養(yǎng)殖效益。但因小麥中含有較多非淀粉多糖(主要以阿拉伯木聚糖和β-葡聚糖較多)等抗?fàn)I養(yǎng)因子,動(dòng)物飼料中應(yīng)用受限[2]。眾所周知,木聚糖酶在高效水解木聚糖方面發(fā)揮重要作用。通過添加木聚糖酶可分解細(xì)胞壁釋放包裹基中的養(yǎng)分,消除抗?fàn)I養(yǎng)作用[3]。邢勇等研究發(fā)現(xiàn)在日糧中添加1×106U·t-1木聚糖酶可顯著提高其生產(chǎn)性能[4]。靳愉琳研究以植物性蛋白原料為主,在日糧中添加木聚糖酶,結(jié)果發(fā)現(xiàn)木聚糖酶可提高草魚生產(chǎn)性能,促進(jìn)腸道生長,同時(shí)優(yōu)化腸道微生物,增強(qiáng)對腸炎抵抗能力[5]。木聚糖酶還可改善仔豬腸道物理屏障與免疫屏障功能,促進(jìn)體外營養(yǎng)物質(zhì)消化率[6]。目前,木聚糖酶廣泛應(yīng)用于禽類、水產(chǎn)以及單胃動(dòng)物研究中?,F(xiàn)階段有關(guān)木聚糖酶與反芻動(dòng)物(尤其是綿羊)生長發(fā)育和胃腸道關(guān)系的報(bào)道較少。
瘤胃作為反芻動(dòng)物獨(dú)特的消化器官,內(nèi)含豐富的細(xì)菌、真菌、原蟲等微生物,可消化飼料中粗纖維,利用非蛋白氮(Non protein nitrogen,NPN)合成微生物蛋白(Microbial protein,MCP)[7]。微生物之間的相互作用對維持反芻動(dòng)物瘤胃內(nèi)環(huán)境平衡和降解飼料至關(guān)重要。飼糧組成是影響反芻動(dòng)物瘤胃微生物生長的關(guān)鍵條件,酶制劑是重要因素之一[8]。揮發(fā)性脂肪酸(Volatile fatty acid,VFA)作為瘤胃微生物發(fā)酵降解產(chǎn)物,成分主要為乙酸、丙酸和丁酸等,為反芻動(dòng)物提供能量,可維持瘤胃內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài),促進(jìn)機(jī)體發(fā)育[9]。添加外源木聚糖酶是否改變反芻動(dòng)物瘤胃中揮發(fā)性脂肪酸比例以及影響瘤胃微生物區(qū)機(jī)理尚不明確。肌肉營養(yǎng)價(jià)值與其抗氧化能力是評價(jià)反芻動(dòng)物肉質(zhì)優(yōu)劣重要指標(biāo)[10]。因此,假設(shè)小麥型飼糧中添加木聚糖酶,可能通過影響高原型藏羊瘤胃微生物菌群結(jié)構(gòu)改變?nèi)赓|(zhì)性狀。
基于此,本研究擬以高原型藏羊?yàn)樵囼?yàn)對象,采集瘤胃內(nèi)容物與背最長肌,分析小麥型飼糧中添加木聚糖酶對育肥期藏羊生長性能、瘤胃揮發(fā)性脂肪酸、微生物菌群結(jié)構(gòu)以及肉品質(zhì)的影響,以期為外源酶制劑在綿羊生產(chǎn)中的合理應(yīng)用提供理論參考。
試驗(yàn)選取胎次一致、體重相近[(19.35±2.18)kg]且健康狀況良好的2~3月齡高原型藏羊公羔60只,按組間體重?zé)o差異原則將其隨機(jī)分兩組,每組30只,每組5個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)6只羊。其中一組飼喂含有小麥型飼糧(HW),另外一組在含有小麥型飼糧基礎(chǔ)上添加0.2%木聚糖酶(EW)。試驗(yàn)持續(xù)100 d,飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束時(shí),分別從每組中隨機(jī)選擇5只試驗(yàn)羊屠宰。
試驗(yàn)期間,HW組試驗(yàn)羊飼喂含有小麥型飼糧(青海香咔梅朵飼料廠,營養(yǎng)水平見表1),EW組試驗(yàn)羊則在含有小麥型飼糧基礎(chǔ)上添加0.2%木聚糖酶(湖北武漢新華揚(yáng)生物股份有限公司,活性100 000 U·g-1)。試驗(yàn)分為兩個(gè)階段,第一個(gè)階段為0~30 d(精料∶粗料=6∶4),第二個(gè)階段為31~90 d(精料∶粗料=7∶3)。粗飼料由燕麥青干草+燕麥青貯組成(以干物質(zhì)1∶1計(jì))。所有試驗(yàn)羊分欄飼養(yǎng),每天飼喂兩次(08:00和17:30),自由采食與飲水,按照牧場常規(guī)管理作免疫、驅(qū)蟲等處理。
表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of basal diets(DM basis) (%)
試驗(yàn)結(jié)束時(shí),每組隨機(jī)選擇5只試驗(yàn)羊進(jìn)行屠宰,迅速分離瘤胃,瘤胃液經(jīng)4層紗布過濾后,將濾液分裝于無菌凍存管中,迅速投入液氮速凍,采集背最長肌樣品,剔除表面筋膜與脂肪,評定肉品質(zhì)。
1.4.1 生長性能測定
試驗(yàn)開始與結(jié)束時(shí)對所有試驗(yàn)羊空腹稱重,分別作為初始體重和終末體重。每日飼喂前準(zhǔn)確記錄投料量,同時(shí)定時(shí)收集剩料并稱重,計(jì)算分析試驗(yàn)羊平均日增重(Average daily gain,ADG)、平均日采食量(Average daily feed intake,ADFI)和料重比(Feed to gain,F(xiàn)/G),相關(guān)公式如下所示:
平均日增重=(終末體重-初始體重)/試驗(yàn)天數(shù);
平均日采食量=(投料量-剩料量)/試驗(yàn)天數(shù);
料重比=平均日采食量/平均日增重。
1.4.2 揮發(fā)性脂肪酸
利用日本島津(GC-2010 plus)氣相色譜儀測定揮發(fā)性脂肪酸。
1.4.3 瘤胃微生物區(qū)系
選用DNA提取試劑盒(E.Z.N.A.?Stool DNA Kit)提取,并通過瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質(zhì)量,同時(shí)采用紫外分光光度計(jì)對DNA進(jìn)行定量。瘤胃液DNA擴(kuò)增目的片段為V3+V4區(qū),其擴(kuò)增引物 序 列 為341F:5'CCTACGGGNGGCWGCAG3';805R:5'GACTACHVGGGTATCTAATCC3'。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為:98℃30 s,98℃10 s,54℃30 s,72℃45 s,72℃10 min,4℃∞,共35個(gè)循環(huán);PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為:Phusion Hot start flex 2X Master Mix 12.5 μL,F(xiàn)orward Primer 2.5 μL,Reverse Primer 2.5 μL,Template DNA 50 ng,補(bǔ)ddH2O到25 μL。將擴(kuò)增得到PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠確證。PCR產(chǎn)物由AMPure XT beads(Beckman Coulter Genomics,Danvers,MA,USA)純 化,Qubit(Invitrogen,USA)定量。擴(kuò)增子池用于測序,擴(kuò)增子文庫大小和數(shù)量分別利用Agilent 2100生物分析儀(Agilent,美國)和Illumina(Kapa Biosciences,Woburn,MA,美國)文庫定量試劑盒作評估。NovaSeq PE250平臺上進(jìn)行排序。
1.4.4 肌肉營養(yǎng)成分
羊肉中水分含量檢測參照GB 5009.3-2016《食品中水分的測定》;粗蛋白含量檢測參照GB 5009.5-2016《食品中蛋白質(zhì)的測定》;粗脂肪含量檢測參照GB 5009.6-2016《食品中脂肪的測定》;粗灰分含量測定參照GB 5009.4-2016《食品中灰分的測定》。
1.4.5 肌肉抗氧化能力
超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)過氧化氫酶(Catalase,CAT)以及谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase,GSH-Px)活性,丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量以及總抗氧化能力(Total antioxygenic capacity,T-AOC)含量測定均按照相關(guān)試劑盒說明操作,試劑盒均購自江蘇酶標(biāo)生物有限公司。
試驗(yàn)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。使用Excel 2019對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行初步整理,通過T檢驗(yàn)進(jìn)行分析,以P<0.05表示為差異顯著。
藏羊生長性能結(jié)果如表2所示,兩組間藏羊平均日增重、平均日采食量和料重比差異均不顯著(P>0.05)。
表2 木聚糖酶對藏羊生長發(fā)育的影響Table 2 Effects of xylanase on growth development of Tibetan sheep
藏羊瘤胃揮發(fā)性脂肪酸結(jié)果如表3所示,兩組間乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸以及戊酸含量差異不顯著(P>0.05)。說明木聚糖酶對藏羊瘤胃揮發(fā)性脂肪酸影響較小。
表3 木聚糖酶對藏羊瘤胃揮發(fā)性脂肪酸含量的影響Table 3 Effects of xylanase on the content of volatile fatty acid in rumen of Tibetan sheep (mmol·L-1)
2.3.1 測序結(jié)果與質(zhì)量評估
應(yīng)用Illumina Mi Seq平臺對試驗(yàn)羊瘤胃液內(nèi)容物10個(gè)樣本中16S rDNA的V3~V4區(qū)進(jìn)行檢測(見表4),結(jié)果共獲得685 041條有效序列,所有樣本Q30均在81.03%以上,GC含量也均在53.03%以上,說明測序結(jié)果良好,可用于下一步分析。
表4 測序有效數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)Table 4 Statistics of valid sequencing data
2.3.2 韋恩圖與稀釋曲線
韋恩圖(Venn figure)可直觀表明不同組間有效序列聚類成OTU(Operational taxonomic unit)的情況。由圖1A可知,基于相似性>97%原則,共獲得5 397個(gè)OTU,兩組間共有551個(gè),其中EW組獨(dú)有2 897個(gè),HW組獨(dú)有1 949個(gè)。稀釋曲線(Rarefaction curve)可直接反映測序數(shù)據(jù)量合理性,間接反映樣品中物種豐富度。由圖1B可知,各樣品稀釋曲線趨于平坦,表明測序數(shù)據(jù)量漸進(jìn)合理。
圖1 韋恩圖(A)與稀釋曲線(B)Fig.1 Venn figure(A)and rarefaction curve(B)
2.3.3 Alpha多樣性分析
Alpha多樣性用于反映物種豐富度、均勻度及測序深度。由表5可知,所有樣本OTU覆蓋率均達(dá)98%以上,說明本次試驗(yàn)所建立文庫能夠覆蓋樣本中絕大部分物種信息。兩組間指數(shù)Simpson、Shannon和Ace指數(shù)差異不顯著(P>0.05),但HW組Chao1指數(shù)顯著小于EW組(P<0.05),表明HW和EW組藏羊瘤胃菌群豐富度存在顯著差異。
表5 Alpha多樣性指數(shù)分析Table 5 Alpha diversity index analysis
2.3.4 門水平上細(xì)菌組成
在門水平,瘤胃主要物種組成豐度依次為厚壁菌門(Firmicutes,53.20%)、擬桿菌門(Bacteroidetes,34.43%)、變形菌門(Proteobacteria,8.29%)、未分類(Unclassified,1.05%)、髕骨細(xì)菌門(Patescibacteria,1.00%)。由圖2可知,10個(gè)樣品中優(yōu)勢菌群均以厚壁菌門、擬桿菌門及變形菌門為主,其中EW組擬桿菌門顯著高于HW組(P<0.05),變形菌門則相反(P<0.05),厚壁菌門在兩組中無顯著差異(P>0.05)。
圖2 門水平上細(xì)菌分布Fig.2 Distribution of bacteria at phylum level
2.3.5 屬水平上細(xì)菌組成
在屬水平,瘤胃主要物種組成豐度依次為普雷氏菌屬_1(Prevotella_1,10.46%);瘤胃球菌科_NK4A214群(Ruminococcaceae_NK4A214_group,7.96%);F082_未分類(F082_unclassified,6.79%);解琥珀酸菌屬(Succiniclasticum,6.39%);瘤胃球菌屬_2(Ruminococcus_2,5.20%)等。由圖3可知,10個(gè)樣品中優(yōu)勢菌群均以普雷氏菌屬_1、瘤胃球菌科_NK4A214群以及F082_未分類為主,且兩組中普雷氏菌屬_1、瘤胃球菌科_NK4A214群以及F082_未分類差異均不顯著(P>0.05)。
圖3 屬水平上細(xì)菌分布Fig.3 Distribution of bacteria at genus level
2.3.6 功能預(yù)測
基于PICRUSt2功能預(yù)測根據(jù)t-test差異檢驗(yàn),P<0.05閾值,同時(shí)功能數(shù)據(jù)庫中豐度數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異顯著的功能(置信區(qū)間95%),可初步推測藏羊瘤胃菌群主要與D-fructuronate degradation(D-果糖醛酸降解)、L-methionine biosynthesis III(L-蛋氨酸生物合成III)、palmitate biosynthesis II(Bacteria and plants)(棕櫚酸生物合成II(細(xì)菌和植物))等功能有關(guān)(見圖4)。
圖4 KEGG功能預(yù)測Fig.4 KEGG function prediction
藏羊肌肉營養(yǎng)分析結(jié)果如表6所示,兩組間水分、灰分差異不顯著(P>0.05),而HW組粗蛋白、脂肪則顯著小于EW組(P<0.05)。
表6 木聚糖酶對藏羊肌肉營養(yǎng)成分的影響Table 6 Effects of xylanase on muscle nutritional component of Tibetan sheep (%)
藏羊肌肉抗氧化能力結(jié)果見表7。
由表7可知,兩組間超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶活性及總抗氧化能力含量差異不顯著(P>0.05),但EW組丙二醛含量卻顯著小于HW組(P<0.05)。
表7 木聚糖酶對藏羊肌肉抗氧化性能的影響Table 7 Effects of xylanase on muscle antioxidant performance of Tibetan sheep
木聚糖酶主要通過兩種機(jī)制發(fā)揮作用,包括破壞細(xì)胞壁并釋放細(xì)胞內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)、降低食糜黏度及促進(jìn)食糜和酶混合[11]。Kiarie等研究發(fā)現(xiàn),添加木聚糖酶可顯著改善1~21日齡雞體重和飼料轉(zhuǎn)化率[12]。趙亞鵬等在飼糧中添加100 g·t-1木聚糖酶和寡糖復(fù)合物可降低蛋雞小腸食糜黏度及pH,增強(qiáng)機(jī)體免疫機(jī)能,對其生產(chǎn)性能和蛋品質(zhì)無顯著影響[13]。Mejicanos等試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在小麥與小麥-菜籽粕日糧中添加木聚糖酶可提高斷奶仔豬營養(yǎng)物質(zhì)消化率和食糜pH,但不影響其生長性能[14]。在本試驗(yàn)中,與HW組相比,EW組藏羊平均日增重與料重比均無顯著差異,表明斷奶羔羊飼料中添加0.2%木聚糖酶不顯著,原因可能與動(dòng)物品種、飼糧類型、添加劑量和飼養(yǎng)環(huán)境等有關(guān),與Taylor等研究結(jié)果相似[15]。
飼料中碳水化合物經(jīng)瘤胃微生物降解生成大量揮發(fā)性脂肪酸,其含量變化直接評估反芻動(dòng)物對養(yǎng)分的消化吸收能力,還可為機(jī)體活動(dòng)提供70%~80%能量。揮發(fā)性脂肪酸主要有乙酸、丙酸、丁酸等[16]。其中乙酸通過三羧酸循環(huán)過程釋放ATP為機(jī)體提供能量,丙酸作為葡萄糖合成前體物質(zhì),其含量較多時(shí)意味著反芻動(dòng)物可得到更多能量用于生長[17]。丁酸在瘤胃吸收過程中,大部分轉(zhuǎn)變?yōu)棣?羥丁酸為動(dòng)物肌肉提供能量來源[18]。從本試驗(yàn)結(jié)果看,兩組間揮發(fā)性脂肪酸含量差異不顯著,可能與木聚糖酶添加量不足未能充分降解小麥抗?fàn)I養(yǎng)因子有關(guān)。本試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)藏羊瘤胃發(fā)酵后主要產(chǎn)生乙酸、丙酸和丁酸等。
試驗(yàn)通過16S rDNA高通量測序技術(shù)可較好反映反芻動(dòng)物瘤胃中細(xì)菌真實(shí)情況。當(dāng)樣本覆蓋率高于97%時(shí)說明測序樣本取樣較充分[19]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)樣本覆蓋率高于98%,證實(shí)此次測序結(jié)果可真實(shí)反映藏羊瘤胃微生物區(qū)系。OTU代表反芻動(dòng)物瘤胃菌群種類和數(shù)量,本試驗(yàn)從瘤胃液中共獲得5 397個(gè)OTU,其中2 897個(gè)為EW組獨(dú)有,1 949個(gè)為HW組獨(dú)有,該結(jié)果表明在飼糧中添加0.2%木聚糖酶增加藏羊瘤胃細(xì)菌種類與數(shù)量。Alpha多樣性指數(shù)中,Ace與Chao1指數(shù)反映微生物豐富度,Shannon與Simpson指數(shù)體現(xiàn)微生物多樣性[20]。本試驗(yàn)中兩組間Ace、Simpson和Shannon指數(shù)差異均不顯著,但EW組Chao1指數(shù)顯著大于HW組,進(jìn)一步揭示小麥型飼糧中添加木聚糖酶可提高藏羊瘤胃微生物豐富度。
曾鈺等研究表明,舍飼牦牛瘤胃優(yōu)勢菌門為擬桿菌門、厚壁菌門和變形菌門[21]。新生羔羊優(yōu)勢菌群為擬桿菌門、變形菌門和厚壁菌門[22]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)厚壁菌門、擬桿菌門和變形菌門是藏羊瘤胃液中三大優(yōu)勢菌群,與前人結(jié)論一致。本研究中,與HW組相比,EW組厚壁菌門、擬桿菌門相對豐度較高,其中擬桿菌門差異顯著,說明添加0.2%木聚糖酶可明顯促進(jìn)藏羊瘤胃消化吸收能力。同時(shí)HW組變形菌門相對豐度顯著高于EW組,進(jìn)一步表明HW組瘤胃菌群結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性比EW組差。
本試驗(yàn)結(jié)果表明,與HW組相比,EW組普雷氏菌屬_1相對豐度提高。原因可能是木聚糖酶降解小麥細(xì)胞壁,消除其抗?fàn)I養(yǎng)因子,釋放養(yǎng)分,反芻動(dòng)物瘤胃中需更多細(xì)菌進(jìn)行分解。瘤胃球菌科_NK4A214群(Ruminococcaceae_NK4A214_group)是厚壁菌門一種,主要功能是降解纖維物質(zhì)。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),兩組間瘤胃球菌科_NK4A214群相對豐度差異不顯著,提示飼糧中添加木聚糖酶未對藏羊瘤胃中瘤胃球菌科_NK4A214群產(chǎn)生明顯影響?;赑ICRUSt2功能預(yù)測,本研究初步推測D-果糖醛酸降解、L-蛋氨酸生物合成III、棕櫚酸生物合成II(細(xì)菌和植物)為藏羊瘤胃主要通路。
本試驗(yàn)結(jié)果表明,EW組粗蛋白含量顯著高于HW組,提示在飼料中添加木聚糖酶明顯提高藏羊肌肉中粗蛋白質(zhì)含量,可滿足人類對優(yōu)質(zhì)膳食的需求。適宜的脂肪含量可有效提高羊肉風(fēng)味、嫩度以及多汁性等,過高或過低脂肪均對肉質(zhì)產(chǎn)生不利影響[23]。一般情況下,脂肪含量在2.5%~3.5%時(shí)最為理想。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)HW組粗脂肪含量顯著低于EW組,說明木聚糖酶添加可明顯促進(jìn)藏羊肉脂肪沉積,增加口感。水分通常占羊肉70%左右,且水分含量與肉色、風(fēng)味物質(zhì)及嫩度等指標(biāo)密切相關(guān)[24]。而粗灰分代表肌肉中礦物質(zhì)與維生素的含量,本試驗(yàn)中,兩組間粗灰分與水分含量差異均不顯著,表明飼糧中添加木聚糖酶對舍飼藏羊肌肉中水分和粗灰分含量無不利影響。提示今后可通過在小麥型飼糧中額外添加0.2%木聚糖酶達(dá)到改善肉質(zhì)的目的。
本研究發(fā)現(xiàn),兩組間過氧化氫酶、超氧化物歧化酶及谷胱甘肽過氧化物酶活性無顯著差異,說明木聚糖酶對藏羊肌肉酶活性無顯著性變化??偪寡趸芰κ菣C(jī)體抗氧化能力的總體評價(jià)指標(biāo)。從本試驗(yàn)結(jié)果看,兩組間總抗氧化能力水平差異不顯著。丙二醛可反映機(jī)體脂質(zhì)過氧化程度,其含量越高說明氧化損傷越嚴(yán)重。本試驗(yàn)中,HW組丙二醛含量卻明顯高于EW組。推測可能是因木聚糖酶降解小麥型飼料中木聚糖,有利于促進(jìn)養(yǎng)分消化吸收,減輕小麥抗?fàn)I養(yǎng)作用,達(dá)到緩解機(jī)體氧化應(yīng)激目的。由此可知,飼糧中添加木聚糖酶可明顯抑制藏羊肌肉脂質(zhì)過度氧化作用,減少氧自由基侵害。
綜上,在小麥型飼糧中添加0.2%木聚糖酶可明顯提高藏羊瘤胃細(xì)菌豐富度,有效改善肉質(zhì)特性,但對其生長性能和揮發(fā)性脂肪酸無顯著影響。