欒非時(shí)，倪博新，劉宏宇，劉 識(shí)

（1.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部東北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，哈爾濱 150030）

西 瓜[Citrullus lanatus（Thunb.）Matsumura&Nakai]是全球受歡迎水果之一，種植廣泛。中國(guó)作為西瓜生產(chǎn)和消費(fèi)大國(guó)，西瓜產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，產(chǎn)量、面積均位居世界第一[1]。20世紀(jì)30年代以來(lái)各國(guó)研究者圍繞西瓜性狀開展遺傳研究，如果肉顏色[2]、果實(shí)形狀和大小[3]、果皮相關(guān)性狀[4-5]，開花習(xí)性等重要目標(biāo)性狀[6]。西瓜果實(shí)外部形態(tài)分為果實(shí)形狀、表皮顏色、條紋（清晰或擴(kuò)散）、條紋顏色和寬度等。內(nèi)部形態(tài)主要包括果皮厚度、果肉顏色和硬度。西瓜果皮外觀影響消費(fèi)者評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，是重要育種性狀，選擇符合大眾期望的果皮外部性狀是育種主要目標(biāo)。20世紀(jì)30年代末和40年代初，研究人員建立關(guān)于西瓜果皮表面相關(guān)性狀遺傳模型，西瓜果皮顏色及條紋由3個(gè)等位基因G、gs和g控制，控制條紋的基因gs對(duì)等位基因G（深綠色果皮）為隱性，但gs對(duì)淺綠色果皮g為顯性[3,7]。Lou和Wehner在上述研究基礎(chǔ)上，提出西瓜果皮和條紋顏色遺傳模式，G基因座上有5個(gè)等位基因：G（深綠色果皮）、gW（果皮寬條紋）、gM（果皮中寬條紋）、gN（果皮窄條紋）和g（淺綠色表皮），顯性效應(yīng)為G＞gW＞gM＞gN＞g[8]。Park等將控制西瓜黃色果皮的基因Dgo定位到4號(hào)染色體前端[9]。Yang等對(duì)黃-綠色果皮、深綠-淺綠色果皮，有無(wú)條紋3個(gè)控制果皮表型的性狀開展遺傳和連鎖分析發(fā)現(xiàn)，3個(gè)性狀均受單基因控制，其中黃色果皮對(duì)綠色果皮為顯性，深綠色果皮對(duì)淺綠色果皮為顯性，條紋對(duì)無(wú)條紋為顯性[10]。

植物授粉率和座果率與植株體性別表達(dá)關(guān)系密切。被子植物花器官包括雌花、雄花和完全花，不同組合方式使植株以7種主要性別形式存在：雌雄異花同株性型、雄全同株性型、雌全同株性型、雌花雄花完全花性型、完全花株性型、全雌株和全雄株性型[11]。國(guó)內(nèi)外研究學(xué)者已對(duì)葫蘆科作物性別分化開展大量研究。黃瓜植株性別由三對(duì)等位基因共同決定，分別為M/m、F/f和A/a基因，其中M基因控制單性花發(fā)育，m基因控制完全花發(fā)育，F(xiàn)基因控制雌花發(fā)育，a基因參與控制雄性系發(fā)育[12-14]。甜瓜性別分化受3個(gè)基因控制，為a、g、m基因，a基因與雄全同株發(fā)育相關(guān)；g基因控制全雌株性狀；m基因與雌全同株和三體同株性型相關(guān)[15]。西瓜中，Rosa以西瓜雌雄異花同株和雄全同株為材料開展遺傳分析，認(rèn)為西瓜雄全同株受隱性單基因a控制[16]。Jiang和Lin認(rèn)為隱性單基因gy控制西瓜全雌株性型[17]。本研究以淺綠色果皮雄全同株材料ZXG1555、綠色果皮雌雄異花同株材料COS為親本，構(gòu)建F2代群體及兩組極端性狀基因池（綠色-淺綠色果皮、單性花-兩性花），結(jié)合BSA-seq與親本重測(cè)序數(shù)據(jù)，利用InDel和CAPS標(biāo)記對(duì)F2群體作基因分型，縮小定位區(qū)間，分析區(qū)間內(nèi)基因，篩選并初步推測(cè)候選基因。

1 材料與方法

1.1 植物材料

母本（P1）為ZXG1555淺綠色果皮，雄全同株，雌花為兩性花（由國(guó)家西甜瓜種質(zhì)資源中期庫(kù)提供）；父本（P2）為Cream of Saskatchewan（簡(jiǎn)稱“COS”）綠色果皮，雌雄異花同株，雌花為單性花（由原美國(guó)農(nóng)業(yè)部南部研究中心Angela R.Davis博士提供）。親本雜交獲得F1代，F(xiàn)1自交獲得F2代。2021年春季，P1（15株）、P2（15株）、F1（15株）和F2（216株）植株在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)向陽(yáng)試驗(yàn)示范基地種植；2021年秋季，播種200株F2于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)設(shè)施園藝工程中心育種溫室內(nèi)，全部采用隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)設(shè)計(jì)播種，雙蔓整枝。

1.2 表型調(diào)查與統(tǒng)計(jì)分析

授 粉40～45 d后，收 獲P1、P2、F1和F2代 果實(shí)，直接觀察果皮表面顏色情況并拍照保存，統(tǒng)計(jì)果皮顏色分離情況，作卡方檢驗(yàn)，明確果皮顏色性狀在群體中遺傳規(guī)律。

分別于2021年春秋兩季晴天清晨對(duì)開放雌花作表型統(tǒng)計(jì)，記錄每朵雌花上雄蕊數(shù)量，每株至少統(tǒng)計(jì)4朵雌花。根據(jù)Martínez等[18]定義的兩性花指數(shù)（Andromonoecious index，AI值）對(duì)雌花計(jì)算AI值及分類，將無(wú)雄蕊發(fā)育的單性雌花定義為AI=1，雄蕊數(shù)為1和2或雄蕊不產(chǎn)生花粉的兩性花AI=2，雄蕊數(shù)大于或等于3且產(chǎn)生花粉的兩性花AI=3。計(jì)算分離群體中各單株AI平均值，AI＜1.2雌花為單性花，AI＞1.2雌花為非單性花。調(diào)查比例，使用Graphpad Prism 8.0繪制AI值在F2代群體中頻率分布直方圖。

1.3 BSA-seq及基因初步定位

1.3.1 DNA提取及BSA-seq分析

采集P1、P2、F1、F2代單株幼嫩葉片并存放于-80℃冰箱中，采用改良CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）法提取基因組DNA，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳和DNA紫外分光光度計(jì)檢驗(yàn)DNA質(zhì)量和純度。

于春季F2群體中選擇綠色和淺綠色果皮單株各20株，提取基因組DNA，等量混合，建立綠色-淺綠色基因池；選擇單性花（AI值為1）和兩性花（AI值為3）各20株，提取基因組DNA等量混合，構(gòu)建單性花-兩性花基因池，將構(gòu)建的基因池及親本DNA樣品送至深圳華大基因科技有限公司測(cè)序。于Illumina HiSeq XTen測(cè)序平臺(tái)測(cè)序，作BSA-seq分析，親本及各基因池測(cè)序深度為20×，以97103 V2為參考基因組（http://cucurbitgenomics.org/organism/21）。

1.3.2 分子標(biāo)記開發(fā)

根據(jù)BSA-seq結(jié)果及親本重測(cè)序數(shù)據(jù)，抽取親本BSA-seq結(jié)果區(qū)間序列，查看區(qū)間內(nèi)InDel變異，選擇插入或缺失片段大于5 bp位點(diǎn)前后各500 bp序列，設(shè)計(jì)引物。對(duì)于定位區(qū)間內(nèi)的SNP位點(diǎn)，選擇位點(diǎn)上下游各500～700 bp序列，利用SNP2CAPS軟 件[19]及5種 限 制 性 內(nèi) 切 酶（TaqI、EcoR I、BamH I、MspI、XhoI）篩選位于酶切位點(diǎn)處SNP突變，將其轉(zhuǎn)化為CAPS標(biāo)記，采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，引物序列由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司合成。

1.3.3 F2代群體基因分型與分子標(biāo)記數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

利用親本ZXG1555和COS及其F1代篩選具有共顯性多態(tài)性分子標(biāo)記，果皮顏色性狀利用春季收獲F2代進(jìn)行基因分型；單性花性狀分別對(duì)春秋兩季F2代單株進(jìn)行基因分型。PCR體系為1 μL DNA，上下游引物各0.5 μL，dNTP 0.5 μL，10×PCR buffer（含Mg2+）1 μL，Taq酶0.1 μL。PCR程序使用降落式PCR擴(kuò)增，反應(yīng)程序參照Amanullah等[20]。InDel標(biāo)記PCR產(chǎn)物直接經(jīng)8%聚丙烯酰胺凝膠在220 V、400 mA下電泳1 h，銀染法顯影；CAPS標(biāo)記PCR產(chǎn)物使用相應(yīng)限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切反應(yīng)后（TaqI在65℃下酶切，其他限制性內(nèi)切酶均于37℃下反應(yīng)3～4 h），1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)。

分子標(biāo)記條帶統(tǒng)計(jì)，與父本COS相同條帶記為A，與母本ZXG1555相同條帶記為B，含有雙親條帶雜合類型單株記為H。使用Microsoft?Excel 2007統(tǒng)計(jì)帶型，在表現(xiàn)為隱性性狀單株中利用分子標(biāo)記檢測(cè)重組事件，縮短定位區(qū)間。

1.3.4 候選基因篩選

選擇親本COS及其他6份果皮綠色、單性花西瓜品種（W1-105、W1-92、W1-61、W1-17、W1-1、LSW-177）基因組測(cè)序數(shù)據(jù)與親本ZXG1555（淺綠色果皮、兩性花）基因組數(shù)據(jù)作對(duì)比，利用IGV（Integrative genomics viewer）軟件分析兩種性狀定位區(qū)間內(nèi)候選基因編碼區(qū)（Coding sequence）序列變異情況，候選基因序列和氨基酸變異使用DNAMAN 6.0（美國(guó)Lynno Biosoft）軟件作比對(duì)，篩選候選基因。

2 結(jié)果與分析

2.1 西瓜果皮顏色性狀遺傳分析

母本ZXG1555表現(xiàn)為淺綠色果皮，父本COS為綠色果皮，F(xiàn)1表現(xiàn)為綠色果皮，與父本一致，F(xiàn)2代群體中共產(chǎn)生綠色果皮和淺綠色果皮兩種表型（見圖1），其中綠色果皮為150株，淺綠色果皮37株，經(jīng)卡方檢驗(yàn)，符合3∶1遺傳分離比例（χ2=2.71，P=0.10），上述結(jié)果表明，淺綠色果皮性狀由單隱性基因調(diào)控。

圖1 親本P1、P2及F1、F2果皮性狀表型Fig.1 Peel trait of P1,P2,and F1,F2

2.2 西瓜單性花性狀遺傳分析

母本ZXG1555（P1）雌花為兩性花，父本COS（P2）雌花為單性花，F(xiàn)1表現(xiàn)為兩性花，與ZXG1555相同，說(shuō)明單性花為隱性性狀。F2代分離群體中包含單性花和兩性花，其中兩性花中雄蕊數(shù)量由1～5個(gè)不等（見圖2），計(jì)算每個(gè)單株AI值平均值作為表型數(shù)據(jù)，2021年春季調(diào)查獲得有效數(shù)據(jù)單株為187株（見圖3a），其中AI＞1.2（非單性花）植株數(shù)為129株，AI＜1.2（單性花）植株數(shù)為58株，通過(guò)卡方檢驗(yàn)，符合3∶1（χ2=3.6，P=0.057）；2021年秋季共獲得有效數(shù)據(jù)單株137株，其中AI＞1.2（非單性花）植株數(shù)為84株，AI＜1.2（單性花）植株數(shù)為53株（見圖3b），單性花比例升高。由此初步推斷，存在主效隱性基因調(diào)控西瓜單性花性狀，且環(huán)境因素影響單性花形成。

圖2 親本P1、P2及F1、F2雌花性狀表型Fig.2 Female flower trait of P1,P2,and F1,F2

圖3 F2雌花AI值頻率分布Fig.3 Frequency distribution of AI value of felame flower trait in F2

2.3 西瓜果皮關(guān)鍵基因定位與候選基因篩選

BSA-seq結(jié)果顯示，在9號(hào)染色體上獲得與果皮顏色連鎖的染色體區(qū)段，物理距離為9 231 575～14 532 222 bp（約5.3 Mb）。在區(qū)間內(nèi)設(shè)計(jì)40對(duì)In-Del引物，經(jīng)篩選獲得20對(duì)具有多態(tài)性分子標(biāo)記，選擇其中13個(gè)代表性分子標(biāo)記，從2021年春季收獲的187個(gè)F2代群體中對(duì)37株具有隱性性狀（淺綠色果皮）單株進(jìn)行基因分型，其中13個(gè)單株檢測(cè)到重組事件，區(qū)間縮至12 625 472～13 732 411 bp，區(qū)間長(zhǎng)度1.1 Mb（見圖4）。

圖4 西瓜果皮顏色基因定位結(jié)果Fig.4 Genetic mapping of rind color gene in watermelon

定位區(qū)間內(nèi)共包含37個(gè)候選基因，利用兩親本及其他6份果皮均為綠色西瓜材料基因組重測(cè)序數(shù)據(jù)，檢測(cè)37個(gè)候選基因中僅在淺綠色果皮ZXG1555中發(fā)生突變，利用DNAMAN軟件分析突變是否造成氨基酸序列改變。結(jié)果表明，37個(gè)候選基因中，22個(gè)基因在編碼區(qū)存在非同義突變（見表1）。通過(guò)葫蘆科數(shù)據(jù)庫(kù)及擬南芥官網(wǎng)（https://www.arabidopsis.org/）分析候選基因來(lái)源及代謝途徑。經(jīng)篩選初步推測(cè)Cla97C09G175170為淺綠色果皮性狀候選基因，Cla97C09G175170編碼Two-component response regulator-like protein APRR2，在西瓜及其他葫蘆科作物中，認(rèn)為APRR2基因與葉綠素代謝有關(guān)。本試驗(yàn)中，Cla97C09G175170編碼區(qū)在ZXG1555中存在三處非同義突變，第585個(gè)堿基由G突變?yōu)锳使第195位氨基酸由甲硫氨酸變?yōu)楫惲涟彼?；?95個(gè)堿基由A突變?yōu)镃使第199個(gè)氨基酸由甲硫氨酸變?yōu)榱涟彼?；?496位堿基由C突變?yōu)門，該處氨基酸由脯氨酸變?yōu)楫惲涟彼帷?/p>

表1 西瓜果皮顏色區(qū)間內(nèi)候選基因Table 1 Candidate genes of watermelon rind color

2.4 西瓜單性花關(guān)鍵基因定位與候選基因篩選

利用BSA-seq將控制西瓜單性花基因定位于3號(hào)染色體，物理位置為28 443 661～29 576 359 bp（約1.1 Mb），另向外擴(kuò)充開發(fā)分子標(biāo)記，區(qū)域長(zhǎng)度共為2.51 Mb。在區(qū)間內(nèi)設(shè)計(jì)10對(duì)InDel引物和24對(duì)CAPS引物，經(jīng)多態(tài)性檢測(cè)分別有3對(duì)和10對(duì)具有多態(tài)性。選擇其中11個(gè)標(biāo)記作基因分型。2021年春季187個(gè)植株中存在53個(gè)隱性單株，其中14株發(fā)生重組；秋季137個(gè)植株中存在51個(gè)隱性單株，其中9株發(fā)生重組，兩季F2隱性單株定位分析均將區(qū)間縮至同一位置29 252 650～30 021 268 bp處，物理距離約為0.7 Mb（見圖5）。

圖5 西瓜單性花基因定位結(jié)果Fig.5 Genetic mapping of unisexual flower gene in watermelon

定位區(qū)間內(nèi)共包括74個(gè)候選基因，利用本試驗(yàn)親本和其他6種單性花西瓜材料重測(cè)序數(shù)據(jù)，與西瓜參考基因組（97103 V2）作比對(duì)，檢測(cè)候選基因中僅存在ZXG1555突變，其中27個(gè)基因在編碼區(qū)顯示非同義突變（見表2）。使用葫蘆科數(shù)據(jù)庫(kù)和擬南芥官網(wǎng)查詢候選基因相關(guān)信息，以擬南芥同源基因作為參考，在定位區(qū)間內(nèi)存在基因Cla97C03G066110在西瓜基因組中功能注釋為1-aminocyclopropane-1-carboxylate synthase 7，認(rèn)為該基因參與植物體乙烯生物合成，在葫蘆科作物性別分化過(guò)程中，乙烯發(fā)揮重要作用，故初步推測(cè)Cla97C03G066110可能為西瓜單性花性狀候選基因。在Cla97C03G066110編碼區(qū)內(nèi)，ZXG1555發(fā)生兩處非同義突變，第792位堿基由G突變?yōu)镃，該處氨基酸由天冬氨酸變?yōu)橘嚢彼?；? 185位堿基由C突變?yōu)镚，氨基酸由亮氨酸變?yōu)楸奖彼帷?/p>

表2 西瓜單性花區(qū)間內(nèi)候選基因Table 2 Candidate genes of unisexual flower trait of watermelon

續(xù)表

3 討論

3.1 西瓜淺綠色果皮定位及候選基因分析

西瓜果皮顏色是重要商品性狀，對(duì)消費(fèi)者選擇具有直接影響，外皮分為果皮底色和條紋顏色。果皮底色包括深綠、綠色、淺綠、黃色等不同顏色，主要由內(nèi)源色素比例決定，如葉綠素和類黃酮[21]。Park等研究西瓜果皮顏色深度，構(gòu)建遺傳連鎖圖譜，在8號(hào)染色體上發(fā)現(xiàn)一個(gè)與深綠色果皮連鎖標(biāo)記chr8_26061[9]。Kumar和Wehner認(rèn)為淺綠色果皮受g-1和g-2共同調(diào)控，當(dāng)兩基因均為隱性時(shí)，果皮呈淺綠色，當(dāng)其中任意一個(gè)以顯性形式（G-1或G-2）單獨(dú)存在或同時(shí)存在，則形成深綠色果皮[22]。Li等研究深綠、淺綠色果皮時(shí)，發(fā)現(xiàn)果皮顏色由8號(hào)染色體上ClCG08G017810控制，該基因編碼Ubiquinone/menaquinone biosynthesis methyltransferase UbiE，編碼區(qū)存在的非同義突變使氨基酸由精氨酸變?yōu)楦拾彼幔瑢?dǎo)致西瓜果皮顏色存在差異[23]。與果皮顏色基因多被定位到8號(hào)染色體，本研究則將控制西瓜淺綠色果皮的基因定位于9號(hào)染色體，前人研究中以深綠和淺綠果皮為親本，本研究以綠色和淺綠色為親本，具有不同遺傳背景，說(shuō)明存在多個(gè)基因影響西瓜果皮顏色形成。分析定位區(qū)間內(nèi)22個(gè)候選基因，推測(cè)Cla97C09G175170（APRR2）為調(diào)控西瓜淺綠色果皮候選基因。Oren等研究西瓜和甜瓜果皮發(fā)現(xiàn)，APRR2可能是致使兩種作物中綠色和淺綠色外皮產(chǎn)生差異的關(guān)鍵基因[24]。故本研究初步推測(cè)Cla97C09G175170可能為控制淺綠色果皮性狀候選基因。

3.2 西瓜單性花定位及候選基因分析

在常規(guī)育種中，單性花品種自然授粉結(jié)實(shí)率低，需人工授粉，兩性花使自然授粉更容易，果實(shí)通常比單性花更圓[25]。葫蘆科作物性別分化與乙烯高度相關(guān)，甜瓜、黃瓜和西葫蘆中3個(gè)乙烯生物合成同源基因CmACS7[26]、CsACS2[27]和CpACS27A[18]發(fā)生突變使雌花在發(fā)育過(guò)程中產(chǎn)生雄蕊，生成兩性花。使用乙烯利和硝酸銀處理2葉1心西瓜，待植株長(zhǎng)至4葉期，作qPCR分析，所有處理CitACS4表達(dá)水平均顯著降低。噴灑乙烯利時(shí)產(chǎn)生兩性花，是因外源噴施乙烯抑制內(nèi)部乙烯形成，從而抑制子房發(fā)育；噴灑乙烯抑制劑硝酸銀導(dǎo)致內(nèi)部乙烯合成量減少，使西瓜僅誘導(dǎo)兩性花[28]。李鳳梅等開發(fā)CitACS4在甜瓜中同源基因CmACS7的CAPS分子標(biāo)記，可用于對(duì)甜瓜單性花材料分子鑒定及輔助育種[29]。Manzano等研究西瓜CitACS4基因發(fā)現(xiàn)，該基因編碼參與乙烯生物合成的花特異性ACS酶，基因編碼區(qū)出現(xiàn)一個(gè)非同義突變，導(dǎo)致CitACS4蛋白364位氨基酸由半胱氨酸變?yōu)樯彼?，花芽中乙烯合成減少，雌花向兩性花轉(zhuǎn)變[6]。本試驗(yàn)初步推測(cè)3號(hào)染色體上Cla97C03G066110（CitACS4）為西瓜單性花形成候選基因。本研究中，CitACS4在ZXG1555發(fā)生兩處非同義突變，使第264位氨基酸由天冬氨酸變?yōu)橘嚢彼?，?95位氨基酸由亮氨酸變?yōu)楸奖彼?，可能?dǎo)致雌花生長(zhǎng)過(guò)程中部分功能喪失，乙烯合成減少，單性花轉(zhuǎn)變?yōu)閮尚曰?。除受遺傳因素影響外，光照強(qiáng)度、光周期和溫度等環(huán)境因素也影響西瓜性別表達(dá)，本試驗(yàn)調(diào)查兩季表型數(shù)據(jù)有差異，秋季單性花比例增加可能是受環(huán)境影響，秋季光照弱，太陽(yáng)高度角低，溫度光照分布不均勻，而短日、低光照強(qiáng)度和夜間溫度低均促進(jìn)雌花發(fā)育，從而產(chǎn)生更多單性花[30]。

4 結(jié)論

本研究中，西瓜淺綠色果皮及單性花性狀均受隱性單基因控制，試驗(yàn)初步定位控制兩個(gè)性狀基因，通過(guò)序列比對(duì)和基因功能注釋推測(cè)Cla97C09G175170和Cla97C03G066110可能是影響兩個(gè)性狀形成的候選基因，研究結(jié)果為今后兩個(gè)性狀目標(biāo)基因精細(xì)定位、基因克隆及功能分析研究工作提供理論基礎(chǔ)。