李哲明，謝集照，羅 迪，武鑫鐸，何詩能，邱 莉

（廣西醫(yī)科大學藥學院，廣西南寧 530021）

青天葵為蘭科植物毛唇芋蘭Nervilia fordii（Hance） Schltr.的塊莖和全草，別名獨葉蓮、珍珠草、獨腳蓮、珍珠葉等，主要分布于廣東、廣西、云南、四川等地[1-2]。在東南亞地區(qū)和我國兩廣地區(qū)，青天葵全草為民間習用的涼茶藥材之一，也常與瘦肉燉湯食用，是嶺南地區(qū)常用的具有清熱潤肺止咳、解毒散瘀止痛的藥食兩用的藥材[3-4]。目前，研究者已從青天葵全草中分離得到黃酮[5-6]、萜類[7]、氨基酸和揮發(fā)油等一些小分子化合物。相關藥理學研究證實這些化合物具有抗炎、抗腫瘤、抗病毒等活性[8]。

多糖又稱為多聚糖，由多個單糖或單糖衍生物經過聚合生成的聚合度大于10的大分子化合物，主要分為植物多糖、動物多糖及微生物多糖[9]。植物多糖由于在增強免疫調節(jié)、抗腫瘤、抗氧化、降血糖、降血脂、抗病毒、抗炎作用等方面具有良好的應用前景及來源廣與無毒副作用的特性，越來越引起國內外研究者們的興趣[10]。多糖的藥理活性與多糖的一級結構如分子量、單糖組成、取代基種類和數(shù)目、支化度等有關，還與多糖的空間高級結構以及多糖的溶解度等多種因素有關。當多糖任一構成因素發(fā)生變化時，其藥理活性可能會相應改變。

本課題組在前期研究中，采用水提醇沉法獲得青天葵多糖，通過DEAE-52和葡聚糖凝膠G-100層析柱分離純化了7個多糖組份。截至目前，本課題組已經報道了兩個青天葵均一多糖（NFP-A4和NFP-1）的理化性質、結構表征及其免疫調節(jié)活性[11-12]。研究結果表明，這兩個均一多糖無論分子量、單糖組成、取代基種類，還是藥理活性都存在較大差異，體現(xiàn)了青天葵多糖化學結構和藥理活性的多樣性。因此，本文繼續(xù)研究第三個多糖組分NFP-2的理化性質和結構表征，以及測定NFP-2對DPPH、羥基、ABTS陽離子、超氧陰離子等自由基的清除能力，為豐富青天葵多糖結構和活性探討提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

青天葵全草 廣西一心醫(yī)藥有限公司（產地為廣西）；單糖標品（氨基葡萄糖、氨基半乳糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、鼠李糖、巖藻糖、木糖、阿拉伯糖） 美國Sigma公司；DEAE-52纖維素 上海恒信化學試劑有限公司；Sephadex G-100葡聚糖凝膠 Pharmacia Biotech公司；透析袋（分子截留量3500 Da） 美國Viskase公司；其余試劑 均為國產分析純。

LC-20A高效液相色譜儀、mini-1240紫外可見光分光光度計 日本島津公司；PerkinElmer One FT-IR傅里葉變換紅外光譜儀 美國PerkinElmer公司；FD-1A-50型冷凍干燥器 北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；TDL-4型低速臺式離心機 上海安亭科學儀器廠；SpectraMaxPlus384型連續(xù)光譜掃描式酶標儀 美國Molecular Devices公司；CQ 50型超聲波水浴 上海超聲波儀器廠；R-1001N型旋轉蒸發(fā)儀 鄭州長城科工貿有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 青天葵總多糖樣品的制備 取青天葵干燥全草，粉碎，過24目篩，得到粗粉。取800 g青天葵粉末，用10倍量蒸餾水加熱回流提取2次，每次2 h，過濾，濾液用旋轉蒸發(fā)儀50 ℃減壓濃縮。用無水乙醇調節(jié)濃縮液至含乙醇量至80%，4 ℃冰箱靜置24 h，離心，丟棄上清液，取沉淀；沉淀溶于適量去離子水中，Sevag 法 [氯仿:正丁醇=5:1（v/v）]除去游離蛋白，離心，取上清液，重復5次，冷凍干燥得到青天葵總多糖[13]。

1.2.2 青天葵總多糖的分離純化 取青天葵總多糖20 g，加50 mL 60 ℃蒸餾水溶解后，然后在3500 r/min離心10 min，取上清液，緩慢滴加到活化且平衡后的DEAE-52層析柱上（φ3.6×45 cm），以蒸餾水、0.2、0.4、0.6、0.8和 1.2 mol/L NaCl溶液進行梯度洗脫。每梯度洗脫液的洗脫體積約為1000 mL，每管收集20 mL，隔管檢測490 nm（苯酚-硫酸顯色后）下的吸光度，繪制洗脫曲線。通過洗脫曲線選取最佳洗脫峰，收集洗脫峰處的洗脫液，濃縮，透析，冷凍干燥得到 7 個組分（DT-1～DT-7）。

取組分DT-2（0.9 g），加5 mL 60 ℃蒸餾水溶解后，3500 r/min離心 10 min，取上清液，滴加到Sephadex G-100葡聚糖凝膠色譜柱上（φ1.2×25 cm），100 mL洗脫，2 mL/管收集流份。隔管檢測490 nm（苯酚-硫酸顯色后）下的吸光度值，繪制洗脫曲線，收集峰尖部分溶液，濃縮，透析，冷凍干燥得到樣品（NFP-2）待分析。

1.2.3 青天葵多糖NFP-2的基本理化性質測定

1.2.3.1 NFP-2總糖含量測定 采用苯酚-硫酸法[14]，分別吸取0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 100 μg/mL的葡萄糖對照品溶液于10 mL具塞試管中，補加蒸餾水至1.0 mL，各加入1.0 mL的5%苯酚溶液，渦旋混勻，立即加入5 mL的濃硫酸，反應20 min后，在490 nm處測定吸光度值。以葡萄糖含量（mg）為橫坐標，吸光度值為縱坐標繪制標準曲線。取1.0 mL多糖溶液（1 mg/mL），按上述方法測定吸光度值，根據(jù)標準曲線計算總糖含量。

1.2.3.2 NFP-2蛋白含量測定 采用Lowry法[15]，分別吸取 0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 100 μg/mL的牛血清蛋白（BSA）對照品溶液于10 mL具塞試管中，補加蒸餾水至1.0 mL，各加入5 mL堿式碳酸銅溶液，混合均勻，置于室溫反應10 min后，加入0.5 mL福林酚試劑并放置30 min，顯色后在650 nm處測定吸光度值。以BSA含量（mg）為橫坐標，吸光度值為縱坐標繪制標準曲線。取1.0 mL多糖溶液（1 mg/mL），按上述方法測定吸光度值，根據(jù)標準曲線計算蛋白含量。

1.2.3.3 NFP-2糖醛酸含量測定 采用硫酸-咔唑法[16]，分別吸取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 100 μg/mL的半乳糖醛酸對照品溶液于10 mL具塞試管中，補加蒸餾水至1.0 mL，冰浴條件下各加入四硼酸鈉-硫酸溶液5 mL，渦旋混勻，置于恒溫水浴鍋中加熱煮沸20 min，取出后立即冰水冷卻至室溫，加入0.15%咔唑溶液，塞上塞子后，渦旋混勻，室溫下保持2 h后于523 nm下測定吸光度。以半乳糖醛酸含量（mg）為橫坐標，吸光度值為縱坐標繪制標準曲線。取1.0 mL多糖溶液（1 mg/mL），按上述方法測定吸光度值，根據(jù)標準曲線計算糖醛酸含量。

1.2.4 NFP-2分子質量測定 根據(jù)文獻[17]，利用高效凝膠滲透色譜（high performance gel permeation chromatograph，HPGPC）測量均一多糖的分子質量。色譜條件如下：TSKgel G4000PWxl凝膠柱（7.8×300 mm，10 μm）；流動相 1 mL/min 三蒸水；柱溫40 ℃；進樣量10 μL；示差折光檢測器。分別取10 μL 10 mg/mL系列Dextran標準葡聚糖溶液（分子質量分別為70、150、270、410、500、1100、2000 kDa）注入高效液相色譜儀，繪制其分子量對數(shù)值與保留時間（tR）的關系曲線。將等量多糖樣品溶液在上述色譜條件下進樣，根據(jù)其保留時間和關系曲線計算多糖分子質量。

1.2.5 NFP-2單糖組成比例 稱取多糖樣品5 mg，加入10 mL 2 mol/L三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）溶液，油浴110 ℃反應4 h。反應結束后，冷卻至室溫，加入2 mL甲醇減壓蒸干，重復操作3次，以完全除去TFA。加入蒸餾水溶解樣品，取100 μL樣品溶液，置于1.5 mL的離心管中，然后參照文獻[17]方法進行 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮進行衍生。反應結束后，上清液用0.22 μm微孔濾膜過濾，備高效液相色譜分析用。色譜條件如下：Inertsil ODS C-18柱（4.6 ×250 mm，5 μm）；流動相為 1.0 mL/min乙腈/磷酸鹽緩沖液（18:82，v/v）；檢測波長 245 nm；柱溫35 ℃；進樣量10.0 μL。分別配制單糖（氨基葡萄糖、氨基半乳糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、鼠李糖、巖藻糖、木糖、阿拉伯糖）標準溶液1 mg/mL，依照上述色譜方法分析，通過標準品的保留時間和峰面積，可以確定多糖樣品中的單糖組成和計算摩爾百分比[17]。

1.2.6 紅外光譜分析 稱取干燥的多糖樣品1～2 mg與200 mg溴化鉀研磨，壓制成透明的圓形薄片，在4000～400 cm-1范圍內進行紅外光譜掃描。

1.2.7 剛果紅實驗 取6份2 mg/mL的多糖溶液1.0 mL，分別加入3.0 mL 不同濃度（0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、0.8 mol/L）的NaOH溶液，然后再加入0.5 mL蒸餾水和1.5 mL 0.2 mmol/L剛果紅溶液，渦旋混勻，靜置1 h，設定200～800 nm掃描范圍，記錄各濃度NaOH溶液的最大吸收波長（λmax），空白對照組以蒸餾水替代多糖溶液[18]。

1.2.8 青天葵多糖的抗氧化活性

1.2.8.1 ABTS陽離子自由基清除率的測定 參照文獻[19]方法測定。首先，將ABTS粉末溶于2.45 mmol/L過硫酸鉀溶液中生成 ABTS原液（7 mmol/L），然后在室溫下于避光靜置12 h后，用乙醇稀釋至0.2 mmol/L。取96孔板，相應孔中加入180 μL ABTS溶液（0.2 mmol/L）與 20 μL 不同濃度的多糖溶液混合（0、0.2、0.5、1、2、4、8、10 mg/mL），混勻，室溫下避光反應30 min。以維生素C為陽性對照，在734 nm處測定吸光度。

式中：A0為實驗組吸光值；As用去離子水代替試劑做樣品的本底比色吸光值；Ac為空白對照（以去離子水代替多糖溶液）。

1.2.8.2 羥基自由基清除率的測定 參照邵佳等[20]的方法測定。取96孔板，相應孔中分別加入50 μL的不同濃度的青天葵多糖溶液（0、1、2、4、6、8、10 mg/mL），然后依次加4 mmol/L硫酸亞鐵溶液50 μL 及 4 mmol/L 過氧化氫溶液 50 μL，混勻，室溫反應10 min，然后加入4 mmol/L水楊酸溶液50 μL，混勻，室溫反應30 min，于510 nm處分別測定各孔吸光度，記錄數(shù)據(jù)，實驗重復3次，以抗壞血酸為陽性對照。計算多糖對羥基自由基的清除率，即公式為：

式中：A0為實驗組吸光值；As用去離子水代替試劑做樣品的本底比色吸光值；Ac為空白對照（以去離子水代替多糖溶液）。

1.2.8.3 DPPH自由基清除率的測定

參照文獻[21]方法測定。取96孔板，相應孔中分別加入50 μL不同濃度的青天葵多糖溶液（0、0.5、1、2、4、8、10 mg/mL），再加入 100 μL 0.2 mmol/L DPPH無水乙醇溶液，混勻，室溫避光反應30 min，在517 nm下測定吸光度，測量3次?？瞻捉M以無水乙醇代替DPPH溶液。按下列公式計算DPPH自由基清除率，按公式（1）計算：

式中：A0為實驗組吸光值；As用去離子水代替試劑做樣品的本底比色吸光值；Ac為空白對照（以去離子水代替多糖溶液）。

1.2.8.4 超氧陰離子自由基清除率的測定 采用鄰苯三酚自氧化法[22]測定。取96孔板，相應孔中加入 150 μL Tris-HCl緩沖溶液（50 mmol/L，pH8.2），再分別加入30 μL不同濃度的青天葵多糖（0、0.02、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00 mg/mL），混勻，室溫避光反應10 min，然后加入30 μL的沒食子酸溶液（6 mmol/L），混勻，室溫避光反應 3 min，最后加30 μL 8 mol/L鹽酸終止反應。在325 nm處測定吸光度?？瞻捉M以用30 μL蒸餾水取代沒食子酸溶液，其他步驟如上操作，測吸光度，計算樣品對超氧陰離子自由基的清除率。

式中：A0為實驗組吸光值；As用去離子水代替試劑做樣品的本底比色吸光值；Ac為空白對照（以去離子水代替多糖溶液）。

2 結果與分析

2.1 青天葵多糖組分NFP-2的純化

青天葵總多糖過DEAE-52纖維素層析柱，經蒸餾水、NaCl溶液梯度洗脫，洗脫曲線如圖1所示，按照洗脫峰收集組分，共收集7個流份（DT-1～DT-7），分別減壓濃縮、透析、凍干后進一步純化。

圖1 青天葵多糖DT-2的DEAE-52纖維素柱層析圖Fig.1 Elution curve of DT-2 from DEAE-cellulose 52 anion exchange chromatogram

將離子交換層析分離得到的DT-2溶于水進一步分離純化，上樣于Sephadex G-100凝膠柱，洗脫曲線如圖2所示。收集峰尖部分，透析，濃縮，凍干后得到組分NFP-2進行下一步分析。

圖2 青天葵多糖NFP-2的Sephadex G-100柱層析結果Fig.2 Elution curve of NFP-2 from Sephadex G-100 gel filtration chromatogram

2.2 青天葵多糖NFP-2的基本理化特性

多糖NFP-2易溶于熱水，不溶于乙醇、丙酮等有機試劑，經過測定其總糖含量為82.64%，糖醛酸含量為16.65%，蛋白質含量為6.38%。

2.3 青天葵多糖NFP-2的分子量及單糖組成

HPGPC測定結果如圖3所示，色譜圖出現(xiàn)一個單峰，確認NFP-2為單一組分，純度為92.12%。根據(jù)多糖NFP-2的色譜保留時間帶入標準多糖分子量回歸曲線（lgMw=-0.3395Rt+8.4278，R2=0.9661），推算得到NFP-2的分子量為1150 kDa；經酸水解、高效液相色譜分析其單糖組成，結果如圖4所示，主要由半乳糖、阿拉伯糖、果糖、葡萄糖、鼠李糖、半乳糖醛酸，其摩爾比為21.27:13.21:5.26:3.02:2.82:1，并含有少量的木糖、葡萄糖醛酸。

圖3 青天葵多糖NFP-2的HPGPC色譜圖Fig.3 HPGPC chromatogram of NFP-2

圖4 基于PMP柱前衍生的青天葵多糖NFP-2（A）和標準品（B）的單糖液相色譜圖Fig.4 HPLC chromatograms of the PMP derivatives of NFP-2 hydrolysate sample （A） and standard monosaccharide mixture （B）

2.4 紅外光譜分析

NFP-2的紅外光譜圖如圖5所示，3401 cm-1處附近出現(xiàn)的強且寬的吸收峰歸屬于-OH的伸縮振動峰，是糖類的特征吸收峰，說明青天葵多糖NFP-2具有分子間氫鍵[23]。2931 cm-1處則發(fā)現(xiàn)甲基-CH3或次甲基-CH2的C-H的伸縮振動峰，是典型的多糖特征[24]，1400～1200 cm-1處出現(xiàn)C-H伸縮和變角振動峰，可初步判定為糖類化合物[25]。在1618 cm-1的-NH2和-NH3的特征吸收峰，說明存在蛋白多糖峰[26]，與蛋白質含量測定一致。1072 cm-1的吸收峰顯示多糖糖環(huán)構型為吡喃型[27]。894 cm-1處的弱峰為吡喃環(huán)的β-端差向異構的C-H變角振動產生的[28]。由此推測多糖NFP-2為β-吡喃型多糖[29]。

圖5 青天葵多糖NFP-2的紅外光譜圖Fig.5 FT-IR spectrum of NFP-2

2.5 剛果紅實驗結果分析

剛果紅實驗是研究多糖分子構象特性一種有效地方法。剛果紅可以與具有螺旋構象的多糖分子發(fā)生絡合反應，產生的絡合物的最大吸收波長與純剛果紅相比會發(fā)生紅移[30]。從圖6可知，與純剛果紅溶液的λmax相比，剛果紅-NFP-2多糖復合物的λmax發(fā)生紅移。當添加不同濃度的NaOH溶液時，多糖的螺旋結構經過不同程度的展開，使復合物的λmax值減小，當NaOH濃度為 0～0.4 mol/L時，復合物的λmax值發(fā)生變化。與純剛果紅溶液相比，NFP-2在各濃度的NaOH溶液中均無明顯紅移。因此，可以推斷NFP-2在水溶液中缺乏三股螺旋構象。剛果紅分析法只是確定多糖構象結構的初步方法，還需要其他方法來確定多糖的確切結構。

圖6 青天葵多糖NFP-2與剛果紅復合物在不同濃度NaOH溶液中的λmax變化Fig.6 Changes in the absorption maximum λmax of NFP-2 vatious concentrations of sodilum hydrolysis complexed with Congo red

2.6 青天葵多糖NFP-2抗氧化活性分析

大量醫(yī)學研究結果表明動脈粥樣硬化、癌癥、神經性疾病等多種疾病都與氧化脅迫有關。當機體內正常代謝產生的活性氧、活性氮超出人體自身抗氧化保護系統(tǒng)的范圍就會對機體造成傷害。許多外源性物質如抗壞血酸、維生素E以及各種多酚物質可以抵抗活性氧造成的危害[31]。各種食品、天然動植物中富含這些物質，是保護人體健康的重要來源。因此抗氧化能力是評價食品、藥品功效的一個重要指標。

目前使用的抗氧化測定方法非常多，以清除自由基測定抗氧化能力的方法是目前最流行、使用最多的方法。根據(jù)自由基的種類不同可以分為兩大類：生物體中存在的自由基：超氧自由基、過氧化氫、羥自由基等；人工合成的自由基。目前最常用的自由基清除測定方法有ABTS法、羥自由基清除能力、DPPH法和超氧自由基清除能力法。研究表明多糖產生抗氧化性的機制之一是多糖可以直接與自由基發(fā)生反應，從而達到抗氧化作用[30]。為了研究多糖NFP-2的抗氧化能力，本文選擇DPPH自由基、ABTS陽離子自由基、羥基自由基和超氧陰離子自由基測定NFP-2的清除自由基的能力。

從圖7A～圖7B中可知，NFP-2具有清除ABTS陽離子自由基、羥基自由基的活性，并且清除能力在0.1～10 mg/mL濃度范圍內呈現(xiàn)劑量依賴效應，隨著濃度增大而增強。在0.1～10 mg/mL內，NFP-2對ABTS陽離子自由基的清除率從9.43%增強到35.44%；對羥基自由基的清除率從10.09%增強到57.55%，其IC50為7.95 mg/mL。從圖7C～圖7D可知，NFP-2對DPPH自由基、超氧陰離子自由基的清除能力在設定濃度范圍內無明顯的劑量依賴效應。在質量濃度20～120 μg/mL內，NFP-2對DPPH自由基的清除能力較弱，始終維持在15%～17%；在質量濃度0.5～20 μg/mL 內，NFP-2 對超氧陰離子自由基的清除能力較強，始終維持在60%左右。

圖7 青天葵多糖NFP-2抗氧化活性Fig.7 Antioxidant activities of NFP-2

盡管多糖的自由基清除活性機制尚不完全明確，但相關研究表明，酸性多糖更易成為清除自由基的供氫劑，從而表現(xiàn)出更高的抗氧化活性[32]。由于NFP-2的糖醛酸含量較高，暴露的羧基參與了多糖與自由基的反應，從而使NFP-2對羥基自由基和超氧陰離子自由基的清除能力均達到50%以上。另外，在 5～20 μg/mL 濃度范圍內，NFP-2 的超氧陰離子自由基清除能力不存在濃度依賴性，表明NFP-2多糖的抗氧化活性并不是只受到單一因素影響，可能受到分子量、單糖組成、糖醛酸、取代基和鏈構象等多種因素的影響。

3 結論

綜上所述，從青天葵藥材中分離純化得到一個分子量為1150 kDa的水溶性多糖組分NFP-2。NFP-2主要由半乳糖、阿拉伯糖、果糖、葡萄糖、鼠李糖、半乳糖醛酸等單糖組成。結構分析表明多糖的糖苷鍵為β-吡喃型，無三股螺旋結構?？寡趸栽u價表明NFP-2具有一定的自由基清除能力。這些結果將有助于青天葵多糖的進一步研究。