岳杰 楊麒麟 孫翔宇 孫譽(yù)銘 麻響 陳東 靜廣平

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

人口腔鱗狀細(xì)胞癌CAL-27細(xì)胞購(gòu)自武漢普諾賽(Procell)生命科技有限公司；DMEM高糖培養(yǎng)基購(gòu)自Hyclone公司；0.25%胰酶EDTA購(gòu)自碧云天公司；胎牛血清購(gòu)自Gibco公司；茜素紅染液購(gòu)自Cyage公司；STRO-1抗體購(gòu)自Sigma公司；超速離心機(jī)購(gòu)自Beckman公司；熒光相差顯微鏡及圖像采集系統(tǒng)購(gòu)自O(shè)lympus公司。

1.2 hDPSCs的分離培養(yǎng)與鑒定

經(jīng)患者及家屬知情同意后，收集16～28歲患者因阻生或正畸拔除的完整恒牙。采用組織塊貼壁法培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到80%～90%融合時(shí)，按1∶3進(jìn)行傳代。取第3～5代細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。礦化誘導(dǎo)21 d后進(jìn)行茜素紅染色；hDPSCs固定后，用基質(zhì)細(xì)胞抗原STRO-1一抗稀釋液(1∶200)4℃搖床孵育過夜，洗去一抗，二抗稀釋液(1∶500)孵育30 min，在熒光顯微鏡下觀察。

1.3 hDPSCs-exo的分離與鑒定

收集饑餓48 h后的hDPSCs上清液，超速離心法進(jìn)行離心：300 ×g，10 min，收上清；3 000 ×g，30 min，收上清；10 000 ×g，60 min，收上清；0.22 μm無(wú)菌濾器過濾后加入超高速離心管中，120 000 ×g，70 min，棄上清，無(wú)菌PBS溶解沉淀，以上操作均在4℃進(jìn)行，-80℃保存?zhèn)溆茫?1)透射電鏡(TEM)觀察外泌體形態(tài)；(2)Nanosight NS300(NTA)分析外泌體的粒徑；(3)Western blot檢測(cè)外泌體蛋白標(biāo)志物。

1.4 hDPSCs-exo對(duì)CAL-27細(xì)胞增殖能力的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CAL-27細(xì)胞以5×103個(gè)/孔的密度接種于96孔板，細(xì)胞貼壁后，分別加入hDPSCs-exo(0、20、40、60、80 μg/mL)，每組5個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)1、3、5 d后，每孔加入20 μL MTT溶液，避光孵育4 h后棄培養(yǎng)液，加入二甲基亞砜微震蕩10 min，酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm處各孔吸光度值。

1.5 劃痕實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CAL-27細(xì)胞以1×105個(gè)/孔的密度接種于6孔板，待細(xì)胞鋪滿后進(jìn)行劃痕，PBS沖洗2～3次。依分組(同上)加入相對(duì)應(yīng)的無(wú)血清培養(yǎng)基，于0、24、48 h在顯微鏡下觀察細(xì)胞遷移距離并拍照。

1.6 Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CAL-27細(xì)胞以1×105個(gè)/孔的密度接種于小室內(nèi)，下室依分組(同上)加入500 μL相應(yīng)的培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后，4%多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色30 min，顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野拍照并統(tǒng)計(jì)。

1.7 Western blot檢測(cè)PI3K、P-Akt和Akt的表達(dá)

經(jīng)hDPSCs-exo(0、20、60、80 μg/mL)處理的CAL-27細(xì)胞，48 h后RIPA裂解液提取蛋白，BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，調(diào)整蛋白上樣量。將封閉后的PVDF膜分別與PI3K、P-Akt、Akt、GAPDH(均1∶1 000)的一抗于4℃搖床孵育過夜，二抗(1∶5 000)室溫孵育1 h后進(jìn)行成像、分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 8軟件進(jìn)行方差分析。所有實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)至少三次，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素和多因素方差分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 hDPSCs分離培養(yǎng)與鑒定

采用組織塊貼壁法培養(yǎng)牙髓組織，7～10 d可觀察到細(xì)胞從組織周圍爬出呈典型的長(zhǎng)梭形，約2～3周細(xì)胞發(fā)生融合。礦化誘導(dǎo)21 d后，茜素紅染色鏡下可見紅色的礦化結(jié)節(jié)。熒光顯微鏡下STRO-1呈陽(yáng)性表達(dá)(圖1)。

圖1 hDPSCs的原代分離培養(yǎng)與鑒定

2.2 hDPSCs-exo的鑒定

TEM觀察hDPSCs-exo呈典型的杯托狀、囊泡狀結(jié)構(gòu)，Western blot顯示外泌體特征性蛋白標(biāo)志物CD9、HSP70、TSG101表達(dá)均呈陽(yáng)性，NTA顯示粒徑集中分布在149.5 nm左右(圖2)。

圖2 hDPSCs-exo的鑒定

2.3 hDPSCs-exo對(duì)CAL-27細(xì)胞增殖能力的影響

MTT結(jié)果顯示，與0 μg/mL組相比，僅80 μg/mL 組在第5 d對(duì)CAL-27細(xì)胞的增殖有抑制作用(P=0.002)，其余各濃度組對(duì)CAL-27的增殖均沒有顯著影響(P>0.05)(圖3)。

圖3 不同濃度的hDPSCs-exo對(duì)CAL-27細(xì)胞增殖能力的影響

2.4 hDPSCs-exo對(duì)CAL-27遷移能力的影響

2.4.1 劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果 與0 μg/mL組相比，48 h時(shí)，劃痕面積明顯減小且部分區(qū)域已有融合，20、60、80 μg/mL組均能促進(jìn)CAL-27的遷移能力(20、60、80 μg/mL組vs.0 μg/mL組：P=0.019、0.030、0.011)，而40 μg/mL組對(duì)CAL-27的遷移能力無(wú)顯著促進(jìn)作用(P>0.05)(圖4)。

2.4.2 Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果 與0 μg/mL組相比，20、60、80 μg/mL組能顯著促進(jìn)CAL-27的遷移(20、60、80 μg/mL組vs.0 μg/mL組：P<0.001)，40 μg/mL組對(duì)CAL-27的遷移無(wú)顯著促進(jìn)作用(P>0.05)(圖5)。

圖5 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)hDPSCs-exo對(duì)CAL-27細(xì)胞遷移能力的影響

2.5 Western blot檢測(cè)PI3K、P-Akt和Akt的表達(dá)

處理48 h后，與0 μg/mL組相比，80 μg/mL組PI3K的表達(dá)量升高(80 μg/mL組vs.0 μg/mL組：P=0.019)，60、80 μg/mL組P-Akt表達(dá)上調(diào)(60 μg/mL、80 μg/mL 組vs.0 μg/mL組：P=0.001、0.002)，而Akt蛋白表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(圖6)。

圖6 Western Blot檢測(cè)PI3K、P-Akt和Akt的表達(dá)

3 討論

腫瘤微環(huán)境(Tumor microenvironment，TME)是指腫瘤產(chǎn)生和生存的環(huán)境，除了腫瘤細(xì)胞外，還包括炎癥細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、免疫細(xì)胞以及細(xì)胞外基質(zhì)成分等，其產(chǎn)生的細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞因子能支持腫瘤細(xì)胞增殖、血管生成、逃避免疫以及促進(jìn)侵襲和轉(zhuǎn)移等[12]。TME是致癌的關(guān)鍵因素之一，組分的改變能影響腫瘤的生物學(xué)行為。Salo等[13]發(fā)現(xiàn)BM-MSCs通過影響TME來誘導(dǎo)與趨化因子、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和侵襲相關(guān)基因的表達(dá)從而達(dá)到降低口腔鱗狀細(xì)胞癌的增殖，同時(shí)增強(qiáng)侵襲能力。外泌體作為TME的重要組成部分同樣能調(diào)控腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為。研究表明，間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖、遷移具有雙向作用。Wang等[14-15]研究發(fā)現(xiàn)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體能促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖和遷移，抑制細(xì)胞凋亡。Gu等[16]研究表明間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體通過激活A(yù)kt通路從而促進(jìn)胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移。相反地，也有研究表明外泌體對(duì)腫瘤的生物學(xué)行為具有抑制作用。血源性間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體能抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌的血管生成和腫瘤增殖的作用[17]。

近年來，外泌體作為一種細(xì)胞間通訊方式逐漸成為研究熱點(diǎn)。已有大量研究表明外泌體有可能成為口腔癌早期診斷、治療靶點(diǎn)的確定和預(yù)后判斷的重要工具[18-20]。然而，目前關(guān)于hDPSCs-exo對(duì)腫瘤的相關(guān)作用尚不明確，因此本實(shí)驗(yàn)從外泌體角度出發(fā)，探討hDPSCs-exo對(duì)CAL-27細(xì)胞增殖、遷移的影響及其潛在的分子機(jī)制。

本研究采用MTT實(shí)驗(yàn)評(píng)估了hDPSCs-exo對(duì)CAL-27細(xì)胞增殖能力的影響，結(jié)果顯示，與0 μg/mL組相比，僅80 μg/mL hDPSCs-exo組在第5天對(duì)CAL-27細(xì)胞的增殖有抑制作用，其余各濃度組均無(wú)顯著影響。目前關(guān)于外泌體濃度的選擇暫無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，有研究表明，外泌體濃度并不是越高作用效果就越佳，而是需要達(dá)到適宜濃度或時(shí)間點(diǎn)才能發(fā)揮其最佳作用，超過一定濃度會(huì)導(dǎo)致其作用下降[15，21]。因此，推測(cè)hDPSCs-exo在體外達(dá)到一定濃度時(shí)能抑制CAL-27細(xì)胞的增殖，這可能是hDPSCs-exo間接影響了TME或結(jié)合PI3K/Akt信號(hào)通路其他靶點(diǎn)，從而對(duì)CAL-27細(xì)胞發(fā)揮作用。

PI3K/Akt信號(hào)通路根據(jù)結(jié)構(gòu)和底物不同將PI3K分為三類，Ⅰ類信號(hào)機(jī)制目前研究最為透徹且與癌癥相關(guān)。該信號(hào)機(jī)制可能是由上游細(xì)胞表面受體激活的PI3K，與下游效應(yīng)因子Akt結(jié)合使其磷酸化，從而調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移、凋亡以及血管生成等[22-23]，在包括口腔鱗狀細(xì)胞癌在內(nèi)的多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[24-25]。Sento等[26]研究表明口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞衍生的外泌體通過激活PI3K/Akt信號(hào)通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲并調(diào)節(jié)受體細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。因此，本研究選擇了PI3K/Akt信號(hào)通路進(jìn)一步探討可能的作用機(jī)制。Western blot結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組(20 μg/mL、60 μg/mL、80 μg/mL組)與0 μg/mL組相比，PI3K和P-Akt的表達(dá)量明顯升高，表明其作用機(jī)制可能與激活PI3K/Akt信號(hào)通路有關(guān)。

綜上所述，hDPSCs-exo高濃度時(shí)抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌增殖，可能由于hDPSCs-exo結(jié)合了PI3K/Akt信號(hào)通路其他靶點(diǎn)、通過影響TME或者間接機(jī)制抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌增殖。因此，本研究設(shè)想能否將保持適宜濃度的hDPSCs-exo抑制增殖的同時(shí)再介入其他的藥物或者PI3K/Akt信號(hào)通路的抑制劑來抑制癌細(xì)胞的遷移，從而抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌的生長(zhǎng)來作為口腔鱗狀細(xì)胞癌的一種新的治療方式。當(dāng)然，目前仍有諸多問題有待深入研究，例如是否有其他信號(hào)通路參與此生物學(xué)過程、在體內(nèi)是否具有同樣的作用等，從而為口腔鱗狀細(xì)胞癌的治療提供新的思路。