張國卉 朱紫妍 慕沁汝 劉 謙

（山東中醫(yī)藥大學，山東濟南 250355）

丹參為唇形科植物丹參（Salvia miltiorrhiza Bge.）的干燥根和根莖[1]，是我國傳統(tǒng)的大宗藥材，歷史悠久，藥理活性廣泛而復雜。丹參具有保護心肌、抗動脈粥樣硬化、降低血壓和抗炎等作用，常用于治療心絞痛、冠心病、高血壓和炎癥等多種病癥[2]。其中，主治心絞痛和冠心病的復方丹參滴丸更是有望成為全球首個通過FDA認證的復方中藥[3]。目前，丹參在全國多地均有栽培且產(chǎn)區(qū)逐年擴大，但仍然面臨原藥材貨源緊缺的風險，一方面是由于我國社會進入老齡化，心腦血管疾病的發(fā)病率不斷攀升，且近些年發(fā)病趨于年輕化的程度更加嚴重[4]；另一方面是因為隨著研究人員對其藥理作用的深入研究，丹參的臨床應用也有了更多新途徑。這些因素的共同作用促使丹參市場需求量呈逐年擴增的態(tài)勢?，F(xiàn)今市售丹參基本為人工栽培品種，因產(chǎn)地環(huán)境不同，質(zhì)量也參差不齊，加之近年玉米、大豆等價格上漲[5]，藥農(nóng)種植丹參的積極性不高，提高丹參產(chǎn)量與質(zhì)量迫在眉睫。但是，丹參次生代謝機制尚不明確，品種選育年限過長等問題大大限制了新品種選育的進程，無法滿足丹參生產(chǎn)多樣化、精準化的需求。通過基因工程，可以輔助定向培育高產(chǎn)、高抗的優(yōu)質(zhì)新品種，或提高原藥材次生代謝產(chǎn)物含量用于有效成分提取，以滿足丹參巨大的市場需求量。1995年張蔭麟等[6]首次利用基因工程中的農(nóng)桿菌介導法，以不含目的基因的根癌農(nóng)桿菌C58和發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC15834、LBA9402[7]對丹參無菌苗進行侵染，最終獲得了丹參酮含量更高、根系更發(fā)達的再生植株。之后，相關(guān)研究人員在此基礎上導入不同的目的基因，構(gòu)建了各種丹參遺傳轉(zhuǎn)化體系，涌現(xiàn)出大批相關(guān)報道?，F(xiàn)階段，農(nóng)桿菌介導法仍是進行丹參基因工程研究時使用的最普遍有效的手段?；诖耍疚膹霓D(zhuǎn)化原理、影響因素和研究現(xiàn)狀三方面入手，對以農(nóng)桿菌介導法為轉(zhuǎn)化手段的丹參遺傳轉(zhuǎn)化體系建立進行綜述，以期為今后丹參基因功能研究和新品種培育提供參考。

1 農(nóng)桿菌介導丹參遺傳轉(zhuǎn)化體系研究的轉(zhuǎn)化原理

1.1 農(nóng)桿菌種類

農(nóng)桿菌是根瘤菌科（Rhizobitaceae）農(nóng)桿菌屬（Agrobacterium）的革蘭氏陰性細菌[8]，分為根癌農(nóng)桿菌、發(fā)根農(nóng)桿菌、放射性農(nóng)桿菌和旋鉤子農(nóng)桿菌。在丹參遺傳轉(zhuǎn)化研究中，常用的是根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）和發(fā)根農(nóng)桿菌（Agrobacterium rhizogenes）。

根癌農(nóng)桿菌和發(fā)根農(nóng)桿菌中均具有一個環(huán)狀DNA，分別稱為Ti質(zhì)粒和Ri質(zhì)粒，研究人員根據(jù)質(zhì)粒誘導合成的冠癭堿不同對其進行分類。在侵染丹參的試驗中，常用的根癌農(nóng)桿菌為章魚堿型、胭脂堿型和農(nóng)桿堿型，常用的發(fā)根農(nóng)桿菌為甘露堿型、農(nóng)桿堿型和黃瓜堿型。外植體經(jīng)根癌農(nóng)桿菌侵染后可誘發(fā)產(chǎn)生冠癭瘤，經(jīng)發(fā)根農(nóng)桿菌侵染后則產(chǎn)生大量不定根，在一定激素的誘導下可以再生成完整植株。

1.2 農(nóng)桿菌介導法的轉(zhuǎn)化原理

Ti質(zhì)粒和Ri質(zhì)粒結(jié)構(gòu)相似，主要包括Ori復制起始區(qū)、Vir毒性蛋白區(qū)和T-DNA區(qū)3個功能區(qū)，這決定了它們具有相似的轉(zhuǎn)移機制。以下以Ti質(zhì)粒為例介紹農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化原理。

野生型Ti質(zhì)粒中有一段攜帶致瘤基因的TDNA序列，在Vir毒性區(qū)的作用下可被轉(zhuǎn)移插入到植物DNA組中完成植物的轉(zhuǎn)基因過程。具體可分為4步：①植物受傷后，傷口部位釋放的酚類物質(zhì)吸引農(nóng)桿菌靠近；②農(nóng)桿菌細胞膜上的VirA蛋白結(jié)合信號物質(zhì)并通過磷酸化突進，進一步激活另一個蛋白VirG；③核酸內(nèi)切酶VirD1和VirD2受到激活態(tài)的VirG蛋白誘導后，在T-DNA末端長為25個堿基的重復序列位置進行切割，產(chǎn)生一條在一端結(jié)合VirD2蛋白的單鏈T-DNA[9]；④VirE2蛋白與新產(chǎn)生的TDNA鏈結(jié)合形成成熟的T-DNA復合體進入植物細胞，在植物細胞核中，T-DNA通過一系列作用被整合到植物基因組上。

但是，在實際的轉(zhuǎn)基因過程中，野生型Ti質(zhì)粒往往無法直接使用，主要是由于其上沒有合適的篩選標記、缺乏直接為人所用的有效酶切位點、攜帶的致瘤基因太大且與研究不相關(guān)等。因此，研究人員通常會將T-DNA放置到另一個更容易被操作的載體上，而位于識別序列之間的DNA則被替換為要研究的目的基因，通過侵染，致病系統(tǒng)誘導T-DNA進入植物細胞但不引入任何致瘤基因，從而使目的基因整合到植物基因組上，且不產(chǎn)生冠癭瘤。

2 丹參遺傳轉(zhuǎn)化體系建立過程中影響轉(zhuǎn)化的因素

2.1 外植體選擇

外植體種類是影響丹參轉(zhuǎn)化效率的重要因素。這是由于農(nóng)桿菌中T-DNA轉(zhuǎn)移到植物細胞完成轉(zhuǎn)化的階段在短時間內(nèi)發(fā)生，要求植物細胞具有較強的分裂能力；而對于器官完整的植株來說，不同器官的不同部位分裂能力有差異。因此，外植體選取的部位不同，最終導致轉(zhuǎn)化效率不同。

目前，在以丹參為供試材料的試驗中，主要將葉片作為外植體。在同一條件下，用發(fā)根農(nóng)桿菌侵染丹參的葉片、葉柄和莖段，葉片的誘導效率最高，是最適合進行毛狀根誘導的外植體[10-11]。尤其是葉片基部，因葉脈更粗，對農(nóng)桿菌的侵染更加敏感，是葉片中轉(zhuǎn)化率最高的部位[12]。蔡 媛等[13]對丹參葉片大小進行了篩選，結(jié)果表明，1.0～1.2 cm2為最佳葉面積，考慮到實際操作的便利性，最終將最佳條件確定為0.8 cm2。但也有少數(shù)試驗結(jié)果表明，葉柄的分化率更高，分化速度更快，較葉片和莖段有明顯優(yōu)勢，具體可能與丹參葉齡有關(guān)。當?shù)⑷~齡為7～14 d時，葉片分化效率較高；當葉齡超過14～28 d甚至更長時，葉柄分化效率較高[14]。由此可見，在選用外植體時還需考慮丹參葉齡。

2.2 外植體預培養(yǎng)時間

適宜的預培養(yǎng)處理對丹參轉(zhuǎn)化率的提高具有促進作用。外植體之所以需要預培養(yǎng)，有3個方面的原因：一是外植體剛從植株上分離，需要進行生理狀態(tài)調(diào)整，從而加快細胞分裂，提高轉(zhuǎn)化效率；二是在植物傷口愈合過程中，細胞需要一定時間完成酚類化合物等信號分子的產(chǎn)生與釋放，從而誘導農(nóng)桿菌完成轉(zhuǎn)化；三是在剪切外植體的過程中可能會對其造成污染，通過預培養(yǎng)可提前剔除被雜菌污染的外植體。

預培養(yǎng)時間通常不超過3 d，以1～2 d居多。王麗娟[15]設置預培養(yǎng)時間為 1、2、3、4 d，并以未經(jīng)預培養(yǎng)的丹參葉片切塊為對照進行試驗，發(fā)現(xiàn)預培養(yǎng)1 d或2 d的外植體轉(zhuǎn)化效率較高。若預培養(yǎng)時間過長，植物細胞傷口基本愈合開始形成愈傷組織或不定芽，農(nóng)桿菌侵染將較為困難，不僅會導致轉(zhuǎn)化率大大降低，同時還會提高假陽性概率。

2.3 菌株種類

選用的菌株種類不同往往會對轉(zhuǎn)化過程產(chǎn)生直接影響。LBA4404、GV3101和EHA105是構(gòu)建丹參遺傳轉(zhuǎn)化體系時常用的根癌農(nóng)桿菌，其中GV3101和EHA105的使用率更高，且EHA105生長迅速、轉(zhuǎn)化操作簡單，為轉(zhuǎn)化試驗中的首選菌種。常用的發(fā)根農(nóng)桿菌種類更為多樣。周 偉等[10]采用C58C1、R1601、A4進行丹參毛狀根誘導率比較，結(jié)果表明，C58C1＞R1601＞A4， 且 C58C1的誘導率遠大于 A4；談榮慧等[16]利用發(fā)根農(nóng)桿菌 LBA9402、A4、15834在pH值為4.81的MSOH液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)丹參毛狀根，發(fā)現(xiàn)其丹酚酸含量具有明顯差異，由LBA9402和A4誘導的毛狀根丹酚酸含量較高，15834誘導的毛狀根丹酚酸含量最低。

2.4 菌液濃度、侵染時間和共培養(yǎng)時間

菌液濃度、侵染時間和共培養(yǎng)時間是限制轉(zhuǎn)化率的關(guān)鍵因素，試驗過程中三者經(jīng)常作為組合條件一同考慮。原因是農(nóng)桿菌侵染外植體后通常需要在創(chuàng)口部位生存16 h，從而將攜帶的目的基因整合到被侵染的樣品中，研究人員多采用農(nóng)桿菌和外植體在培養(yǎng)基上共培養(yǎng)的方式實現(xiàn)目的基因到植物細胞的轉(zhuǎn)移，其時間長短將直接影響轉(zhuǎn)化效率的高低。若共培養(yǎng)時間過長，外植體會因農(nóng)桿菌過度繁殖而腐化死亡；若共培養(yǎng)時間過短，則無法完成目的基因的整合。其最優(yōu)時間的確定需要根據(jù)菌液濃度和侵染時間綜合而定。因此，三者息息相關(guān)。在以丹參為外植體進行遺傳轉(zhuǎn)化研究的多篇文獻中，均提到了菌液濃度、侵染時間和共培養(yǎng)時間的篩選（表1）。

表1 丹參不同遺傳轉(zhuǎn)化體系優(yōu)化結(jié)果

分析前人研究成果可知，雖然在丹參不同轉(zhuǎn)化體系的構(gòu)建過程中得到的最優(yōu)結(jié)果有所差異，但菌液濃度基本維持在OD600=0.2～1.0，侵染時間控制在5～30 min，共培養(yǎng)時間為 1～4 d。 若低于常用范圍，農(nóng)桿菌難以附著并完成轉(zhuǎn)化；若高于常用范圍，丹參外植體可能因為表面農(nóng)桿菌過多難以剔除，最終受到毒害褐化，甚至死亡。

2.5 是否添加乙酰丁香酮

外源酚類化合物的添加可能會促進丹參轉(zhuǎn)化率的提高。在以其他藥用植物為供試材料進行農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的試驗中證實，植物受傷后產(chǎn)生的酚類物質(zhì)能夠激活vir基因，促使Ti/Ri質(zhì)粒向植物細胞轉(zhuǎn)移，如黃偉劍等[18]在誘導廣藿香外植體產(chǎn)生毛狀根時，人為添加了質(zhì)量濃度為15 mg/L的乙酰丁香酮，所用的2種不同菌株均表現(xiàn)出轉(zhuǎn)化率的顯著提高。因此，推測通過人為添加乙酰丁香酮提高轉(zhuǎn)化效率的方式也可應用到丹參的轉(zhuǎn)化試驗中。

周 偉等[10]用發(fā)根農(nóng)桿菌C58C1侵染外植體時，在預培養(yǎng)和共培養(yǎng)階段均加入了400 μmol/L乙酰丁香酮，其轉(zhuǎn)化率是不添加乙酰丁香酮時的1.55倍；超過最佳濃度后，丹參外植體會因高濃度小分子酚類物質(zhì)產(chǎn)生的氧化傷害褐化或老化死亡。但是，也有其他研究人員驗證后表明，在一定情況下乙酰丁香酮并不是影響轉(zhuǎn)化率的限制性因素，可能是因為丹參受傷時自然分泌的信號物質(zhì)已足以誘導農(nóng)桿菌中vir基因的活化[15]。

目前，有關(guān)乙酰丁香酮對農(nóng)桿菌介導的丹參遺傳轉(zhuǎn)化體系的影響研究較少，試驗結(jié)論的對立具體是因為各菌株類型對酚類化合物的敏感程度不同，還是因為操作過程中各條件的差異，仍需進一步研究。

2.6 除菌抗生素的添加

不同濃度和種類的除菌抗生素可以通過影響農(nóng)桿菌生長及外植體分化間接影響轉(zhuǎn)化效率。目前，在構(gòu)建丹參遺傳轉(zhuǎn)化體系過程中常用的除菌抗生素有3種類型：頭孢霉素、羧芐青霉素、特美汀。試驗證明，這3種抗生素都能夠起到抑制農(nóng)桿菌生長的作用。在頭孢霉素濃度低于400 mg/L時，丹參外植體會被過度繁殖的農(nóng)桿菌污染；當頭孢霉素濃度達到400 mg/L時，雖能有效抑制農(nóng)桿菌生長，但也抑制了外植體分化，出芽率較低。與頭孢霉素相比，羧芐青霉素和特美汀更適用于丹參外植體的脫菌，尤其是特美汀，在濃度達到400 mg/L后不僅有較好的除菌效果，同時丹參出芽率和轉(zhuǎn)化率也是三者中最高的；用羧芐青霉素除菌時，丹參轉(zhuǎn)化率隨其濃度的增大而升高，400 mg/L為最佳濃度[19]。

因此，綜合考慮除菌效果、外植體分化效果和轉(zhuǎn)化率三方面，特美汀是最適宜丹參外植體除菌的抗生素，其次是羧芐青霉素，頭孢霉素的效果最差。

3 研究現(xiàn)狀

自以丹參為供試材料實現(xiàn)了目的基因的轉(zhuǎn)入后，更多研究人員將研究重心轉(zhuǎn)移到利用農(nóng)桿菌介導法提高丹參品質(zhì)和產(chǎn)量上，且隨著研究的不斷深入，此法不僅可作為引入外源基因獲得具有優(yōu)良性狀丹參植株的利器，還逐漸成為探究丹參中影響有效成分含量的關(guān)鍵基因功能和輔助其他生物技術(shù)發(fā)揮作用的重要手段，近幾年發(fā)展勢頭尤為迅猛。

3.1 引入外源基因培育高抗丹參

3.1.1 抗旱丹參的培育。Zhang等[20]在CaMV 35S啟動子控制下，利用農(nóng)桿菌介導法將從紅景天中分離得到的GPX基因家族成員RcGPX5在丹參中進行表達，與野生型相比，在干旱脅迫下轉(zhuǎn)基因丹參幼苗的枯萎時間更晚，丹參對干旱脅迫的耐受性增強。

3.1.2 抗除草劑丹參的培育。Liu等[21]將bar基因作為目的基因，通過農(nóng)桿菌導入到丹參中，并采用抗除草劑和gus表達兩步法進行篩選，最終獲得的陽性植株經(jīng)Basta噴灑后，表現(xiàn)出對除草劑較強的耐受性，成功獲得了抗除草劑的丹參品種。

3.2 探究與丹參有效成分含量提高相關(guān)的基因功能

通過與原植株對比，分析農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化成功后的過表達株系中有效成分含量變化水平，可以證明目的基因是否具有直接促進次生代謝產(chǎn)物合成的功能。如張建紅等[22]通過農(nóng)桿菌介導法獲得了丹參中SmCYP81C16基因的過表達轉(zhuǎn)基因毛狀根株系，經(jīng)過與對照株系比較發(fā)現(xiàn)，在SmCYP81C16過表達陽性株系中，丹參酮類化合物的含量升高，且過表達毛狀根中丹參酮合成途徑關(guān)鍵酶基因的表達量也顯著上升。由此證明，SmCYP81C16具有正向調(diào)控丹參酮生物合成的功能。

除此之外，農(nóng)桿菌介導法還可作為探明部分基因如何間接影響有效成分含量的輔助手段。Wu等[23]利用農(nóng)桿菌介導法成功獲得了過表達AtPAP1基因和過表達SmbHLH51基因的丹參植株，在此基礎上經(jīng)過進一步的分析和驗證得出，AtPAP1通過激活SmbHLH51的表達來刺激丹參酚酸的合成，并可能與SmbHLH51形成潛在的轉(zhuǎn)錄復合物，明確了AtPAP1轉(zhuǎn)錄因子促進丹參酚酸產(chǎn)生的分子機制。

3.3 證明其他生物技術(shù)用于提高丹參品質(zhì)的可行性

Zhou等[24]先利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對篩選出的RAS基因進行特異性編輯，再將編輯好的目的基因用農(nóng)桿菌介導的方式導入丹參細胞中，最終在轉(zhuǎn)基因毛狀根中觀察到了酚酸水平的變化，驗證了CRISPR/Cas9系統(tǒng)作為丹參甚至藥用植物基因組修飾工具的可行性。

4 結(jié)語

丹參是常用中藥材，同時丹參基因組小、染色體少，在轉(zhuǎn)基因再生植株時世代周期較短，作為藥用模式植物有著極高的研究價值[25]。根是植物進行次生代謝最活躍的部分，而包括丹參在內(nèi)的大部分藥用植物有效成分都是次生代謝產(chǎn)物。由發(fā)根農(nóng)桿菌誘導產(chǎn)生的毛狀根來源于同一個植物細胞，每個毛狀根細胞都是轉(zhuǎn)化的，不會產(chǎn)生轉(zhuǎn)化細胞與非轉(zhuǎn)化細胞的嵌合體，遺傳穩(wěn)定性好；且由毛狀根再生出的植株大多節(jié)間短、頂端優(yōu)勢較弱，有利于轉(zhuǎn)化植株的篩選，在作為生物反應器和改良丹參品質(zhì)方面具有很大的市場和潛力。近幾年，以發(fā)根農(nóng)桿菌介導法為轉(zhuǎn)化手段得出的試驗成果逐漸增多，但相比于根癌農(nóng)桿菌，由發(fā)根農(nóng)桿菌介導的丹參遺傳轉(zhuǎn)化體系還不夠成熟，部分與轉(zhuǎn)化效率有關(guān)的影響因素有待進一步優(yōu)化。相信隨著農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化技術(shù)的日臻成熟，定會在優(yōu)化和豐富丹參種質(zhì)資源方面實現(xiàn)質(zhì)的飛躍。