陳家倫，黃桂霞，甘聃

（仙樂(lè)健康科技股份有限公司，廣東汕頭 515041）

隨著生活水平的提高，人們的飲食結(jié)構(gòu)和生活方式發(fā)生很大變化，便秘的發(fā)病率也因此呈現(xiàn)逐年上升趨勢(shì)，引起越來(lái)越多的關(guān)注[1]。慢傳輸型便秘（Slow transit constipation，STC）作為一種多因素特發(fā)疾病，發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，嚴(yán)重便秘癥狀會(huì)引發(fā)皮膚痤瘡、內(nèi)分泌失調(diào)、腹脹甚至導(dǎo)致心肌梗塞和猝死。長(zhǎng)時(shí)間服用溶劑性、刺激性瀉藥會(huì)帶來(lái)嚴(yán)重副作用，導(dǎo)致腸道粘膜、腸神經(jīng)和腸道菌群平衡遭受損害[2]，引發(fā)后續(xù)性便秘。通過(guò)使用微生物制劑來(lái)改善腸道微生態(tài)，提升胃腸道功能，來(lái)達(dá)到緩解便秘的方法逐漸開(kāi)始流行。在針對(duì)慢傳輸型便秘腸道轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間緩慢的研究中，發(fā)現(xiàn)動(dòng)物雙歧桿菌DN173010（每天攝入3.7×1010CFU）[3]和干酪乳桿菌shirota（每天攝入6.5×109CFU）[4]均能夠縮短腸轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間。多菌株制劑在市場(chǎng)應(yīng)用更多，人群適用性更廣，常見(jiàn)多菌制劑的研究如二聯(lián)菌（動(dòng)物雙歧桿菌BB-12+嗜酸乳桿菌La-5）[5]、三聯(lián)菌（短雙歧桿菌+嗜酸乳桿菌+兩歧雙歧桿菌）[6]均能改善便秘癥狀，而益生菌的功效與菌株特異性關(guān)聯(lián)緊密，復(fù)合乳桿菌（鼠李糖乳桿菌LrGG-100+長(zhǎng)雙岐桿菌BL-11+嗜酸乳桿菌LA-99+干酪乳桿菌LC-88）中所有菌株均未曾報(bào)道過(guò)與緩解便秘功效相關(guān)的研究，因此本文中選用該復(fù)合菌研究緩解便秘方向功能具有一定創(chuàng)新性。

在研究中發(fā)現(xiàn)，STC 的發(fā)病機(jī)制與腸神經(jīng)系統(tǒng)（Enteric Nervous System，ENS）的改變密切相關(guān)，位于腸道內(nèi)壁的神經(jīng)系統(tǒng)，獨(dú)立于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，調(diào)節(jié)胃腸道的運(yùn)動(dòng)、分泌、新陳代謝等功能[7]。Cajal 間質(zhì)細(xì)胞（Interstitial Cells of Cajal，ICC）作為胃腸道的起搏細(xì)胞，參與胃腸道的動(dòng)力學(xué)變化[8,9]，在STC 患者結(jié)腸發(fā)現(xiàn)ICC特異性酪氨酸蛋白激酶受體c-kit的顯著降低[10]，表明其在STC 發(fā)病機(jī)制中的重要性。水通道蛋白（Aquaporins，AQP）在人體水運(yùn)輸中發(fā)揮重要作用，AQP3 在結(jié)腸粘膜上皮表達(dá)，已經(jīng)成為便秘治療的一個(gè)新靶點(diǎn)[11]。越來(lái)越多研究表明益生菌定植于腸道，通過(guò)調(diào)節(jié)腸道免疫來(lái)穩(wěn)定腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài)[12-14]。

本研究通過(guò)使用鹽酸洛哌丁胺造模便秘小鼠模型，探索復(fù)合乳桿菌對(duì)胃腸道功能的作用，同時(shí)通過(guò)檢測(cè)胃腸調(diào)節(jié)肽、AQP3、c-kit、細(xì)胞因子等指標(biāo)對(duì)復(fù)合乳桿菌的作用機(jī)制進(jìn)行探索，為治療STC 的產(chǎn)品開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

SPF 級(jí)BALB/c 雄性小鼠，6 周齡，購(gòu)自北京維通利華公司，在江南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)，許可證號(hào)：SYXK（蘇）2021-0056，實(shí)驗(yàn)方案通過(guò)江南大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（JN.No20190930b0501220）；復(fù)合乳桿菌（鼠李糖乳桿菌LrGG-100:長(zhǎng)雙岐桿菌BL-11:嗜酸乳桿菌LA-99:干酪乳桿菌LC-88=4:2:1:1），仙樂(lè)健康科技股份有限公司；易蒙停鹽酸洛哌丁胺（每粒2 mg），西安楊森制藥；活性炭及引物合成，生工生物；小鼠P 物質(zhì)（Substance P，SP）、胃動(dòng)素（Motilin，MTL）、胃泌素（Gastrin，Gas）、血管活性腸肽（Vasoactive Intestinal Peptide，VIP）、生長(zhǎng)抑素（Somatostatin，SS）、內(nèi)皮素（Endothelin 1，ET-1）、D-乳酸、緊密連接蛋白（Occludin）、腫瘤壞死因子-α（Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α）、干 擾 素-γ（Interferonγ，IFN-γ）、白介素2（Interleukin 2，IL-2）、白介素4（Interleukin 4，IL-4）、白介素6（Interleukin 6，IL-6）、白介素10（interleukin 10，IL-10）、白介素12（Interluekin 12，IL-12）、白介素17（Interleukin，IL-17）和抗體（sIgA）酶聯(lián)免疫試劑盒，南京森貝伽生物；阿拉伯樹(shù)膠粉，國(guó)藥試劑。

PB300-N 電子天平，梅特勒-托利多；Multiscan Go多功能酶標(biāo)儀，賽默飛公司；CFX384 Real Time PCR System，伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品配制

使用生理鹽水稀釋動(dòng)物歧岐桿菌BB-12成菌懸液2.5×109CFU/mL（陽(yáng)性對(duì)照），稀釋成復(fù)合乳桿菌重懸液2.5×109CFU/mL（低劑量）和2.5×1010CFU/mL（高劑量）。

墨汁配制：阿拉伯膠、水和活性炭按比例2:2:1混合煮沸，冷藏保存。

鹽酸洛哌丁胺懸液：使用生理鹽水重懸鹽酸洛哌丁胺。

1.2.2 動(dòng)物模型建立與分組

小鼠飼養(yǎng)在（23±2）℃，相對(duì)濕度50%±10%環(huán)境中，12 h 明暗交替節(jié)律，實(shí)驗(yàn)期間，飲水進(jìn)食自由。

適應(yīng)培養(yǎng)一周后，將小鼠隨機(jī)分成5 組，每組10只：健康組、便秘組、陽(yáng)性組、復(fù)合乳桿菌低劑量組、復(fù)合乳桿菌高劑量組。便秘組灌胃生理鹽水，陽(yáng)性、低、高劑量組灌胃菌懸液，持續(xù)7 d，第8 天開(kāi)始根據(jù)小鼠體重按量灌胃鹽酸洛哌丁胺懸液，灌胃劑量10 mg/kg 造模，以顯著延長(zhǎng)的首粒黑便排除時(shí)間為造模成功依據(jù)，造模后，陽(yáng)性、低、高劑量組按0.2 mL BB-12、復(fù)合乳桿菌低、高劑量懸液進(jìn)行灌胃，每天1次，持續(xù)7 d，健康組全程灌胃生理鹽水。

1.2.3 小鼠首粒黑便時(shí)間、黑便粒數(shù)、黑便質(zhì)量及小腸推進(jìn)率的測(cè)定

灌胃至第21 天，健康組灌胃生理鹽水0.2 mL、其余組均根據(jù)小鼠體重按量給予0.2 mL 生理鹽水重懸的鹽酸洛哌丁胺懸液（劑量10 mg/kg），1 h 后，開(kāi)始灌胃墨汁，記錄小鼠首粒黑便排出時(shí)間、6 h 內(nèi)黑便排出粒數(shù)和黑便總質(zhì)量。

禁食24 h，第22 天，給予健康組生理鹽水0.2 mL灌胃，同時(shí)其余組根據(jù)小鼠體重按量給予0.2 mL 生理鹽水重懸鹽酸洛哌丁胺懸液（劑量10 mg/kg）灌胃，30 min 后，健康組和便秘組灌胃墨汁，其余組給與含對(duì)應(yīng)內(nèi)容物的等量墨汁。30 min 后，脫頸小鼠，取整個(gè)腸管，測(cè)小腸和墨汁推進(jìn)長(zhǎng)度，計(jì)算小腸推進(jìn)率：

式中：

I——小腸推進(jìn)率，%；

A——墨汁推進(jìn)長(zhǎng)度，cm；

A0——小腸總長(zhǎng)度，cm。

1.2.4 細(xì)胞因子及胃腸調(diào)節(jié)肽檢測(cè)

采血前禁食不禁水12 h，采用異氟烷對(duì)小鼠進(jìn)行麻醉，眼眶取血，收集小鼠血液，3 000g離心15 min后收集上清，使用對(duì)應(yīng)ELISA 試劑盒小鼠血清中細(xì)胞因子及胃腸調(diào)節(jié)肽（SP、MTL、Gas、VIP、SS、ET-1）含量，具體步驟參考試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.2.5 小鼠結(jié)腸組織AQP3 和c-kit 基因表達(dá)水平檢測(cè)

取結(jié)腸組織，Trizol 法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（Quantitative real-time polymerase china extraction，qRT-PCR）來(lái)測(cè)定相關(guān)蛋白的表達(dá)量。由生工生物工程有限公司合成AQP3（AF104417）、c-kit（NM_021099）、actin（AY618199）引物序列，如表1 所示。以cDNA 為模板，反應(yīng)體系10 μL，反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，共38 個(gè)循環(huán)，以actin基因?yàn)閮?nèi)參，采用2-△△Ct 法分析數(shù)據(jù)，健康組的數(shù)值為1，結(jié)果由CFX96 Manager軟件分析。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0 進(jìn)行顯著性分析，GraphPad prism 8 作圖，采用one-way ANOVA 多重比較組間差異，數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合乳桿菌對(duì)便秘小鼠腸道功能的影響

小腸運(yùn)動(dòng)形式主要有三種，緊張性收縮、分節(jié)運(yùn)動(dòng)和蠕動(dòng)[15]，蠕動(dòng)的作用是推進(jìn)腸內(nèi)容物，通過(guò)洛哌丁胺抑制小腸蠕動(dòng)，造模便秘小鼠。通過(guò)測(cè)定小腸推進(jìn)率、首粒黑便時(shí)間、6 h 排便粒數(shù)和糞便質(zhì)量，對(duì)小鼠胃腸道功能進(jìn)行評(píng)價(jià)。

如圖1 所示，便秘組在小腸推進(jìn)率（圖1a）、首粒黑便時(shí)間（圖1b）、黑便粒數(shù)（圖1c）和黑便質(zhì)量（圖1d）與健康組差異顯著（p＜0.05），表明洛哌丁胺造模便秘小鼠模型成功。與便秘組相比，復(fù)合乳桿菌能夠顯著改善便秘小鼠胃腸道功能（p＜0.05），表現(xiàn)為復(fù)合乳桿菌低、高劑量組的小腸推進(jìn)率顯著提高61.45%（p＜0.05）、1.22 倍（p＜0.05），排便時(shí)間縮短21.42%（p＜0.05）、29.14%（p＜0.05），排便數(shù)量增加1.50 倍（p＜0.05）、1.52 倍（p＜0.05），排便質(zhì)量增加1.13 倍（p＜0.05）、1.25 倍（p＜0.05），同時(shí)復(fù)合乳桿菌與陽(yáng)性組效果無(wú)顯著差異（p＞0.05）。這表明復(fù)合乳桿菌具有促進(jìn)小鼠胃腸道功能，緩解便秘的功效。王琳琳[16]研究了雙歧桿菌對(duì)便秘小鼠的改善作用，結(jié)果和本研究一致。

圖1 復(fù)合乳桿菌對(duì)洛哌丁胺引起的便秘小鼠腸道排泄影響Fig.1 Effects of compound lactobacillus on excretion in loperamide induced constipation mouse model

2.2 復(fù)合乳桿菌對(duì)便秘小鼠血清細(xì)胞因子的影響

腸道疾病通常會(huì)引起腸道免疫應(yīng)答，研究中發(fā)現(xiàn)，益生菌有調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的功能，CD4+輔助T 細(xì)胞（Thelpercells，Th）可分為T(mén)h1、Th2、Th17 和Treg 細(xì)胞[17]，Th1 分泌細(xì)胞因子IL-2（圖2a）、TNF-α（圖2g）和IFN-γ（圖2h）介導(dǎo)巨噬細(xì)胞活化，參與細(xì)胞免疫功能；Th2 分泌IL-4（圖2b）、IL-6（圖2c）和IL-10（圖2d）介導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞活化，調(diào)節(jié)體液免疫應(yīng)答，IL-12 和IL-4 分別參與誘導(dǎo)Th1 和Th2 的極化，Th1/Th2 的平衡對(duì)于維護(hù)機(jī)體穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。Th17 分泌IL-17（圖2f），Treg 分泌IL-10（圖2d），炎癥發(fā)生過(guò)程中，導(dǎo)致大量Treg 轉(zhuǎn)化成Th17[18]，而胃腸道是Th17 主要的控制部位[19]，Th17/Treg 的平衡對(duì)于腸道穩(wěn)態(tài)的維持很重要。如圖2 中各細(xì)胞因子的分泌所示，便秘組相比健康組的各細(xì)胞因子出現(xiàn)下降，其中IL-6和IL-10 質(zhì)量濃度顯著下降（p＜0.05），其余細(xì)胞因子分析無(wú)顯著性（p＞0.05），給予便秘小鼠復(fù)合乳桿菌后，會(huì)提高細(xì)胞因子分泌水平，各組間分析無(wú)差異（p＞0.05）。這表明復(fù)合乳桿菌可能有調(diào)節(jié)細(xì)胞因子趨于穩(wěn)定水平，維持Th1/Th2、Th17/Treg 平衡的能力。

緊密連接蛋白和D-乳酸在腸道屏障中起重要作用[20]，sIgA 是腸道粘膜免疫的關(guān)鍵性指標(biāo)[21]。便秘組相比健康組在緊密連接蛋白（圖2j）和D-乳酸（圖2k）質(zhì)量濃度有所下降，差異不顯著（p＞0.05）；sIgA 的含量（圖2i）在各組中未發(fā)現(xiàn)明顯改變（p＞0.05），表明腸屏障未受到明顯損傷。

圖2 復(fù)合乳桿菌對(duì)洛哌丁胺引起的便秘小鼠血清指標(biāo)的影響Fig.2 Effects of compound lactobacillus on serum indicators in a loperamide induced constipation mouse model

腸道微生物群和免疫穩(wěn)態(tài)之間關(guān)聯(lián)密切，這是因?yàn)槟c道微生物對(duì)免疫系統(tǒng)的發(fā)育、細(xì)胞因子和趨化因子的分泌至關(guān)重要，腸道微生物能夠激活腸道粘膜免疫系統(tǒng)，促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖分化，激活巨噬細(xì)胞和陷光細(xì)胞因子分泌，然而關(guān)于炎癥調(diào)節(jié)細(xì)胞因子對(duì)于便秘的影響始終存在爭(zhēng)論。Marjan 等[22]發(fā)現(xiàn)血清細(xì)胞因子水平與年齡相關(guān)性便秘之間存在顯著關(guān)聯(lián)，降低Th1/Th2 比率，提高促炎性細(xì)胞因子IL-6 和TNF-α質(zhì)量濃度，而在Jin 等[23]的研究中發(fā)現(xiàn)，血清細(xì)胞因子IL-10/IL-12 和TNF-α并未發(fā)生顯著變化。腸道穩(wěn)態(tài)離不開(kāi)腸道上皮、細(xì)胞因子和微生物菌群之間復(fù)雜的相互作用，從總體變化水平可以看出復(fù)合乳桿菌具有平衡細(xì)胞因子趨于健康組的作用。

2.3 復(fù)合乳桿菌對(duì)便秘小鼠結(jié)腸組織AQP3和c-kit 轉(zhuǎn)錄水平的影響

水通道蛋白AQP3 在水代謝和腸道通透性中起重要作用[24]，ICC 能夠促進(jìn)腸道蠕動(dòng)[25]，c-kit 在ICC 發(fā)育過(guò)程中具有重要作用，研究中常用c-kit 表達(dá)水平反映ICC 細(xì)胞數(shù)量。如圖3 所示，復(fù)合乳桿菌灌胃便秘小鼠后，能夠顯著促進(jìn)AQP3 和c-kit 的轉(zhuǎn)錄（p＜0.05），表現(xiàn)為高劑量組的AQP3 和c-kit 基因轉(zhuǎn)錄水平分別是便秘組的1.82 倍（p＜0.05）和2.00 倍（p＜0.05），且低、高劑量組、陽(yáng)性組與健康組之間均無(wú)差異（p＞0.05）。

圖3 復(fù)合乳桿菌對(duì)AQP3 和c-kit 基因表達(dá)量的影響Fig.3 Effects of compound lactobacillus on expression of AQP3 and c-kit in mice colon

水通道蛋白的異常會(huì)影響結(jié)腸水代謝和腸道通透性，與STC 的發(fā)病緊密相關(guān)[26]，本研究發(fā)現(xiàn)便秘組小鼠的AQP3 轉(zhuǎn)錄水平顯著下降，給予復(fù)合乳桿菌后，AQP3 轉(zhuǎn)錄水平顯著提高，小鼠排便質(zhì)量上升（圖1d），這表明服用復(fù)合乳桿菌后，能夠改善水分重吸收，從而提高糞便含水量，改善便秘，結(jié)果和Yu 等[27]的研究一致。STC 患者的結(jié)腸ICC 數(shù)量明顯低于正常[28]，c-kit 作為其特異性指標(biāo)能夠一定程度上反應(yīng)ICC 數(shù)量，復(fù)合乳桿菌能夠提高c-kit 的轉(zhuǎn)錄水平，表明灌胃便秘小鼠復(fù)合乳桿菌后，小鼠腸道ICC數(shù)量得到提升，從而促進(jìn)了腸道蠕動(dòng)。

2.4 復(fù)合乳桿菌對(duì)便秘小鼠血清胃腸調(diào)節(jié)肽的影響

胃腸調(diào)節(jié)肽分為以SP、MTL 和Gas 為代表的興奮性遞質(zhì)，以VIP、SS 和ET-1 為代表的抑制性遞質(zhì)[29]，如圖4 所示，洛哌丁胺造模便秘后，促進(jìn)型遞質(zhì)SP（圖4a）、MTL（圖4b）和Gas（圖4c）質(zhì)量濃度顯著下降（p＜0.05），而給予復(fù)合乳桿菌高劑量治療后，能夠顯著提高SP 和MTL 質(zhì)量濃度（p＜0.05），效果與陽(yáng)性組一致，Gas 質(zhì)量濃度治療后略有提高，但不顯著（p＞0.05）。抑制型遞質(zhì)VIP（圖4d）、SS（圖4e）和ET-1（圖4f）在便秘組中質(zhì)量濃度最高，顯著高于其余組別（p＜0.05），在復(fù)合乳桿菌治療后，VIP、SS 和ET-1 顯著下降（p＜0.05）。結(jié)果表明復(fù)合乳桿菌對(duì)小鼠慢傳輸型便秘可能通過(guò)提高SP 和MTL，抑制VIP、SS 和ET-1 來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

圖4 復(fù)合乳桿菌對(duì)洛哌丁胺引起的便秘小鼠血清中胃腸調(diào)節(jié)肽的影響Fig.4 Effects of compound lactobacillus on gastrointestinal hormones in serum samples of loperamide induced constipation mouse model

ENS 中存在復(fù)雜的生化信號(hào)通路，胃腸調(diào)節(jié)肽作為生化信號(hào)傳導(dǎo)的重要遞質(zhì)，參與通路的組成，承擔(dān)著信號(hào)傳遞功能。研究表明，便秘患者的興奮性遞質(zhì)表達(dá)減少，抑制性遞質(zhì)表達(dá)增加，導(dǎo)致腸道動(dòng)態(tài)平衡被打破，腸道運(yùn)動(dòng)收到抑制[29-31]。MTL 促進(jìn)胃腸道運(yùn)動(dòng)，Gas 與胃酸分泌，加速胃排空有關(guān)，SP 促進(jìn)胃腸道平滑肌收縮，刺激結(jié)腸粘膜分泌水和電解質(zhì)，促進(jìn)腸道蠕動(dòng)；而VIP 的功能是放松胃腸道括約肌，從而導(dǎo)致腸道轉(zhuǎn)運(yùn)速率減緩，ET-1 維持血管張力，調(diào)節(jié)腸道功能，SS 放松平滑肌，減緩胃排空速度。本研究發(fā)現(xiàn)便秘小鼠的興奮性遞質(zhì)SP 和MTL 相比健康組顯著下降，抑制性遞質(zhì)VIP、SS 和ET-1 顯著上升，給予復(fù)合乳桿菌后，能夠恢復(fù)平衡，從而改善便秘癥狀。

3 結(jié)論

本研究通過(guò)對(duì)小鼠胃腸道功能進(jìn)行評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)復(fù)合乳桿菌能夠顯著促進(jìn)腸道蠕動(dòng)，提高推進(jìn)率，改善排泄功能。通過(guò)初步探索復(fù)合乳桿菌改善便秘的機(jī)制發(fā)現(xiàn)，復(fù)合乳桿菌并未影響腸道免疫，而是可能通過(guò)調(diào)控水通道蛋白AQP3 和c-kit 的表達(dá)，來(lái)控制腸道水轉(zhuǎn)運(yùn)和腸道蠕動(dòng)，同時(shí)調(diào)節(jié)胃腸調(diào)節(jié)肽來(lái)影響腸道神經(jīng)系統(tǒng)。該研究為開(kāi)發(fā)相關(guān)功能性食品奠定了理論基礎(chǔ)。