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蘭坪烏骨綿羊SLC17A8基因多態(tài)性與其烏質(zhì)性狀關(guān)聯(lián)性研究

2022-11-08 10:42和曉明任洪輝劉興能朱俊紅鄧衛(wèi)東
家畜生態(tài)學(xué)報(bào) 2022年10期
關(guān)鍵詞:酪氨酸黑色素位點(diǎn)

岳 丹,和曉明,任洪輝,劉興能,朱俊紅,鄧衛(wèi)東*

(1.玉溪農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 動(dòng)物科技學(xué)院,云南 玉溪 653106;2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,云南 昆明650201)

SLC17A8基因編碼囊泡谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(vesicular glutqmate transporter 3,VGLUT3),該蛋白將神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)到突觸小泡中,然后再釋放到突觸間隙[1]。Hoogduijn等[2]和Adameyko[3]研究顯示抑制谷氨酸受體會(huì)導(dǎo)致黑色素細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生轉(zhuǎn)變,并且黑色素細(xì)胞合成過程中的中央調(diào)控因子MITF(microphthalmia associated transription factor)表達(dá)量急劇下降,推斷SLC17A8可能與MITF具有相似的生物學(xué)功能。此外,在紫外線的照射下神經(jīng)元可導(dǎo)致谷氨酸大量合成[4],蘭坪烏骨綿羊主產(chǎn)區(qū)位于高原,常年接受強(qiáng)紫外線的照射,可誘導(dǎo)蘭坪烏骨綿羊大量合成谷氨酸[5],SLC17A8在神經(jīng)元內(nèi)編碼VGLUT3,推測(cè)SLC17A8與黑色素的合成密切相關(guān)。熊和麗[6]通過對(duì)蘭坪烏骨綿羊全基因組測(cè)序并與世界多個(gè)品種綿羊全基因組重測(cè)序數(shù)據(jù)(10818G)進(jìn)行聯(lián)合分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)蘭坪烏骨綿羊高密度遺傳變異圖譜顯示基因內(nèi)的突變主要在于內(nèi)含子變異,并且SLC17A8有15個(gè)SNP在蘭坪烏骨綿羊中具有高等位基因頻率,經(jīng)haploview分析,其中12個(gè)SNP高度連鎖,在蘭坪烏骨綿羊具有不同于蘭坪普通綿羊的優(yōu)勢(shì)單倍型[6](圖1)。目前對(duì)于蘭坪烏骨綿羊種質(zhì)的分子特征探究較少,大部分研究是從黑色素的合成路徑和酶調(diào)控位點(diǎn)入手探究蘭坪烏骨綿羊?yàn)踬|(zhì)性狀的形成機(jī)理[7-10]。本文利用PCR技術(shù)對(duì)蘭坪烏骨綿羊SLC17A8基因進(jìn)行擴(kuò)增,分析該基因的生物學(xué)特性,為后續(xù)SLC17A8在黑色素細(xì)胞的研究提供理論依據(jù)。

圖1 SLC17A8中15個(gè)SNP在蘭坪烏骨綿羊(A)及蘭坪普通綿羊(B)的單倍型[6]

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

本試驗(yàn)選取云南省蘭坪縣的蘭坪烏骨綿羊和普通綿羊(各50只)血液作為研究樣品。使用一次性真空采血管在綿羊頸部靜脈采血,置于冰盒中暫存運(yùn)輸,后置于-20 ℃冰箱保存待用。

1.2 主要試劑

Soluene-350(PerkinElmer公司);L-Dopa、酪氨酸酶(Sigma公司);蛋白酶K(Merck公司);RNase、ddH2O(北京天根生化科技有限公司);瓊脂糖、金牌MIX、DL2000 DNA Marker(昆明碩擎生物技術(shù)有限公司);ExRed核酸染料(北京莊盟國(guó)際生物基因科技有限公司)。

1.3 黑色素含量測(cè)定

采用光譜法分別測(cè)定[7]血液酪氨酸酶活力、脫黑色素含量、堿溶性黑色素含量、總黑色素含量、真黑色素與總黑色素的比值以及血漿比色。

1.4 基因組DNA的提取

采用血液基因組DNA純化試劑盒(Genmark公司)提取綿羊血液DNA,具體步驟參照試劑盒說明書。提取的DNA于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)綿羊3號(hào)染色體(NC_040254)上SLC17A8基因全長(zhǎng)序列,采用Premier premier 6.0軟件設(shè)計(jì)11對(duì)外顯子引物。SLC17A8基因11對(duì)引物序列信息見表1。

1.6 PCR擴(kuò)增

PCR反應(yīng)為25.0 μL反應(yīng)體系,其中含金牌MIX(green)22 μL、DNA模板(20 ng/μL)1 μL、上游和下游下引物(10 μmol/L)各1 μL。PCR反應(yīng)程序:98 ℃預(yù)變性2 min,98 ℃變性10 s,退火溫度見表1,退火10 s,72 ℃延伸10 s,30個(gè)循環(huán)后,72 ℃延伸1 min,4 ℃保存。PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳,成像分析儀檢測(cè)結(jié)果后送至昆明碩擎生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

表1 引物序列信息

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 黑色素含量測(cè)定結(jié)果

由表2可知,蘭坪烏骨綿羊血漿TYR活性顯著高于蘭坪普通綿羊(P<0.05)。綿羊類群、性別以及年齡對(duì)血漿TYR活性具有顯著影響(P<0.05),但是三者的兩兩互作效應(yīng)對(duì)TYR沒有顯著影響;脫黑色素含量?jī)烧卟町惒伙@著(P>0.05)。類群、性別、年齡以及三者間的兩兩互作效應(yīng)對(duì)血漿脫黑色素含量沒有顯著影響(P>0.05);堿溶性黑色素含量蘭坪烏骨綿羊低于蘭坪普通綿羊(P<0.05)。類群和年齡對(duì)血漿中堿溶性黑色素含量有顯著影響(P<0.05),性別以及三種互作效應(yīng)對(duì)其沒有顯著性影響(P>0.05);總黑色素兩者差異不顯著;真黑色素與總黑色素的比例蘭坪烏骨綿羊顯著高于蘭坪普通綿羊(P<0.05)。除類群外,其余指標(biāo)對(duì)真黑色素/總黑色素均無(wú)顯著性影響;血漿比色蘭坪烏骨綿羊顯著高于蘭坪普通綿羊(P<0.05)。

表2 蘭坪烏骨綿羊與普通綿羊黑色素含量的比較及相關(guān)影響因素的方差分析

2.2 SNP位點(diǎn)的篩選

2.2.1SLC17A8基因PCR擴(kuò)增 如圖2所示,電泳片段與預(yù)期結(jié)果一致,測(cè)序后所得11對(duì)引物擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小分別是297、484、392、377、425、458、594、503、505、466、599 bp,將11段序列與引物源序列進(jìn)行比對(duì)以及序列拼接,獲得外顯子總長(zhǎng)度為1 770 bp的序列。

圖2 蘭坪烏骨綿羊SLC17A8基因外顯子擴(kuò)增電泳圖

2.2.2 PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果 測(cè)序結(jié)果SLC17A8-EX3、SLC17A8-EX5、SLC17A8-EX6、SLC17A8-EX8、SLC17A8-EX9、SLC17A8-EX10的片段與綿羊(NC_040254)DNA序列比對(duì)相似性100%;SLC17A8-EX1與其相似性98.02%,此段序列共2個(gè)多態(tài)位點(diǎn)(C139T、G159A);SLC17A8-EX2與其相似性98.80%,此段序列總共3個(gè)多態(tài)位點(diǎn)(G87A、A150C、C161A);SLC17A8-EX4與其相似性98.26%,此段序列共2個(gè)多態(tài)位點(diǎn)(C149T、T158C);SLC17A8-EX7與其相似性98.57%,該段序列共2個(gè)多態(tài)位點(diǎn)(C181T、T195C);SLC17A8-EX11與其相似性99.22%,該段序列多態(tài)位點(diǎn)為T271C;SLC17A8-EX12與其相似性99.71%,該段序列多態(tài)位點(diǎn)為C173T。

整個(gè)片段共11個(gè)突變位點(diǎn),其中EX1的第2個(gè)突變位點(diǎn)(G159A)和EX2的第1個(gè)位點(diǎn)(G87A)為錯(cuò)義突變,其余突變位點(diǎn)均為同義突變。G159A位點(diǎn)編碼的氨基酸由Gly突變到Glu;G87A位點(diǎn)編碼的氨基酸由Gly突變到Arg。

2.2.3SLC17A8基因多態(tài)性 蘭坪烏骨綿羊與蘭坪普通綿羊11個(gè)多態(tài)位點(diǎn)的基因型頻率和等位基因頻率如表3所示。

表3 綿羊SLC17A8基因多態(tài)位點(diǎn)基因型及等位基因頻率

2.2.4SLC17A8基因多態(tài)性與烏質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)性分析 烏骨綿羊的烏質(zhì)性狀主要通過黑色素含量指標(biāo)進(jìn)行量化,將11個(gè)多態(tài)位點(diǎn)的基因型與黑色素指標(biāo)進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析,結(jié)果見表4。

表4 SLC17A8基因多態(tài)性與蘭坪烏骨綿羊?yàn)踬|(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)分析

將SLC17A8基因多態(tài)位點(diǎn)與蘭坪烏骨綿羊?yàn)踬|(zhì)性狀關(guān)聯(lián)分析,結(jié)果顯示在蘭坪烏骨綿羊的不同位點(diǎn)(除EX2-C161A)不同基因型間綿羊酪氨酸酶活性具顯著差異,其中EX1-C139T位點(diǎn)上CC型綿羊真黑色素/總黑色素指標(biāo)含量顯著高于CT型綿羊,EX1-G159A位點(diǎn)上GG型綿羊血漿比色顯著高于GA型綿羊。在相同基因型不同綿羊類群間,所有位點(diǎn)不同類群綿羊間真黑色素/總黑色素指標(biāo)具有顯著差異(P<0.05)(除EX1-C139T位點(diǎn)上CT型綿羊)。其中EX1-C139T位點(diǎn)上CC型蘭坪烏骨綿羊酪氨酸酶活性和堿溶性黑色素含量顯著高于普通綿羊(P<0.05);EX1-G159A位點(diǎn)上GA型蘭坪烏骨綿羊脫黑色素、堿溶性黑色素和酪氨酸酶活力以及GG型堿溶性黑色素和血漿比色顯著高于普通綿羊(P<0.05);EX2-G87A位點(diǎn)上GG型堿溶性黑色素以及AA型脫黑色素、血漿比色和酪氨酸酶活性顯著高于普通綿羊(P<0.05);EX2-A150C位點(diǎn)上AA型蘭坪烏骨綿羊脫黑色素和血漿比色以及酪氨酸酶活力顯著高于普通綿羊(P<0.05);EX4-C149T位點(diǎn)和EX4-T158C位點(diǎn)上CC型和CT型血漿比色以及CC型酪氨酸酶活力顯著高于普通綿羊(P<0.05);EX7-C181T位點(diǎn)上CC型蘭坪烏骨綿羊堿溶性黑色素含量顯著高于普通綿羊(P<0.05);EX7-T195C位點(diǎn)上TT型和EX11-T271C位點(diǎn)上CC型蘭坪烏骨綿羊酪氨酸酶活力和血漿比色指標(biāo)顯著高于普通綿羊(P<0.05);EX12-C173T位點(diǎn)上CC型和CT型蘭坪烏骨綿羊血漿比色以及CT型堿溶性黑色素顯著高于普通綿羊(P<0.05),其他指標(biāo)差異均不顯著(P>0.05)。

3 討 論

3.1 蘭坪烏骨綿羊與普通綿羊血液黑色素含量分析

黑色素是蘭坪烏骨綿羊體內(nèi)重要的功能成分,黑色素的光保護(hù)作用、富集微量元素、增強(qiáng)機(jī)體抵抗力等功能都將促進(jìn)蘭坪烏骨綿羊藥用價(jià)值和食用價(jià)值的發(fā)掘[11]。高含量的真黑色素是烏骨綿羊?yàn)踬|(zhì)性狀形成的直接原因[12],真黑色素的產(chǎn)生依賴于高水平的TYR活力,若TYR活力相對(duì)較低,則趨于脫黑色素的產(chǎn)生,故蘭坪烏骨綿羊機(jī)體具有相對(duì)較高的真黑色素含量,真黑色素與總黑色素比例也較高,綿羊血漿中真黑色素與總黑色素比例會(huì)直接影響血漿比色[13]。因此,分析綿羊TYR活力、真黑色素和總黑色素比例、血漿比色等指標(biāo)也具有理論依據(jù)。真黑色素最后通過黑色素細(xì)胞產(chǎn)生再通過血液運(yùn)輸?shù)礁鹘M織器管,最后形成促使烏骨綿羊?yàn)踬|(zhì)性狀的產(chǎn)生。但目前關(guān)于動(dòng)物烏質(zhì)性狀的形成機(jī)理尚不明晰,其形成機(jī)理是培育更加優(yōu)良的蘭坪烏骨綿羊亟待解決的問題。

通過測(cè)定分析發(fā)現(xiàn),除總黑色素和脫黑色素外蘭坪烏骨綿羊的TYR活力、真黑色素/總黑色素、血漿比色等生化指標(biāo)值均顯著高于普通綿羊。烏骨綿羊血漿中TYR活力、真黑色素/總黑色素、血漿比色分別為377.010±21.910 IU/mL、0.320±0.010、0.089±0.007 OD/mL,顯著高于普通綿羊的321.522±10.702 U/mL、0.251±0.004、0.071±0.035 OD/mL。

3.2 位點(diǎn)突變對(duì)蛋白功能的影響

本試驗(yàn)通過擴(kuò)增SLC17A8基因的外顯子區(qū),在其外顯子上共找到11個(gè)突變位點(diǎn),其中EX1 G159A和EX2 G87A為錯(cuò)義突變,其余突變位點(diǎn)均為同義突變。G159A位點(diǎn)編碼的氨基酸由Gly突變到Glu;G87A位點(diǎn)編碼的氨基酸由Gly突變到Arg。核苷酸序列的改變會(huì)在mRNA水平上擾亂了相應(yīng)區(qū)域的外顯子剪接增強(qiáng)子基因序列,導(dǎo)致外顯子剪接增強(qiáng)子不能被調(diào)控因子所識(shí)別,使得相應(yīng)的蛋白出現(xiàn)截短,從而導(dǎo)致疾病的發(fā)生,且基因突變對(duì)蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)及功能結(jié)構(gòu)域起著至關(guān)重要的作用[14]。吳宣富等[15]采用PCR-SSCP和DNA測(cè)序技術(shù),檢測(cè)20例有家族史的有先兆和無(wú)先兆偏頭痛患者,結(jié)果G2094A基因突變可能通過轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后翻譯以及翻譯后加工等多環(huán)節(jié)中的某步驟影響蛋白質(zhì)的表達(dá),從而導(dǎo)致偏頭痛的發(fā)生。Komar等[16]研究發(fā)現(xiàn),MDRI基因的C3435T位點(diǎn)突變導(dǎo)致機(jī)體合成了不同結(jié)構(gòu)和功能特性的蛋白質(zhì)。秦丹卿等[17]對(duì)攜帶β-地中海貧血基因孕婦患者進(jìn)行基因診斷,首次鑒定出一種突變類型CD29,該基因突變類型具有高度的地域異質(zhì)性。這與蘭坪烏骨綿羊和其他綿羊種群所處的地域差異一致,雖目前尚未關(guān)于蘭坪烏骨綿羊?yàn)踬|(zhì)性狀的產(chǎn)生與地域異質(zhì)性的關(guān)聯(lián)報(bào)道,但這對(duì)于進(jìn)一步研究蘭坪烏骨綿羊?yàn)踬|(zhì)性狀的產(chǎn)生機(jī)理具有重要的指導(dǎo)意義。

3.3 SLC17A8基因多態(tài)性與蘭坪烏骨綿羊?yàn)踬|(zhì)性狀關(guān)聯(lián)分析

前人研究表明SLC17A8基因編碼的VGLUT3蛋白在嚙齒類動(dòng)物和人類視網(wǎng)膜無(wú)軸突細(xì)胞[18]、小鼠的肝臟、腎臟均有表達(dá)[19-21];VGLUT3位于毛細(xì)胞突觸囊泡膜上,對(duì)L-谷氨酸(底物)有著非常強(qiáng)的特異性,L-谷氨酸能特異將谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)至突觸后膜,產(chǎn)生動(dòng)作電位,達(dá)到傳遞聽覺信號(hào)的作用[22]。Obholzer等[23]以斑馬魚為研究對(duì)象,利用敲除技術(shù)將SLC17A8基因外顯子2敲除,發(fā)現(xiàn)外顯子2的缺失導(dǎo)致mRNA編碼的VGLUT3蛋白數(shù)量減少,引起神經(jīng)傳遞過程中突觸小泡數(shù)量不足,在一級(jí)神經(jīng)元的前提下無(wú)法產(chǎn)生動(dòng)作電位,最終導(dǎo)致聽覺信號(hào)傳導(dǎo)失敗。Fremeau等[24]對(duì)小鼠進(jìn)行免疫組織熒光分析,結(jié)果顯示SLC17A8蛋白在中樞神經(jīng)系統(tǒng)廣泛表達(dá)。SLC17A8基因突變主要通過引起Glu的釋放減少,進(jìn)而引起相應(yīng)的疾病。蘭坪烏骨綿羊由于生長(zhǎng)于高原地區(qū)常年接受紫外線的照射而產(chǎn)生大量的Glu,但SLC17A8基因是否對(duì)蘭坪烏骨綿羊黑色素的形成機(jī)理產(chǎn)生影響還需要進(jìn)一步深入研究。

將蘭坪烏骨綿羊與普通綿羊SLC17A8基因的11個(gè)多態(tài)位點(diǎn)的基因型與血漿中黑色素含量指標(biāo)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析,結(jié)果顯示在蘭坪烏骨綿羊的不同基因型間EX1-G139A位點(diǎn)上CC型綿羊酪氨酸酶活性和真黑色素/總黑色素指標(biāo)顯著高于CT型綿羊;EX1-G159A位點(diǎn)上GG型綿羊血漿比色顯著高于GA型綿羊,但酪氨酸酶活力顯著低于GA型綿羊;EX2-C87A位點(diǎn)上AA型綿羊酪氨酸酶活力顯著高于GG型和GA型綿羊,GG型綿羊堿溶性黑色素顯著高于GA型;EX2-C161A位點(diǎn)上AA型綿羊脫黑色素含量顯著高于AC型綿羊;EX4-C149T位點(diǎn)和EX4-T158C位點(diǎn)上三種基因型酪氨酸酶活力差異顯著,其中CT基因型最高;EX7-C181T位點(diǎn)和EX7-T195C位點(diǎn)上TT型綿羊酪氨酸酶活力顯著高于CC型和CT型綿羊。因此,CC、AA、CT和TT型為蘭坪烏骨綿羊的優(yōu)勢(shì)基因型。

綜上所述,SLC17A8基因的11個(gè)多態(tài)位點(diǎn)的突變可能影響機(jī)體內(nèi)部糖蛋白的構(gòu)象,因此可以推測(cè)SLC17A8基因的突變可能通過影響SLC17A8蛋白的構(gòu)象而對(duì)SLC17A8蛋白功能造成影響,解除了SLC17A8對(duì)黑色素細(xì)胞的分化、分裂及轉(zhuǎn)移的抑制作用,導(dǎo)致黑色素細(xì)胞不僅僅是遷移至皮膚、毛發(fā)等部位,而是通過遷移到達(dá)機(jī)體各組織器官,進(jìn)而使得黑色素在烏骨綿羊各組織中均有表達(dá),導(dǎo)致烏骨綿羊呈現(xiàn)出烏質(zhì)性狀,具體的影響機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

蘭坪烏骨綿羊TYR活力、血漿比色、真黑色素/總黑色素指標(biāo)顯著高于普通綿羊,但堿溶性黑色素含量顯著低于普通綿羊(P<0.05);蘭坪烏骨綿羊SLC17A8基因編碼區(qū)序列長(zhǎng)1 770 bp,編碼589個(gè)氨基酸,共發(fā)現(xiàn)11個(gè)突變位點(diǎn),其中外顯子1的G159A和外顯子2的G87A為錯(cuò)義突變,其余突變位點(diǎn)均為同義突變。G159A位點(diǎn)編碼的氨基酸由Gly突變到Glu,G87A位點(diǎn)編碼的氨基酸由Gly突變到Arg;蘭坪烏骨綿羊與普通綿羊混合群體基因分布存在顯著差異(P<0.05),CC、AA、CT和TT型為蘭坪烏骨綿羊的優(yōu)勢(shì)基因型。

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