張牛牛 魏巴金 李成志 傅佩芬 代志軍

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一。數(shù)據(jù)表明，乳腺癌在全球女性惡性腫瘤中占比24.2%，居女性惡性腫瘤的首位，而且發(fā)病率有逐年上升趨勢，對女性的身心健康造成了嚴(yán)重的影響[1-2]。乳腺癌新輔助化療是指患者在接受外科手術(shù)前行化療的方法，常應(yīng)用于局部晚期或有降級保乳意愿的患者。術(shù)前對乳腺癌患者行新輔助化療，可以縮小腫瘤體積降低分期，從而增加手術(shù)切緣陰性以及獲得病理完全緩解（pathological complete remission,pCR）的可能性。有研究表明，在新輔助化療后獲得pCR的患者可能比沒有獲得pCR的患者存活更長的時間[3]。然而，臨床發(fā)現(xiàn)新輔助化療仍對很大一部分乳腺癌患者無效。因此，探索預(yù)測乳腺癌患者對新輔助化療有無反應(yīng)并能否受益于新輔助化療的生物標(biāo)志物有重要意義。雌激素受體（estrogen receptor,ER）、孕激素受體（progesterone receptor,PR）與新輔助化療之間的關(guān)系已有較多的研究。p63是p53的家族成員，在誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯、細(xì)胞衰老、細(xì)胞凋亡及細(xì)胞分化中發(fā)揮重要作用。p63陽性表達(dá)的乳腺癌患者術(shù)后pCR率高于p63陰性表達(dá)者[4]。Ki-67是一種與細(xì)胞周期密切相關(guān)的核蛋白，代表著腫瘤的增殖程度（以增殖指數(shù)表示），增殖指數(shù)越高，乳腺癌患者的預(yù)后越差[5]。因此，p63與Ki-67與乳腺癌的預(yù)后相關(guān)[6]。本研究通過分析p63與Ki-67在乳腺癌患者新輔助化療前后的表達(dá)變化，探討其與患者新輔助化療療效的關(guān)系，現(xiàn)報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2015年1月至2021年6月在浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院住院治療的乳腺癌患者202例。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）臨床病理資料完整；（2）女性患者；（3）化療前均經(jīng)病理穿刺活檢確診浸潤性導(dǎo)管癌，且無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；（4）符合新輔助化療適應(yīng)證，且無化療禁忌證。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）雙側(cè)乳腺癌；（2）妊娠期乳腺癌；（3）炎性乳腺癌；（4）有乳腺癌病史者；（5）曾經(jīng)接受過放療、化療、靶向治療以及內(nèi)分泌治療者?；颊吣挲g30～76歲，中位年齡50歲；≤50歲110例，＞50歲92例；絕經(jīng)前105例，絕經(jīng)后97例；化療前腫瘤直徑＞5 cm 22例，≤5 cm 180例；區(qū)域淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移40例，有轉(zhuǎn)移162例；分子分型Luminal A型16例，Luminal B型47例，人表皮生長因子受體-2（human epidermal growth factor receptor-2,Her-2）陽性、激素受體（hormone receptor,HR）陽性50例，Her-2陽性、HR陰性38例，Basal-like型51例。

1.2 治療方法 患者根據(jù)不同的分子分型及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等情況，采取合適的新輔助化療方案。主要化療方案為EC-T（表柔比星90 mg/m2+環(huán)磷酰胺600 mg/m2，序貫多西他賽100 mg/m2，21 d）和AC-T（多柔比星脂質(zhì)體35 mg/m2+環(huán)磷酰胺600 mg/m2，序貫多西他賽100 mg/m2，21 d）。Her-2陽性的患者同時進(jìn)行H（曲妥珠單抗，首劑8 mg/kg，之后6 mg/kg，21 d）、P（帕妥珠單抗，首劑840 mg，之后420 mg，21 d）共計1年的靶向治療。新輔助化療期間患者定期復(fù)查乳腺B超、肝膽脾胰B超、肺部CT、腫瘤標(biāo)志物等指標(biāo)，以了解腫瘤的緩解情況。所有患者完成新輔助化療，并在新輔助化療期間或新輔助化療結(jié)束后行乳腺癌保乳根治術(shù)或乳腺癌改良根治術(shù)。

1.3 新輔助化療前后乳腺癌組織p63、Ki-67表達(dá)情況檢測 采用免疫組化法。分別將患者化療前穿刺活檢或術(shù)后從手術(shù)切除標(biāo)本中所取的乳腺癌組織常規(guī)制備石蠟組織切片，厚度為4 μm，經(jīng)脫蠟、水化，常規(guī)進(jìn)行免疫組化染色。p63、Ki-67檢測試劑均為鼠抗人單克隆抗體（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），操作步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。p63、Ki-67染色陽性細(xì)胞為細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒。p63表達(dá)情況按照癌細(xì)胞陽性百分率評判：無陽性細(xì)胞為陰性，陽性細(xì)胞＜25%為+，25%～50%為++，＞50%為+++，+～+++為陽性。Ki-67表達(dá)情況也按照癌細(xì)胞陽性百分率評判：陽性細(xì)胞＜15%為低表達(dá)，≥15%為高表達(dá)。

1.4 pCR評判標(biāo)準(zhǔn) 根據(jù)《中國抗癌協(xié)會乳腺癌診治指南與規(guī)范（2021年版）》，術(shù)后病理檢查乳腺癌原發(fā)灶無浸潤性癌（可存在導(dǎo)管原位癌）且區(qū)域淋巴結(jié)陰性視為pCR。

1.5 觀察指標(biāo) （1）分析新輔助化療前患者乳腺癌組織p63、Ki-67表達(dá)情況與臨床病理特征、術(shù)后pCR的關(guān)系；（2）比較新輔助化療前后患者乳腺癌組織p63、Ki-67表達(dá)情況；（3）分析新輔助化療前后患者乳腺癌組織p63表達(dá)變化與pCR、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 24.0統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料以頻數(shù)和構(gòu)成比表示，組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 新輔助化療前患者乳腺癌組織p63、Ki-67表達(dá)情況與臨床病理特征的關(guān)系分析 新輔助化療前患者乳腺癌組織p63表達(dá)情況與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P＜0.05），與年齡、月經(jīng)狀態(tài)、腫瘤大小、分子分型均無關(guān)（均P＞0.05）；Ki-67表達(dá)情況與分子分型有關(guān)（P＜0.05），與年齡、月經(jīng)狀態(tài)、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無關(guān)（均P＞0.05）。見表1。

表1 新輔助化療前患者乳腺癌組織p63、Ki-67表達(dá)情況與臨床病理特征的關(guān)系分析[例（%）]

2.2 新輔助化療前患者乳腺癌組織p63、Ki-67表達(dá)情況與pCR的關(guān)系 新輔助化療前，乳腺癌組織p63表達(dá)陽性和表達(dá)陰性患者pCR率分別為53.8%（14/26）和32.4%（57/176），p63表達(dá)陽性患者高于表達(dá)陰性患者（P＜0.05）；Ki-67高表達(dá)和低表達(dá)患者pCR率分別為36.9%（69/187）和13.3%（2/15），差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.3 新輔助化療后患者乳腺癌組織p63表達(dá)情況 對化療后仍然在病理報告上存在p63檢測結(jié)果的114例患者（202例患者中41例患者獲得pCR，4例患者病理Miller-Payne 5級而未進(jìn)行p63檢測）進(jìn)行分析，結(jié)果顯示患者乳腺癌組織p63表達(dá)陽性率由化療前的11.4%（13/114）上升到化療后的40.4%（46/114）。

2.4 新輔助化療后患者乳腺癌組織Ki-67表達(dá)情況對化療后仍然在病理報告上存在Ki-67檢測結(jié)果的134例患者（202例患者中54例患者獲得pCR，4例患者病理Miller-Payne 5級而未進(jìn)行Ki-67檢測）進(jìn)行分析，結(jié)果顯示患者乳腺癌組織Ki-67低表達(dá)率由化療前的9.0%（12/134）上升到化療后的46.3%（62/134）。

2.5 新輔助化療后患者乳腺癌組織p63表達(dá)變化與pCR的關(guān)系 新輔助化療后乳腺癌組織p63表達(dá)陰性轉(zhuǎn)陽性的患者術(shù)后pCR率＞p63表達(dá)陽性不變的患者＞p63表達(dá)陰性不變的患者＞p63表達(dá)陽性轉(zhuǎn)陰性的患者（均P＜0.05）。見表2。

表2 新輔助化療后患者乳腺癌組織p63表達(dá)變化與pCR的關(guān)系[例（%）]

2.6 新輔助化療后患者乳腺癌組織p63表達(dá)變化與區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系 從新輔助化療后病理報告上存在p63檢測結(jié)果的114例患者中，選出新輔助化療前區(qū)域淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移的患者91例進(jìn)行統(tǒng)計分析。結(jié)果顯示新輔助化療后乳腺癌組織p63表達(dá)陰性轉(zhuǎn)陽性的患者區(qū)域淋巴結(jié)陽性轉(zhuǎn)陰性率＞p63表達(dá)陽性不變患者＞p63表達(dá)陰性不變患者＞p63表達(dá)陽性轉(zhuǎn)陰性患者（均P＜0.05）。見表3。

表3 新輔助化療后患者乳腺癌組織p63表達(dá)變化與區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系[例（%）]

3 討論

新輔助化療能夠使乳腺癌患者的腫瘤縮小，降低分期，利于手術(shù)，使患者可以行保乳手術(shù)。同時，新輔助化療有助于了解腫瘤對化療藥物的敏感性，為進(jìn)一步化療提供有價值的療效預(yù)測依據(jù)，避免可能的無效化療。在乳腺癌新輔助化療中，取得pCR的患者比未取得pCR的患者能夠獲得更好的預(yù)后。

Ki-67是一種核蛋白，與細(xì)胞的增殖有關(guān)，在細(xì)胞周期的S期、G1期、G2期和M期均有表達(dá)，但是在不同的周期中表達(dá)并不同，在M期達(dá)到峰值[7]。在乳腺癌患者中，Ki-67高表達(dá)與較差的生存率及預(yù)后相關(guān)[8]。因此，可以通過新輔助化療前后Ki-67表達(dá)的變化來評估新輔助化療的效果。本研究結(jié)果顯示，新輔助化療后，乳腺癌組織Ki-67低表達(dá)率明顯升高，由化療前的9.0%上升到化療后的46.3%。這表明新輔助化療可以明顯降低Ki-67高表達(dá)乳腺癌患者的增殖指數(shù)。新輔助化療對增殖活躍的腫瘤細(xì)胞有顯著的殺傷作用。同時，在新輔助化療前Ki-67高表達(dá)患者術(shù)后pCR率為36.9%，高于低表達(dá)患者的13.3%。這表明Ki-67高表達(dá)的乳腺癌患者對新輔助化療更為敏感。

p63基因位于染色體3q27-29上，由15個外顯子組成，大小約220 kB，內(nèi)含子長度達(dá)100 kB[9]，是p53的家族成員。其基因產(chǎn)物對于維持幾種上皮組織中的干細(xì)胞群至關(guān)重要，并且對于包括乳腺在內(nèi)的上皮器官的正常發(fā)育是必需的[10]。在乳腺形態(tài)發(fā)育的早期階段，患者的乳腺可能暴露于某些外部或內(nèi)部損傷中，這些損傷可能對某些原始干細(xì)胞的DNA結(jié)構(gòu)造成永久性損傷。這些DNA結(jié)構(gòu)損傷導(dǎo)致了更新肌上皮細(xì)胞的相關(guān)基因失活或缺陷，損傷了肌上皮細(xì)胞的補充過程，以至于無法取代老化或損傷的肌上皮細(xì)胞，導(dǎo)致肌上皮細(xì)胞群的“衰老”，造成p63的表達(dá)顯著降低[11]。p63的表達(dá)在乳腺癌的進(jìn)展中是一個逐步缺失的過程。其在正常的乳腺組織中完全表達(dá)，導(dǎo)管原位癌中幾乎全部表達(dá)，浸潤性導(dǎo)管癌中大部分缺失[12]。因此，p63的表達(dá)缺失與乳腺癌的進(jìn)展有關(guān)。在乳腺癌患者中，p63表達(dá)陽性者能夠獲得更好的預(yù)后[13]。既往研究發(fā)現(xiàn)，與p63表達(dá)陰性的乳腺癌患者相比，化療前p63表達(dá)陽性的乳腺癌患者在新輔助化療后能夠獲得更高的pCR率[14]。

本研究患者中，化療前p63表達(dá)陽性的患者區(qū)域淋巴結(jié)陽性率為65.4%（17/26），p63表達(dá)陰性的患者區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率為82.4%（145/176）。這提示在浸潤性導(dǎo)管癌中，p63表達(dá)陰性的患者更容易出現(xiàn)區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移?；熐皃63表達(dá)陽性的患者術(shù)后pCR率為53.8%，高于p63表達(dá)陰性患者（32.4%）。這表明p63表達(dá)陽性的乳腺癌患者更容易獲得pCR。在新輔助化療前后，p63表達(dá)陽性率由化療前的11.4%上升到化療后的40.4%。這說明經(jīng)過新輔助化療后，部分乳腺癌患者獲得了更好的預(yù)后?；熀髉63表達(dá)陰性轉(zhuǎn)陽性的患者術(shù)后pCR率為59.5%，區(qū)域淋巴結(jié)陽性轉(zhuǎn)陰性率為72.4%；p63表達(dá)陽性不變的患者pCR率為44.4%，區(qū)域淋巴結(jié)陽性轉(zhuǎn)陰性率為50%，顯著高于其他患者。這進(jìn)一步說明新輔助化療后p63表達(dá)陽性的乳腺癌患者獲得了更好的預(yù)后。

綜上所述，在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中，p63表達(dá)陽性患者的區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率低，新輔助化療后pCR率高。化療后p63表達(dá)陽性的患者能夠獲得更好的預(yù)后。Ki-67高表達(dá)患者對化療更敏感。乳腺癌組織p63、Ki-67表達(dá)情況的分析對評估乳腺浸潤性導(dǎo)管癌患者的病情、新輔助化療的療效及預(yù)后有一定的價值。