李函倫，李澤涵，艾賽提·阿合旦，彭 昕，楊 凡，楊興元*

（1.新疆農業(yè)大學 食品科學與藥學學院，新疆 烏魯木齊 830052；2.新疆微生物學會，新疆 烏魯木齊 830091）

黑果腺肋花楸（Aronia melanocarpa）是一種新興小漿果果樹，為薔薇科腺肋花楸屬多年生落葉灌木，俗稱不老莓[1]。果實為紫黑色球形小漿果，口感酸澀[2]，果實中含有豐富的黃酮類和酚酸類物質，如原花青素、花青素、綠原酸等，具有較強的清除自由基和抗氧化活性的能力[3]，主要應用于釀酒、飲料、酵素等方面[4]，如干酒[5]、冰酒[6]、白蘭地[7]等。關于黑果腺肋花楸酒的揮發(fā)性香氣成分也有研究報道，魏春雨等[8]在添加不同酵母的黑果腺肋花楸酒中檢驗出77種揮發(fā)性物質，主要香氣成分包括乙酸乙酯、乙酸異戊酯等；毛建利等[9]檢測出黑果腺肋花楸酒中醇類物質含量最高，酯類物質對香氣貢獻最大，黑果腺肋花楸酒的主體香氣物質是大馬士酮、辛酸乙酯等。

波特酒是在葡萄酒發(fā)酵進行到一半時通過向基酒中添加葡萄蒸餾酒或白蘭地使酵母的活動被迫受到抑制來終止發(fā)酵，使酒精度升到16%vol以上[10]，得到酒精度較高的強化型葡萄酒，酒精發(fā)酵停止后保留的高殘?zhí)呛驮醋云咸颜麴s酒的大量高級醇、酯、醛賦予了波特酒獨特的風格[11-12]。MOREIRA N等[13]檢測出年份波特酒中部分羰基化合物含量高，如丙醛、戊醛等，并隨著年份的增長，其含量隨著木桶中的老化而增加。目前市場上常見的波特酒大多部分是用釀酒葡萄單一或混合釀造，未經加工的新鮮黑果腺肋花楸果實因具有澀味而很少直接用于鮮食，作為釀酒原料也存在苦澀味重，風味不明顯等問題。利用二者優(yōu)勢互補進行混釀，增進酒體的豐富性[14]，得到香氣馥郁的波特酒[15]。

頂空固相微萃取（headspace solid-phase microextraction，HS-SPME）結合全二維氣相色譜-飛行時間質譜（comprehensive two-dimensional gas chromatograph/time of flight mass spectrometry，GC×GC-TOF-MS）技術應用于分析白酒的揮發(fā)性組分較多，葡萄酒方面應用較少[16-17]，該技術具有分辨率高、靈敏度高、分離效果好等特點，是實現(xiàn)復雜樣品揮發(fā)性成分鑒定的有效工具[18]。

本研究以黑果腺肋花楸和赤霞珠為原料，在混合發(fā)酵過程中添加無核白、霞多麗、赤霞珠3種葡萄蒸餾酒終止酒精發(fā)酵，制備波特酒。采用頂空固相微萃?。℉S-SPME）結合全二維氣相色譜-飛行時間質譜（GC×GC-TOF-MS）技術測定3種黑果腺肋花楸赤霞珠波特酒的揮發(fā)性香氣成分，并對結果進行主成分分析（principal component analysis，PCA），對比3種黑果腺肋花楸赤霞珠波特酒的香氣特點，有助于增進對波特酒香氣特點的認識，為波特酒終止發(fā)酵添加的葡萄蒸餾酒的選擇提供科學依據(jù)。對開發(fā)特色加強型葡萄酒類新產品，在帶動葡萄酒產業(yè)發(fā)展具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑果腺肋花楸，采收于2022年8月：新疆睿洋農業(yè)有限公司；釀酒葡萄赤霞珠，采收于2022年9月：新疆伊犁產區(qū)；果膠酶RF（酶活40 000 U/g）、葡萄酒活性干酵母CY3079：上海兔杰工貿有限公司；偏重亞硫酸鉀（分析純）：北京奧博星生物技術有限責任公司；蔗糖、乙醇（均為分析純）：天津市致遠化學試劑有限公司；酒石酸（分析純）：天津市光復精細化工研究所；無核白、霞多麗、赤霞珠葡萄蒸餾酒（酒精度分別為64.03%vol、65.15%vol、61.10%vol）：實驗室2020年11月釀制。

1.2 儀器與設備

WYT-4 型手持糖度計：泉州中友光學儀器有限公司；LAL2T酒精濃度計：廣州市速為電子科技有限公司；JC-9320比重計：北京市宏海永昌儀表技術開發(fā)中心；LE203E/02分析天平：上海波博特勒-托利多儀器有限公司；7890A/Pegasus 4D全二維氣相色譜-飛行時間質譜聯(lián)用儀：美國LECO公司；7890A-5977MSD氣相色譜-質譜聯(lián)用儀、DB-WAX色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）、DB-17HT色譜柱（2.0 m×0.1 mm×0.1 μm）：美國安捷倫公司；DC-12型氮吹儀：上海安譜科學儀器有限公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取頭：美國色譜科公司。

1.3 方法

1.3.1 波特酒加工工藝流程及操作要點

黑果腺肋花楸、赤霞珠→除梗破碎→添加偏重亞硫酸鉀→添加果膠酶→調整成分→接種酵母→發(fā)酵→粗過濾→基酒→添加葡萄蒸餾酒終止發(fā)酵→過濾→灌裝→波特酒成品

操作要點：對黑果腺肋花楸、赤霞珠挑選并去除壞果，因波特酒發(fā)酵時間較短，為充分提取果實中的色素和單寧采取手動破碎的方法破碎果實，以黑果腺肋花楸與赤霞珠1∶0.8質量比混合裝于20 L不銹鋼發(fā)酵罐中。取少量蒸餾水將偏重亞硫酸鉀溶解加入靜置2 h后，添加果膠酶浸漬處理24 h，再向發(fā)酵液中添加蔗糖調節(jié)發(fā)酵液可溶性固形物含量為24°Bx，接種活化好的葡萄酒干酵母進行發(fā)酵；由于波特酒的工藝特點為在發(fā)酵進行至一半時終止發(fā)酵保持高含糖量，在發(fā)酵至43 h，其酒精度達7.50%vol時進行粗濾，得到黑果腺肋花楸與赤霞珠混釀基酒，再向基酒中分別加入體積分數(shù)為28%的無核白、霞多麗、赤霞珠葡萄蒸餾酒來抑制酵母活性從而終止酒精發(fā)酵，由于此時含有較多的二氧化碳，靜置24 h后用八層紗布進行過濾，灌裝后置于0 ℃冷庫保存，得到添加無核白、霞多麗、赤霞珠葡萄蒸餾酒的3種黑果腺肋花楸赤霞珠波特酒，分別編號為WHB、XDL、CXZ。

1.3.2 理化指標的檢測

波特酒的酒精度、總酸、揮發(fā)酸、還原糖、pH等理化指標根據(jù)國標GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[19]規(guī)定的方式執(zhí)行。

1.3.3 揮發(fā)性香氣成分測定

（1）頂空固相微萃取條件

新購買的萃取頭先按照說明書在GC進樣口270 ℃條件下活化1 h，使用前在GC進樣口250 ℃條件下解吸8 min，以除去吸附的揮發(fā)性物質。取5 mL樣品加1 g NaCl于頂空瓶中，加蓋密封，使用萃取頭DVB/CAR/PDMS對頂空瓶中的樣品進行萃取。上機檢測插入GC進樣口，平衡時間15 min，萃取溫度40 ℃，萃取時間30 min，解吸附時間5 min。

（2）氣相色譜條件

進樣口溫度250 ℃；分流比5∶1；載氣為氦氣（H2）（純度99.999%）；流量1 mL/min；柱溫40 ℃保持1 min；以5 ℃/min升至130 ℃，以2 ℃/min升至160 ℃；以20 ℃/min升至240 ℃，保持7 min。二維柱溫：始終高于第一維柱10 ℃調制解調器溫度：始終高于第二維柱15 ℃；調制周期5 s；傳輸線溫度270 ℃。樣品運行采用恒流模式，載氣為氦氣（He）（純度99.999%），流量1 mL/min。

（3）飛行質譜條件

電離方式為電子電離（electronic ionization，EI）源，電子能量為70 eV，溫度為230 ℃，傳輸線溫度為270 ℃。離子源溫度：220 ℃；檢測器電壓：1 680 V；質量掃描范圍：30～500 amu。采集頻率為100 spectra/s。

（4）定性定量方法

根據(jù)美國國家標準技術研究所（national institute of standards and technology，NIST）2014版質譜數(shù)據(jù)庫鑒定得到的化合物，采用峰面積歸一化法計算各成分的相對含量。參照ZHU S K等[20]篩選相似度＞80%的化合物作為初步鑒定結果，包括化合物名稱、一維保留時間、相似度、化合物、峰面積和分子式等信息。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

采用MicrosoftOfficeExcel2016對數(shù)據(jù)進行整理，Origin 2021進行繪圖，SPSS19.0進行顯著性檢驗（P＜0.05）及主成分分析。

2 結果與分析

2.1 波特酒酒樣理化指標檢測結果

3種黑果腺肋花楸赤霞珠波特酒酒樣理化指標檢測結果見表1。由表1可知，三款波特酒酒精度20.083%vol～20.63%vol，按制作工藝劃分屬特種葡萄酒；還原糖含量均＞45.0 g/L，按含糖量劃分屬甜型酒；總酸含量6.26～6.74 g/L，揮發(fā)酸含量0.45～0.71 g/L，各項理化指標均符合國標GB/T 15037—2006《葡萄酒》[21]規(guī)定要求。添加不同品種葡萄蒸餾酒波特酒的酒精度無顯著性差異（P＞0.05），霞多麗蒸餾酒的酒精度在三種葡萄蒸餾酒中最高，故添加XDL波特酒的酒精度最高為20.63%vol。WHB和XDL波特酒的總酸和pH無顯著差異（P＞0.05），但均顯著低于CXZ波特酒（P＜0.05）。揮發(fā)酸主要是由酒精發(fā)酵，蘋果酸-乳酸發(fā)酵，細菌污染引起的酸敗引起[22]，XDL波特酒揮發(fā)酸含量低于其他兩種，由于霞多麗葡萄蒸餾酒度數(shù)在三者之間較高，在終止發(fā)酵過程中較于其他兩種蒸餾酒更快的延緩基酒中微生物活動[23]。3種波特酒的還原糖含量無顯著差異（P＞0.05）。綜上，根據(jù)理化指標分析得到CXZ波特酒較好。

表1 3種黑果腺肋花楸赤霞珠波特酒酒樣理化指標Table 1 Physicochemical indexes of 3 kinds of Aronia melanocarpa and Cabernet Sauvignon port wine samples

2.2 揮發(fā)性香氣成分檢測結果

2.2.1 添加不同品種葡萄蒸餾酒的波特酒揮發(fā)性香氣成分分析

通過頂空固相微萃?。℉S-SPME）結合全二維氣相色譜-飛行時間質譜聯(lián)用儀（GC×GC-TOF-MS）對黑果腺肋花楸赤霞珠波特酒中香氣成分進行檢測和分析，3種黑果腺肋花楸赤霞珠波特酒中揮發(fā)性香氣成分相對含量測定結果見表2。由表2可知，在3款波特酒中共檢出68種揮發(fā)性香氣化合物，其中酯類25種、醇類21種、酸類7種、酮類6種、醛類4種、其他5種。WHB波特酒共檢出揮發(fā)性物質50種，XDL波特酒共檢出的揮發(fā)性物質49種，CXZ波特酒共檢出的揮發(fā)性物質51種。

表2 3種黑果腺肋花楸赤霞珠波特酒酒樣香氣成分相對含量檢測結果Table 2 Determination results of relative contents of aroma components in 3 kinds of Aronia melanocarpa and Cabernet Sauvignon port wine samples

續(xù)表

3種黑果腺肋花楸赤霞珠波特酒酒樣揮發(fā)性香氣物質種類和相對含量結果見圖1。由圖1可知，WHB波特酒檢測出的主要揮發(fā)性物質共有50種，其中酯類15種、醇類18種、酸類6種，醛類3種、酮類5種、其他物質3種，分別占總揮發(fā)性香氣成分的35.62%、52.92%、3.51%、4.03%、2.92%、1.00%。XDL波特酒檢測出的主要揮發(fā)性物質共有49種，其中酯類19種、醇類18 種、酸類2種，醛類3種、酮類4種、其他物質3種，分別占總揮發(fā)性香氣成分的34.89%、56.72%、1.32%、4.50%、1.42%、1.15%。CXZ波特酒檢測出的主要揮發(fā)性物質共有51種，其中酯類15種、醇類18種、酸類6種，醛類3種、酮類5種、其他物質4種，分別占總揮發(fā)性香氣成分的29.54%、56.32%、1.83%、6.09%、2.80%、3.42%。3種波特酒共存在34種相同的香氣化合物，如乙酸乙酯、異戊醇、癸酸乙酯等。

圖1 3種黑果腺肋花楸赤霞珠波特酒酒樣揮發(fā)性香氣物質種類（a）和相對含量（b）Fig.1 Types (a) and relative contents (b) of volatile aroma components in 3 kinds of Aronia melanocarpa and Cabernet Sauvignon port wine samples

2.2.2 添加不同品種葡萄蒸餾酒的波特酒揮發(fā)性香氣成分比較

波特酒中的醇類物質來源于兩個方面，一方面是基酒在發(fā)酵過程中由微生物作用于糖、果膠質、氨基酸產生的，一方面是通過添加葡萄蒸餾酒而賦予的高級醇，賦予了波特酒獨特的風格。醇是酒體的基本組成成分，又是酒的醇甜和助香物質。當酒中高級醇與酸類、酯類物質含量配比恰當，有助于酒的呈香，若過量會影響產品質量[28]。醇類物質多具有令人不愉快的香氣[29]，但在3款波特酒共有的主要醇類物質中大多是令人愉悅的香氣，2,3-丁二醇、苯甲醇等15種化合物，它們賦予了波特酒烘烤味、苦杏仁味、玫瑰花味、青草、吐司等風味。異戊醇屬高級醇，由表2可知，在WHB、XDL、CXZ波特酒中相對含量分別為16.35%、9.71%、13.09%，在醇類物質中除乙醇外相對含量最高，高級醇的生成通過酵母的氨基酸的異化作用[30]，也可通過糖的合成代謝經由氨基酸的合成代謝途徑生成，對呈香有重要作用，可提高酒的感官品質。苯乙醇作為典型的高級醇，由苯丙氨酸代謝產生，呈玫瑰香、茴香、梔子花香[31]等多樣風味。由圖2可知，在WHB、XDL、CXZ波特酒中共檢測出21種醇類物質，其種類以及相對含量存在一定差異，可能因為不同品種的葡萄蒸餾酒賦予了波特酒不同的高級醇[32]，高級醇在酒中的差異賦予了3款酒不一樣的特征。

酯類物質是波特酒揮發(fā)性成分的重要組成部分，也是主要呈香物質，增加了酒體的復雜性、多樣性和愉悅性[33]。酯是由醇和酸的酯化作用形成的，適量時能烘托主體香使酒體完美，使氣味趨于平衡方向[34]。對酒體的后味起緩沖作用，過多會抑制主體香。3款波特酒中共檢測出酯類物質25種，共有的酯類物質有10種，由表2可知，癸酸乙酯百分含量最高，具有梨香、似白蘭地酒香和果香；其次為乙酸乙酯、正己酸乙酯、乙酸異戊酯，具有菠蘿香、青蘋果香、花香、香蕉香，是黑果腺肋花楸赤霞珠波特酒中主要的酯類物質。辛酸乙酯、十三酸乙酯為WHB波特酒所特有的酯類物質，呈果香、蠟香。酯類物質的香氣物質種類和相對含量的不同，可能是造成3種波特酒香氣存在差別的主要原因。

酸類物質的主要貢獻是呈味作用和作為酯的前驅物質及穩(wěn)定劑作用，對香味的直接貢獻較小，酸是微生物在發(fā)酵階段共同作用的產物，可以賦予波特酒愉快的香氣[35]。由表2可知，WHB波特酒中的酸類物質相對含量最高的是丙酮酸，為2.15%，有果味。XDL和CXZ波特酒中相對含量最高的是乙酸，相對含量為1.08%和1.3%，乙酸可與醇類物質反應生成具有水果香的醋酸酯，增加酒體的發(fā)酵香，但需在其閾值范圍內，若超過閾值則說明酒樣被醋酸菌、乳酸菌污染，具有酸味等不愉快的氣味[33]。除此之外，XDL和CXZ波特酒中還共同檢測到了正葵酸和辛酸，辛酸的產生源自于葡萄發(fā)酵過程醛類物質的氧化，屬于低級脂肪酸，具有奶酪的氣味，并帶有粗澀的味感，對波特酒的整體具有協(xié)調作用。

在3款波特酒中共檢測出10種醛酮類物質，其中苯甲醛、乙醛、2,3-戊二酮、2,3-戊酮、2,3-丁二酮為共有的，它們賦予了波特酒杏仁、咖啡香、奶油味。雖然相對含量較低，但其香氣閾值較低，所以對波特酒的影響很大[36]，波特酒中的醛酮類物質可能來自于發(fā)酵原料水果本身，也可能來源于加強酒精時添加的葡萄蒸餾酒中，蒸餾酒在釀造過程和陳釀期間由其他物質結合得到。波特酒中的醛酮類物質通過與其他香氣物質共同作用，從而對波特酒整體香氣起到平衡或改善的作用。

3款波特酒的香氣成分種類和相對含量存在差異，WHB波特酒的香氣成分種類最少，CXZ波特酒的香氣成分種類最多。XDL波特酒酯類和醇類物質種類較多，是構成波特酒整體香氣的主要部分。揮發(fā)性風味成分檢測結果表明，XDL波特酒較好。

2.2.3 添加不同品種葡萄蒸餾酒的波特酒共有揮發(fā)性香氣成分主成分分析

對3種添加不同品種葡萄蒸餾酒中止酒精發(fā)酵的波特酒共有的34種揮發(fā)性香氣成分進行主成分分析，大量原始信息被降為2個主成分，分別占總體方差貢獻率的62.35%和37.65%，累積方差貢獻率為100%，表明前2個主成分在波特酒品質指標評價中起主導作用，且能全面反映波特酒品質特性綜合評價的主要信息。各指標在2個主成分上的載荷圖見圖2。由圖2可知，WHB、XDL、CXZ波特酒中共有的34種香氣化合物在PC1正半軸和負半軸均有聚集分布，但整體分布較為散亂，說明WHB、XDL、CXZ的香氣品質存在差異。PC1主要與乙酸、乙酸異戊酯、正己酸乙酯、苯甲醇、苯甲醛、乙酸乙酯呈正相關，PC2主要與正丁醇、月桂酸乙酯呈正相關。不同品種的葡萄蒸餾酒終止發(fā)酵的波特酒產生的香氣存在差異，但不同品種的葡萄蒸餾酒與這些揮發(fā)性物質的關系有待進一步研究。

圖2 3種黑果腺肋花楸赤霞珠波特酒樣中共有香氣成分的主成分分析載荷圖Fig.2 Loading diagram of principal component analysis of common aroma components in 3 kinds of Aronia melanocarpa and Cabernet Sauvignon port wine samples

2.2.4 添加不同品種葡萄蒸餾酒的波特酒6類揮發(fā)性香氣成分主成分分析

由于僅對共有的34種共有成分進行主成分分析得到的結果不夠突出，將檢測到的68種揮發(fā)性成分分為醇類、酯類、酸類、酮類、醛類、其他6個香氣類型，對波特酒中各類揮發(fā)性香氣化合物進行主成分分析，并參考了宋晶晶等[37]的主成分建模方法，計算波特酒的綜合得分。將3款酒6個香氣類型所占相對含量數(shù)據(jù)標準化后，用SPSS 19.0進行主成分分析，得到主成分特征值及特征向量，結果分別見表3、表4。

表3 3種黑果腺肋花楸赤霞珠波特酒酒樣中6類揮發(fā)性香氣成分的特征值及方差貢獻率Table 3 Characteristics value and variance contribution rate of 6 types of volatile aroma components in 3 kinds of Aronia melanocarpa and Cabernet Sauvignon port wine samples

表4 主成分因子載荷矩陣與特征向量Table 4 Loading matrix and feature vector of principal components factor

由表3和表4可知，其中PC1可以解釋62.51%的方差，PC2可以解釋37.49%的方差，二者累積方差貢獻率為100%，表明這兩個主成分可代表黑果腺肋花楸赤霞珠波特酒揮發(fā)性風味的主要特征。

第1主成分與醇類、醛類呈正相關，與酯類物質呈負相關，代表以醇香、果香、玫瑰花、堅果的香氣為主，主要源于葡萄蒸餾酒的香氣[38]；第2主成分與酮類、酸類呈正相關，代表以發(fā)酵中產生的奶酪、奶油氣味為主。PC1能反映大部分香氣成分信息，影響其化合物并作為主要風味化合物，因此醇類和醛類是添加不同品種葡萄蒸餾酒的黑果腺肋花楸赤霞珠波特酒香氣差異化的主要影響因素，賦予了波特酒花香、水果、杏仁的香味。

根據(jù)表3、表4，將2個主成分代表原來的6種揮發(fā)性成分表達的信息，根據(jù)2個主成分的特征向量，利用Y1、Y2作為新的綜合指標代替原有的6類揮發(fā)性成分建立不同波特酒風味品質評價模型，進行揮發(fā)性香氣物質的綜合評價，得出波特酒揮發(fā)性香氣成分的線性關系式，式中ZX1～ZX6為3款波特酒的酯類物質、醇類物質、酸類物質、醛類物質、酮類物質、其他物質的相對含量在SPSS軟件中進行標準化后的值，Y1、Y2表示2個主成分的得分分值，分值越大表示波特酒風味品質越好。得到WHB、XDL、CXZ波特酒的香氣化合物線性關系方程式：

根據(jù)2個主成分的得分函數(shù)Y1、Y2以及表3中所對應的2個主成分各自的方差貢獻率做內積可以計算出添加3款不同品種葡萄蒸餾的波特酒的綜合風味品質的評價函數(shù)Y，并根據(jù)主成分1、主成分2的方差貢獻率占比賦予權重，其表達式為：Y=0.625Y1+0.375Y2，結果見表5。

表5 3種黑果腺肋花楸赤霞珠波特酒揮發(fā)性香氣主成分綜合得分Table 5 Comprehensive scores of volatile aroma principal components of 3 kinds of Aronia melanocarpa and Cabernet Sauvignon port wine

由表5可知，第1主成分、第2主成分綜合風味品質得分最高的均是CXZ波特酒。在香氣成分評價模型中，CXZ波特酒得分最高為1.60，只有這款酒的綜合得分＞0，說明這款酒的整體香氣質量在3種波特酒的平均水平之上，相比之下，CXZ波特酒的香氣品質更突出，其次為XDL波特酒、WHB波特酒。

3 結論

采用HS-SPME-GC×GC-TOF-MS對3種添加不同品種葡萄蒸餾酒的黑果腺肋花楸波特酒的揮發(fā)性香氣成分進行檢測，共得到68種揮發(fā)性成分，其中包括酯類25種、醇類21種、酸類7種、酮類6種、醛類4種、其他類5種。其中添加無核白、霞多麗、赤霞珠蒸餾酒的波特酒分別共檢出50種、49種、51種香氣成分。采用主成分分析法分別對3種添加不同品種葡萄蒸餾酒的波特酒共有的34種香氣成分和6類香氣化合物進行分析，并建立了香氣成分質量評價模型。結果表明，醇類和醛類物質是影響添加不同品種葡萄蒸餾酒的黑果腺肋花楸波特酒的主要因素。經過模型計算，綜合得分排序為添加赤霞珠蒸餾酒的波特酒＞添加霞多麗蒸餾酒的波特酒＞添加無核白蒸餾酒的波特酒。因此添加赤霞珠蒸餾酒的黑果腺肋花楸赤霞珠波特酒揮發(fā)性香氣物質最豐富，品質最佳。