何鵬搏,李詠梅*,朱自萍,何鵬飛,何月秋,吳毅歆,蔡永占,符宗偉,Munir Shahzad,王軍偉,田陽陽,王云月**
(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué),云南 昆明 650201;2.云南省煙草公司 曲靖市公司,云南 曲靖 655000;3.紅塔煙草(集團)有限責(zé)任公司,云南 玉溪 653100)
煙曲霉(Aspergillus fumigatus)在自然界普遍分布,廣泛存在于海洋[1]和土壤,營腐生生活[2],是土壤中優(yōu)勢真菌之一[3],其還可以在植物中內(nèi)生[4],如在白三葉草[5]、蒜頭果[6]、紅茄莓[7]和霸王鞭[8]中內(nèi)生。它對農(nóng)藥殘留、廢棄農(nóng)用薄膜、蒽污染和農(nóng)作物秸稈都有很好的降解作用[9]。然而,煙曲霉又是一種機會致病菌,它在人畜身體較弱時,也會引起疾病[10],如它會引起肺曲霉菌?。?1],導(dǎo)致患者死亡[12-13],引起角膜炎[14]等。該菌耐高溫,能在55 ℃下生長[15],在倉貯中易引起煙草霉變[16],造成重大損失。為了給煙草霉?fàn)€病防控、人畜疾病控制及為有機肥發(fā)酵提供科學(xué)依據(jù),本文開展了煙曲霉菌耐高溫能力和引起霉?fàn)€病溫度研究。
煙草品種為云煙 105,取其中下部葉柄供接種試驗。煙曲霉菌Q-1 (Aspergillus fumigatusQ-1,下稱Q-1)為本實驗室于2018年8月分離自云南省宣威市格宜鎮(zhèn)宜興烤煙合作社烤房煙草霉?fàn)€病樣本,且已被證明它是烘烤期煙葉霉?fàn)€病菌之一。
1.2.1 常壓下耐熱性試驗
1.2.1.1 菌絲體耐熱性 將在PDA上培養(yǎng)好的Q-1,用0.3 cm打孔器打成菌餅,分別置于裝有100 μL的滅菌水和空的PCR管內(nèi),將PCR管放入PCR儀(型號L96+,杭州朗基科學(xué)儀器有限公司)中檢測菌體的耐熱性。溫度設(shè)置為40~95 ℃,以5 ℃為1節(jié)點,共12個溫度節(jié)點,加熱5 min和10 min,每個節(jié)點6次重復(fù)。處理過的菌餅加入適量的滅菌水,混勻后,涂布于PDA板上,于37 ℃下黑暗培養(yǎng)48 h后統(tǒng)計菌落數(shù),統(tǒng)計存活率。
1.2.1.2 孢子耐熱性 分生孢子耐熱性分:(1)在空氣中耐熱性:取Q-1的分生孢子1 mg,加入PCR管中,于PCR儀中60~90 ℃處理10 min。(2)在水相中耐熱性:將100 μL的1.5×106CFU/mL孢子液裝入PCR管內(nèi),于PCR儀中50~95 ℃處理5 min和10 min。2種試驗后,PCR管中均加滅菌水稀釋,再涂于PDA板上,于37 ℃下黑暗培養(yǎng)48 h后統(tǒng)計菌落數(shù),統(tǒng)計存活率。以上各處理均重復(fù)6次。
1.2.2 在加壓下的耐熱性試驗 將在PDA上培養(yǎng)好的Q-1孢子用滅菌水洗下,混入121 ℃下間歇滅菌40 min和未滅過菌的2種煙草地土壤中,分成1 g裝入試管,置于滅菌鍋(型號LDZX-75KBX,上海申安醫(yī)療器械廠)中,121 ℃、0.105 MPa下滅菌20、30、35、40、45和50 min,10倍稀釋后涂板于加有10 μg/mL的氯霉素(排除細菌的干擾)PSA平板上,置于37 ℃溫箱中培養(yǎng)48 h,計數(shù)煙曲霉菌落數(shù)。以常溫不滅菌處理為對照。各處理重復(fù)3次,每重復(fù)包括4個培養(yǎng)皿的平均菌落數(shù),計算存活率。
取新鮮的煙草葉柄,各切成長約1 cm的組織塊,置于直徑6 cm的培養(yǎng)皿中,每皿3段。培養(yǎng)皿墊有吸水紙,每皿加7 mL滅菌水保濕。接種Q-1的1.5×107CFU/mL孢子懸浮液100 μL于兩端切口處,再分別置于50、60、65、70、80、90和95 ℃的培養(yǎng)箱中處理10 min后,取出后置于37 ℃保濕4 d,取出觀察發(fā)病情況。各處理均重復(fù)3次。
2.1.1 在培養(yǎng)基上的耐熱性 將Q-1菌餅分別放入有滅菌水和無滅菌水的PCR管中,于PCR儀上40~95 ℃溫度下加熱5 min和10 min,再放入PDA平板上培養(yǎng),結(jié)果見表1。Q-1在40~95 ℃溫度范圍內(nèi),2種時間段分別處理后,再轉(zhuǎn)入37 ℃下培養(yǎng),所有處理和重復(fù)的菌餅均長出菌絲和分生孢子,即在95 ℃時,菌餅上的Q-1仍保存著生命力。
表1 煙曲霉Q-1菌絲體在有水和無水PCR管中的耐熱性
2.2.1 分生孢子在空氣中的耐熱性 將煙曲霉Q-1分生孢子直接放入離心管中,置于PCR儀中60~90 ℃加熱處理10 min后,涂布于平板培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)其仍能長出菌落,表明煙曲霉Q-1分生孢子在60~90 ℃下10 min仍能存活,但存活率隨著溫度升高而下降,至80 ℃和90 ℃時,存活率僅分別0.14%和0.04%(表2)。
表2 煙曲霉Q-1孢子在不同溫度下處理10 min的 存活情況
2.2.2 分生孢子在水相中的耐熱性 將煙曲霉Q-1分生孢子制作成懸浮液,置于50~95 ℃分別處理5、10 min,培養(yǎng)48 h后,結(jié)果見表3。Q-1在70 ℃及以上溫度處理時,均未長出菌落;處理5 min時,在68 ℃處理溫度中,孢子存活率僅為6.25×10-6%;在65 ℃處理溫度中,孢子存活率為 8.75×10-4%;在60 ℃處理溫度中,仍有2.69%孢子存活。處理10 min時,在68 ℃處理溫度中,無孢子存活;在65℃處理溫度中,孢子存活率為1.25×10-4%;在60 ℃處理溫度中,有0.29%孢子存活;在50 ℃處理溫度中,有63.67%孢子存活。即隨著溫度升高和處理時間的延長,Q-1分生孢子在水相中存活力下降,其最高耐熱率的培養(yǎng)溫度和時間分別為68 ℃、5 min。
表3 煙曲霉Q-1孢子液在不同溫度下的存活情況
在121 ℃溫度和0.105 MPa大氣壓下,滅菌與未滅菌土壤加入煙曲霉孢子液經(jīng)幾種滅菌時間處理后,煙曲霉的分生孢子死亡率都達100%。即煙曲霉雖然能耐高溫,但是在121 ℃高溫和0.105 MPa大氣壓下滅菌20 min及以上都不能存活。
將Q-1分生孢子懸浮液接種到煙草葉柄切口處,分別置于50~95 ℃的培養(yǎng)箱中處理10 min,培養(yǎng)4 d后葉柄處產(chǎn)生霉?fàn)€病癥狀結(jié)果見表4。接種煙草葉柄在涂布經(jīng)80、90、95 ℃處理10 min的孢子懸浮液后未發(fā)病,而涂布經(jīng)50、60、70 ℃處理的孢子懸浮液后均發(fā)生典型霉?fàn)€病,表明煙曲霉在50~70 ℃的煙草葉柄上仍能存活,孢子具有萌發(fā)和侵染能力。
表4 煙曲霉Q-1孢子液在煙草葉柄上于不同溫度處理10 min的發(fā)病情況
煙草霉?fàn)€病多發(fā)于烘烤過程中的高溫高濕期,即變黃期和定色期,且在通風(fēng)條件不好、密閉的烤房霉?fàn)€病愈發(fā)嚴重。有研究表明煙曲霉亦是烘烤期煙葉霉?fàn)€病病原之一。本研究結(jié)果表明煙曲霉在較高溫度下仍能較好地存活,即使達95 ℃時,菌絲體和孢子仍能存活。總體來說,分生孢子耐受高溫的能力弱于菌絲體,如以菌絲塊置于氣相和水相中,即使95 ℃處理10 min,在37 ℃下培養(yǎng)還能長出菌落,但將純孢子置于水相中68 ℃以上,處理10 min后孢子就不能萌發(fā)。在空氣中,分生孢子即使在80 ℃和90 ℃時,處理10 min后孢子存活率分別達0.14%和0.04%。然而,即使在80 ℃以上孢子存活率較低,但其對于產(chǎn)孢子量大的煙曲霉來說,其侵染潛力仍不可小覷。當(dāng)把孢子液接種到煙葉柄切口處,放置于50~70 ℃溫度下處理10 min,再轉(zhuǎn)到37 ℃下,煙葉柄仍能出現(xiàn)典型的煙曲霉霉?fàn)€病。
張晉卿等[18]采用酵母浸膏培養(yǎng)基研究證明煙曲霉最適宜生長溫度為37 ℃,最高生長溫度為52 ℃;65 ℃處理180 min或70 ℃處理120 min均能使煙曲霉完全失活。但本研究采用水相下處理,在68 ℃下處理10 min后,孢子全部死亡;在空氣中于60 ℃和90 ℃下處理10 min,孢子存活率仍達86.20%和0.04%,而菌絲體在95 ℃下處理10 min仍能存活。上述結(jié)果表明煙曲霉的耐熱性很強,但筆者與張晉卿等的結(jié)論差異可能來自不同菌株及試驗方法的不同所致。
由于煙曲霉是實驗室操作中會經(jīng)常引起污染,本研究證明它不能耐受在121 ℃和0.105 MPa下的滅菌處理,從而證明實驗室出現(xiàn)煙曲霉污染是來自不嚴格的無菌操作所致,而不是其耐高溫的緣故。
農(nóng)作物附產(chǎn)品是農(nóng)田有機質(zhì)重要來源,為了加速該類有機質(zhì)原料的腐熟,添加腐熟菌種是最常見的方法。然而,大多數(shù)有機肥發(fā)酵的溫度都不會超過72 ℃,溫度過高引起發(fā)酵菌功能下降,會延長發(fā)酵周期。本研究證明煙曲霉菌絲在氣相下于70 ℃中仍能存活,在70 ℃下處理10 min,分生孢子仍然不失侵染煙草葉柄引起霉?fàn)€病的能力,展現(xiàn)了其用于發(fā)酵農(nóng)業(yè)有機廢棄物的潛力。